第三章 茶樹精油之抗痤瘡療效評估
第二節 茶樹精油作用之實證醫學探討
二、 茶樹精油作用之實證醫學探討結果
經過系統性文獻回顧有關茶樹精油用於痤瘡治療之相關臨床試 驗 (clinical trials)文章共兩篇，Jadad score分別為 2 分及 1 分，如表十 所示。
Enshaieh等人的研究經過 45 天的觀察，研究對象每 15 天回診一 次後，指出 5 %茶樹精油之組別降低痤瘡嚴重指數及病灶總數 (黑頭 粉刺、白頭粉刺、丘疹及結節等)都較安慰組來得高，分別為 5.75 倍 及 3.55 倍。而Bassett等人所做的單盲試驗則指出，5 %茶樹精油較 5 % benzoyl peroxide lotion有較低之不良反應發生率，兩者對發炎及未發 炎痤瘡病灶 (白頭粉刺、黑頭粉刺)都有顯著治療效果，但是茶樹精油 發生作用時間較 5 % benzoyl peroxide lotion來得慢154。
表十、茶樹精油用於痤瘡治療之文獻摘要及Jadad評分
Reference Enshaieh S, Jooya A, Siadat AH, Iraji F. (2007)161
Bassett IB, Pannowitz DL, Barnetson RS. (1990)154 Study Design RCT, (double-blind
placebo-controlled study)
Single-blind, randomised clinical trial
Sample size N=60 N=124
Type of Intervention
Total lesion count (TLC) Acne severity index (ASI) Efficacy on comedones number (CN)
Efficacy on papules number (PPN) Efficacy on pustules number (PUN)
Reducing the number of inflamed and non-inflamed lesions (open and closed comedones)
Results/
Conclusion
5 % TTO之降低ASI及TLC分別 為安慰組之 5.75 及 3.55 倍
實驗組為 5 % TTO；對照組為 5 % benzoyl peroxide lotion
Adverse effect
5 %TTO: 10 % minimal pruritus, 3.33 % little burning sensation, 3.33 % minimal scaling; Placebo:
6.66 % minimal pruritus, 6.66 % little burning sensation.
實驗組較對照組少
Jadad score 2 1
2. 茶樹精油用於痤瘡治療之基礎研究文獻回顧
相似。廣泛範圍的細菌及其對茶樹精油的感受性曾被測試，有些已 發表的感受性資料整理在表十一。金黃色葡萄球菌MIC為0.5~1.25
%，MBC為1~2 %；表皮葡萄球菌MIC為0.45~1.25 %，MBC為4 %；
痤瘡桿菌MIC為0.05~0.63 %，MBC為0.5 %；Malassezia furfur之MIC 為0.03~0.12 %，MBC為0.5~1.0 %。一般而言其對厭氧性桿菌有較佳 之抗菌效果，如：中間普氏菌 (Prevotella intermedia)之MIC及MBC 均為0.003~0.1 %。大多數細菌對茶樹精油之感受性在1.0 %或更低的 濃度，曾被報告過的如皮膚共生菌葡萄球菌(Staphylococci)、微球菌 (Micrococci) 、 糞 腸 球 菌 (Enterococcus faecalis) 及 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa)等其最小抑菌濃度均大於2 %。茶樹精油本 質上絕大部分是殺菌劑，雖然其在低濃度時可能是抑菌。
早在1925年Penfold就針對澳洲茶樹及狹葉白千層研究，並以酚 係數 (RW coefficient)指出Terpinen-4-ol與α-terpineol為主要活性成分
162。時至今日有許多研究者以MICs及MBCs或MFCs，確認此兩化合 化在此濃度或稍低之濃度有抗菌及抗黴活性163-168。但α-terpineol在茶 樹 精 油 中 所 佔 濃 度 並 不 高 (ISO 4730 規 範 1.5-8 %) 。 α-Pinene, β-pinene與linalool均有類似之MICs，但它們在茶樹精油中之含量亦 不高166, 169。
Nelson於體外的短期實驗發現金黃色葡萄球菌對茶樹精油有抗 藥性，其中有三株金黃色葡萄球菌在MICs為1 %時，另一株則在2 % 及16 %之MICs170。Gustafson等另發現有多重抗藥性 (Mar mutants)之
E. coli對茶樹精油之感受性亦降低
