N. patriciarum J11 纖維素分解酶複合體組成蛋白質鑑定

本研究探討N. patriciarum J11於結晶性纖為碳源培養時，其誘導生成之 cellulosome組成份的差異性，進而鑑定主要組成酵素以供未來相關研究應用。 小於5% (p<0.05)。編號P4、P5、P7、P8、P10及P11 組成份可比對到GH5、GH6和 GH48糖苷水解酶，此三類亦是厭氣性真菌來源之cellulase主要的類型。比對結果顯 示，編號P4和P5與N. patriciarum CelD及N. frontalis cellulase具同源性;而P7及P8 則 與 P. equi Cel48A及Piromyces sp. E2 Cel48A具同源性。然而， P10和P11雖與 Orpinomyces sp. PC-2 CelH皆具同源性，但其可能因為不同的轉譯後修篩或互為異 構酶而造成其在分子量上有所差異。P1、P2、P3、P6、P9及P12在資料庫中無法比 對到胜肽圖譜。因此，後續以蛋白質N端定序方式獲得N端部分序列再經genome walking方法求其部分DNA序列作為鑑定依據。本研究另將以這些GenBank已知之 序列設計引子並從N. patriciarum J11基因組及cDNA中擴增並轉殖這些序列以做為 未來開發應用之基礎。

(2) 蛋白質胺基端定序

將轉印至 PVDF 膜上編號 P1、P3、P6、P12 的蛋白質進行 N 端定序，所得結 果整理如表 3-4。目前所得之結果，胜肽長度為 4 至 9 個胺基酸，然而 P2 與 P9 在 圖譜中因蛋白質量比例過低且與 P1、P3 又 P10 鄰近，因此在轉印過程無法得到高 純度之 P2 與 P9 而且也無法達到符合 N 端定序所要求之蛋白質量，故暫無法進行 N 端定序實驗。經資料庫比對結果，3 條胜肽無法對應到目前已知的相關蛋白質序 列。此結果可能表示，這 3 個蛋白質可能是未被發表的基因產物，但此仍需經後續 部分序列的選殖定序才能確定。P6 蛋白質 N 端定序結果，其 7 個胺基酸胜肽符合 GH 38 family 中的 alpha-mannosidase，此酵素主要是參與甘露聚醣(mannon)的分解。

由於轉印至膜上之蛋白質量無法準確推算，因此易造成樣品量偏低而無法在定序時 有效延續循環反應。另外，在 N 端或其附近的胺基酸可能因不同修飾基團的障礙 而阻斷反應進行，因此常造成所胜肽過短或無法進行 N 端定序。

圖 3- 12 纖維素分解酶複合體組成分鑑定圖譜

A: Avicel; X:木聚醣; R:稻桿。N/A:未比對到之蛋白質。

Figure 3-12 Candidates of cellulosomal enzymes for protein identification.

A: Avicel, X: xylan, R: rice straw. N/A, non available protein.

表 3- 3 纖維素分解酶複合體組成分之蛋白質鑑定

Table 3-2 Protein identifications of cellulosomal compositions.

Protein name

Significant protein score

Sequence

coverage Significant protein name Modular architecture^a Mode of action P1 48 0% gi|145602830 hypothetical protein MGG_13754

Magnaporthe oryzae 70-15 - -

P2 N/A - - - -

P3 48 0% gi|145602830 hypothetical protein MGG_13754

Magnaporthe oryzae 70-15 - -

P4 428 13% gi|2981484 cellulase CelD, Neocallimastix patriciarum GH5-GH5-GH5-Doc-Doc endotype P5 77 3% gi|3712668 cellulase, Neocallimastix frontalis GH5-Doc-Doc endotype

P6 N/A - - - -

P7 136 3% gi|25990957 cellulase Cel48A precursor, Piromyces equi GH48-Doc-Doc

exotype (reducing end)

P8 108 5% gi|25990955 cellulase Cel48A precursor, Piromyces sp. E2 GH48-Doc-Doc

exotype (reducing end)

a The modular architectures were predicted by the Conserved Domain Database (CDD) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). GH, glycosyl hydrolase family; Doc, fungal dockin.

Protein name

Significant protein score

Sequence

coverage Significant protein name Modular architecture^a Mode of action

P9 N/A - - - -

P10 155 7% gi|15529294 cellobiohydrolase II-like cellulase CelH,

Orpinomyces sp. PC-2 Doc-Doc-GH6

exotype

(nonreducing end)

P11 93 4% gi|15529294 cellobiohydrolase II-like cellulase CelH,

Orpinomyces sp. PC-2 Doc-Doc-GH6

exotype

(nonreducing end)

表 3- 4 纖維素分解酶複合體組成分之蛋白質胺基端定序 Table 3-4 N-terminal sequencing of cellulosomal compositions.

Protein name Peptide sequence P 1 S-L-F-V

P 3 【G, T】-K-E-Y-F-P

P 6 S-A-D-D-Y-A-【Q, N】-R-A P 12 D-P-Y-Q-I-K

(3) N. patriciarum J11 cellulosome 組成份基因選殖

本實驗以蛋白質鑑定結果所得之序列為依據，自GenBank資料庫比對序列並且 設計專一性引子自cDNA及genome中擴增、選殖出三條cellulase基因，分別為J11 Cel5A、

J11 Cel48A及J11 Cel6C。此三條基因之胺基酸序列與GenBank資料庫已發表序列比對 分別如圖3-13、3-14及3-15所示。J11 Cel5A與基因資料庫中N. patriciarum CelD (AAC06321)之胺基酸序列有100%相同度(identity)(141)。J11 Cel48A與基因資料庫中 Piromyces sp. E2 Cel48A (AAN76734)之胺基酸序列有80.8%相同度(121)。J11 Cel6C與 基因資料庫中Orpinomyces sp. PC-2 CelH (AAL01211)之胺基酸序列有93.6%相同度 (122)。由於此三條cellulase結構組成上皆具一催化區及錨固區，因此再確認了此三條 cellulase為N. patriciarum J11 cellulosome之組成份。

圖 3-13 J11 Cel5A 與 N. patriciarum CelD 胺基酸序列比對。

綠色框線為催化區，棕色框線為錨固區。

Figure 3-13 The alignment of the amino acid sequences of J11 Cel5A and N. patriciarum CelD. The conserved residues are shaded, and the catalytic domain and the dockering domain are boxed with green line and brown line, respectively.

圖 3-14 J11 Cel48A 與 Piromyces sp. E2 Cel48A 胺基酸序列比對。

綠色框線為催化區，棕色框線為錨固區。

Figure 3-14 The alignment of the amino acid sequences of J11 Cel48A and Piromyces sp.

E2 Cel48A. The conserved residues are shaded, and the catalytic domain and the dockering domain are boxed with green line and brown line, respectively.

圖 3-15 J11 Cel6C 與 Piromyces sp. PC-2 CelH 胺基酸序列比對。

綠色框線為催化區，棕色框線為錨固區。

Figure 3-15 The alignment of the amino acid sequences of J11 Cel6C and Piromyces sp.

PC-2 CelH. The conserved residues are shaded, and the catalytic domain and the dockering domain are boxed with green line and brown line, respectively.