171。Davis等亦發現家庭清潔者茶 樹精油及α-terpineol對金黃葡萄球菌之感受性亦輕微降低172。對S.aureus, C. albicans, C. glabrata, P. aeruginosa與Enterococcus faecium
有 抗 藥 性 之 菌 株 對 茶 樹 精 油 體 外 亦 有 感 受 性 (withoutcross-resistance)。
(2)茶樹精油之抗真菌活性
痤瘡的病源菌之一Malassezia furfur就是真菌，除此之外茶樹精油 亦對白色念珠菌有效，其MIC及MBC分別為0.06-8與0.12-1；茶樹精 油之抗真菌活性文獻摘要如表十二。
(3)茶樹精油之抗病毒活性
菸草鑲嵌病毒 (Tobacco mosaic virus in tobacco plant)以100, 250 及500 ppm之茶樹精油灑在感染菸草鑲嵌病毒10天後與控制組相較，
植物葉片每平方公分有較少之損傷 173。
Herpes simplex virus (HSV)以茶樹精油及eucalyptus oil實驗對 HSV之抑制濃度。4天後茶樹精油與控制組相較，分別以0.0009 %及 0.0008 % 抑 制 HSV-1 及 HSV-2 百 分 之 五 十 斑 塊 形 成 (plaque formation) 。以0.003 %之較高的濃度可分別降低HSV-1及HSV-2之 病毒量達98.2 %及93.0 %174。
Minami在2003年也以茶樹精油針對綠猴腎細胞 (Vero cell)之 HSV-1活性做研究，發現0.1 % 茶樹精油可抑制10 %斑塊形成，1 % 則可完全抑制175。
(4)茶樹精油之抗原蟲活性
Mikus等人以茶樹精油分別在403 mg/ml及0.5 mg/ml降低利什曼 原蟲 (Leishmania major)與羅得西亞錐蟲 (Trypanosoma brucei) 50 % 生長，其抗原蟲活性成分為terpinen-4-ol176。
Viollon等人則研究顯示茶樹精油在300 mg/ml濃度時可殺死陰道 滴蟲(Trichomonas vaginalis)之所有細胞。Pena在1962年就曾以體內 試驗證實177。
(5)茶樹精油之抗發炎反應
林佩儒曾進行精油之抗發炎活性評估，茶樹精油及其水溶性成分 均可明顯抑制由LPS 誘導THP-1細胞分泌產生的TNF-α量178。
(6)結論
茶樹精油之抗痤瘡作用來自於其對毛囊狀態失衡後，大量孳生之 四 種 主 要 痤 瘡 病 源 細 菌 (Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Propionibacterium acnes)、真菌 (Malassezia furfur)都有抗
菌作用，而達成降低毛囊內細菌數量之目的，進而能使痤瘡病灶儘速 恢復正常。單萜類化合物結構式之官能基會影響抗菌活性，一般而 言，抗菌強弱依次是酚類 > 醛類 > 酮類 > 醇類 > 醚類 >碳氫化合 物。醇類架構成分如terpinen-4-ol及terpineol可造成菌之蛋白質變性、破壞細胞膜及溶解脂質。
茶樹精油於體外試驗對發炎之相關介質如COX-2、PGE、TNF-α、 ROS及histamine diphosphate都有抑制作用。Graham等人於2004年研究 指出痤瘡桿菌會使角質細胞產生IL-1α、TNF-α和GM-CSF，且會活化 CD4+ T淋巴球，而導致毛囊發炎。茶樹精油也存在著抑制TNF-α產生 的活性，而達到抗發炎的作用，因此可推論茶樹精油對於發炎性痤瘡 病灶，能藉由減少TNF-α等發炎介質的產生，而降低發炎反應，因此 有治療痤瘡的功效。體表之角質細胞屏障若遭破壞將會產生發
表十一、茶樹精油之抗細菌活性
% (vol/vol) Bacterial species
MIC MBC Reference(s)
Acinetobacter baumannii 1 1 Hammer KA, 1996
Actinomyces viscosus 0.6 > 0.6 Shapiro S, 1994
Actinomyces spp. 1 1 Hammer KA, 2003
Bacillus cereus 0.3 Griffin SG, 2000
Bacteroides spp. 0.06-0.5 0.06-0.12 Hammer KA, 1999
Corynebacterium sp. 0.2-2 2 Christoph F, 2000; Griffin SG, 2000; Hammer KA, 1996 Enterococcus faecalis 0.5->8 >8 Banes-Marshall L, 2001; Griffin SG, 2000
E. faecium (vancomycin
resistant) 0.5-1 0.5-1 Nelson RRS, 1997
Escherichia coli 0.08-2 0.25-4 Banes-Marshall L, 2001; Carson CF, 1995; Gustafson JE, 1998; Mann CM, 1998 Fusobacterium nucleatum 0.6->0.6 0.25 Shapiro S, 1994; Takarada K, 2005
Klebsiella pneumoniae 0.25-0.3 0.25 Griffin SG, 2000; Hammer KA, 1996
Lactobacillus spp. 1-2 2 Hammer KA, 1999; Hammer KA, 2003
Micrococcus luterus 0.06-0.5 0.25-6 Hammer KA, 1996 Peptostreptococcus
anaerobius 0.2-0.25 0.03->0.6 Hammer KA, 1999; Shapiro S, 1994 Porphyromonas
endodentalis 0.025-0.1 0.025-0.1 Hammer KA, 2003
P. gingivalis 0.11-0.25 0.13->0.6 Shapiro S, 1994; Takarada K, 2005
Prevotella spp. 0.03-0.25 0.03 Hammer KA, 1999
Prevotella intermedia 0.003-0.1 0.003-0.1 Hammer KA, 2003
Propionibacterium acnes 0.05-0.63 0.5 Carson CF, 1994; Griffin SG, 2000; Raman A, 1995
Proteus vulgaris 0.08-2 4 Banes-Marshall L, 2001; Christoph F, 2000; Griffin SG, 2000; Mann CM, 1998 Pseudomonas aeruginosa 1-8 2->8 Banes-Marshall L, 2001; Griffin SG, 2000; Hammer KA, 1996
Staphylococcus aureus 0.5-1.25 1-2 Banes-Marshall L, 2001; Carson CF, 1995; Raman A, 1995 S. aureus (methicillin
resistant) 0.04-0.35 0.5 Carson CF, 1995; Christoph F, 2000; Mann CM, 1998; Nelson RRS, 1997 S. epidermidis 0.45-1.25 4 Christoph F, 2000; Hammer KA, 1996; Raman A, 1995
S. hominis 0.5 4 Hammer KA, 1996
Streptococcus pyogenes 0.12-2 0.25-4 Banes-Marshall L, 2001; Carosn CF, 1996 Veillonella spp. 0.016-1 0.03-1 Hammer KA, 2003
表十二、茶樹精油之抗真菌活性
% (vol/vol) Fungal species
MIC MBC Reference(s)
Alternaria spp. 0.016-0.12 0.06-2 Hammer KA, 2002
Aspergillus flavus 0.31-0.7 2-4 Griffin SG, 2000; Hammer KA, 2002; Nenoff P, 1996; Shin S, 2003
A. fumigatus 0.06-2 1-2 Hammer KA, 2002; Vazquez JA, 2000
A. niger 0.016-0.4 2-8 Beylier MF, 1979; Griffin SG, 2000; Hammer KA, 2002 Blastoschizomyces
capitatus 0.25 Oliva B, 2003
Candida albicans 0.06-8 0.12-1 Banes-Marshall L, 2001; Christoph F, 2000; D'Auria FD, 2001; Ergin A, 2002; Hammer KA, 1998; Mondello F, 2003; Nenoff P, 1996; Oliva B, 2003; Vazquez JA, 2000
C. glabrata 0.03-8 0.12-0.5 Banes-Marshall L, 2001; D'Auria FD, 2001; Ergin A, 2002; Hammer KA, 1998; Mondello F, 2003; Oliva B, 2003; Vazquez JA, 2000
C. parapsilosis 0.03-0.5 0.12-0.5 D'Auria FD, 2001; Hammer KA, 1998; Mondello F, 2003; Oliva B, 2003 C. tropicalis 0.12-2 0.25-0.5 D'Auria FD, 2001; Ergin A, 2002; Vazquez JA, 2000
Cladosporium spp. 0.008-0.12 0.12-4 Hammer KA, 2002 Cryptococcus neoformans 0.015-0.06 Mondello F, 2003 Epidermophyton
flocossum 0.008-0.7 0.12-0.25 Christoph F, 2000; Hammer KA, 2002
Fusarium spp. 0.008-0.25 0.25-2 Hammer KA, 2002
Malassezia furfur 0.03-0.12 0.5-1.0 Hammer KA, 2000 M. sympodialis 0.016-0.12 0.06-0.12 Hammer KA, 2000
Microsporum canis 0.03-0.5 0.25-0.5 D'Auria FD, 2001; Hammer KA, 2002; Nenoff P, 1996
M. gypseum 0.016-0.25 0.25-0.5 D'Auria FD, 2001
Penicillium spp. 0.03-0.06 0.5-2 Hammer KA, 2002
Rhodotorula rubra 0.06 0.5 Hammer KA, 2003
Saccharomyces cerevisiae 0.25 0.5 Hammer KA, 2003 Trichophyton
mentagrophytes 0.11-0.44 0.25-0.5 D'Auria FD, 2001; Griffin SG, 2000; Nenoff P, 1996
T. rubrum 0.03-0.6 0.25-1 Christoph F, 2000; D'Auria FD, 2001; Hammer KA, 2002; Nenoff P, 1996 T. tonsurans 0.004-0.016 0.12-0.5 Hammer KA, 2002
Trichosporon spp. 0.12-0.22 0.12 Hammer KA, 2003; Nenoff P, 1996
第三節 實驗部份 一、實驗材料 1. 試驗菌株
本 實 驗 所 用 之 菌 株 為 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus BCRC 10781, ATCC 25923)，購自財團法人食品工業發展研究所生物 資源保存及研究中心。
2. 試藥
Tryptic soy broth (TSB)及tryptic soy agar (TSA)均購自Difco公 司 ， terpinen-4-ol, 1,8-cineole (eucalyptol), terpinolene, γ-terpinene, limonene, aromadendrene, p-cymene, α-terpinene, sabinene hydrate, globulol為購自Fluka公司，α-terpineol購自Extrasynthese公司，α-pinene 購自Aldrich公司。
3. 人工配方茶樹精油
因為茶樹精油存在著主成分的差異，且其成分間又有不同抑菌活 性之差異，因此激起我們藉由調整、提高抑制金黃色葡萄球菌作用較 強之成分比率，觀察是否有著更理想之抗菌活性。表十三之DF1 及 DF2 是茶樹精油對抑制金黃色葡萄球菌有效的不同組成，各成分總和 分別為 88 %及 85 %，另外加入 12 %及 15 %之荷荷芭油。
4. 儀器設備
恆溫震盪培養箱（Firstek）、水浴鍋 (Cherng Huei WDG-11)、電 子分析天平 (AND HR-200)、高壓滅菌鍋 (Tomin)、自動乾燥機 (永 億)、落地型高速冷凍離心機(Kubota 1720)。
二、實驗方法
1. 培養液及培養基之製備
金黃色葡萄球菌以tryptic soy broth (TSB) (Difco, Sparks, MD,
USA)培養，取 30 g之TSB溶於 1000 ml之去離子水中，加熱攪拌至完 全溶解後，置於高壓滅菌鍋中以溫度 121℃，壓力 1.2 kg/cm2下滅菌 30 分鐘，冷卻至室溫以供金黃色葡萄球菌之培養；培養基之製備是 以 40 g之TSA溶於 1000 ml之去離子水中，加熱攪拌至完全溶解後，
置於高壓滅菌鍋中以溫度 121℃，壓力 1.2 kg/cm2下滅菌 30 分鐘，再 以 1:9 比率加入濃度為McFarland 0.5 濁度標準 (1.5 x 108 CFU/ml)之 金黃色葡萄球菌培養液，於尚未凝固時將上述混合液每 15 ml分裝於 培養皿中，於 37℃恆溫培養 24 小時。
表十三、蒸餾萃取及人工配方茶樹精油之組成
成分 ISO 4730 range (%) DF 1 DF 2
Terpinen-4-ol ≧ 30 30 30
γ-Terpinene 10–28 19 19
α-Terpinene 5-13 13 13
1,8-Cineole ≦ 15 3 0
Terpinolene 1.5–5 5 5
ρ-Cymene 0.5–12 2.5 2.5
α-Pinene 1–6 6 6
α-Terpineol 1.5–8 8 8
Aromadendrene Traces–7 0 0
δ-Cadinene Traces–8 0 0
Limonene 0.5–4 1.5 1.5
Sabinene Traces–3.5 0 0
Globulol Traces–3 0 0
Viridiflorol Traces–1.5 0 0
Subtotal (%) 88.00 85.00
2. 瓊脂井化擴散法 (agar well diffusion method)
本實驗採用瓊脂井化擴散法，因茶樹精油易揮發之特性，故將原 本需製成紙錠之精油，改良方法為製作平板培養基時，預先以滅菌完
成直徑 8 mm之不銹鋼圓環井化之，再將欲試驗之精油 50 μl滴入預鑄 完成之凹槽內。精油於平板培養基之抑菌圈外觀如圖十三。
最小殺菌及最小抑菌濃度是將抑菌環直徑內之透明區域，以用挑 菌鉤環 (transfer loop)取 1 loop 的菌液植入培養皿中，於 37℃恆溫培 養 24 小時。培養皿未有細菌生長所加入的最小的試藥或化合物濃度 為最小殺菌濃度 (MBC)，反之則為最小抑菌濃度 (MIC)。
三、茶樹精油抑制金黃色葡萄球菌活性結果 1. 茶樹精油之主成分抑制金黃色葡萄球菌活性
茶樹精油活性及毒性之各主要成分共有 12 種化合物，其對於金 黃色葡萄球菌之抑菌圈直徑及MIC、MBC值如表十四。以效果優劣順 序 依 次 為 terpinolene > α-terpinene > α-terpineol > (+)-α-pinene >
terpinen-4-ol > γ-terpinene > aromadendrene。Terpinolene查詢歷年文獻 並 無 抑 制 金 黃 色 葡 萄 球 菌 之 實 驗 結 果 記 載 ， 而 其 餘 成 分 包 括 1,8-cineole, ρ-cymene, limone, sabinene及globulol等五種成分並無明顯 抑菌圈，推測並無抑制金黃色葡萄球菌之活性。
因為每個化合物各自有不同之抑制金黃色葡萄球菌之活性，讓我 們思考調整不同茶樹精油成分之組成，是否會影響其抑菌活性，進而 圖十三、瓊脂井化擴散法及精油於平板培養基之抑菌圈外觀
Diameter of inhibition zone
能藉由了解不同組成之比例，而能先行推估其抑菌活性。
表十四、茶樹精油主成分之金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑比及MIC、
MBC
Compounds Diameter of inhibition
zone ratioa MIC MBC Terpinen-4-ol 0.50±0.03 25 % 50 % γ-Terpinene 0.39±0.02 50 % 100 % α-Terpinene 1.00±0.02 6.25 % 25 %
1,8-Cineole ― ― ―
α-Terpinolene 1.03±0.03 6.25 % 100 %
ρ-Cymene ― ― ―
(+)-α-Pinene 0.52±0.06 30 % 50 % α-Terpineol 0.73±0.06 10 % 40 % Aromadendrene 0.27±0.02 50 % 100 %
(+)-Limonene ― ― ― 10 U之效果為強；市售品之強度依序是TTO-F > TTO-E > TTO-C >
TTO-D > TTO-B；蒸餾萃取之茶樹精油TTO-A抑制作用介於TTO-F與 TTO-E之間，其 100 %濃度時抑制金黃色葡萄球菌之效果較penicillin 10 U稍弱。茶樹精油若運用於抗痤瘡，則應考量其是否具有較佳的抗
Control A B C D E F DF1 DF2 Penicillin
D ia m e te r o f in h ib it io n z o n e (c m )
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
表十五、茶樹精油與人工配方精油DF1, DF2 之抑菌圈直徑比 TTO 與 penicillin 抑菌圈比值* MIC (%) MBC (%)
A 0.83 ± 0.04 25 50
B 0.72 ± 0.04 50 100
C 0.88 ± 0.03 25 50
D 0.75 ± 0.06 50 100
E 0.89 ± 0.09 25 50
F 1.17 ± 0.08 3.13 6.25
DF1 0.98 ± 0.03 12.5 25
DF2 0.97 ± 0.03 12.5 25
* Penicillin 10U
不同濃度的茶樹精油其抑制金黃色葡萄球菌之效果亦不同，隨著 濃度遞增其抑菌圈直徑亦隨之漸增。蒸餾萃取茶樹精油TTO-A之MIC 為 25 %。
圖十四、蒸餾萃取茶樹精油及市售品之金黃色葡萄球菌抑制
圖十四、蒸餾萃取茶樹精油及市售品之金黃色葡萄球菌抑制