抗氧化成分之研究

1.總多酚類(polyphenols)含量測定⁽²²⁴⁾

以(+)-catechin 為標準品，做成檢量線。取 20 μL 樣品溶液，加 入 200 μL 之蒸餾水，混合均勻，再加入 40 μL 的 Folin-Ciocalteu 試 劑，靜置5 分鐘，再加入 40 μL 之 20％碳酸鈉(sodium carbonate)溶 液，再以 680 nm 測其吸光值並計算總多酚類含量。總多酚類含量以 mg (+)-catechin equivalent/g dry weight 表示。

2.總類黃酮(flavonoids)含量測定⁽²²⁵⁾

以rutin 為標準品，做成檢量線。取 100 μL 樣品溶液，加入 100 μL 2%之 AlCl3․6H2O 甲醇溶液，混合均勻，靜置 10 分鐘，再以 430 nm 測其吸光值並計算總類黃酮含量。總類黃酮含量以 mg rutin equivalent/g dry weight 表示。

3.總黃酮醇(flavonols)含量測定⁽²²⁶⁾

以(+)-catechin 為標準品，做成檢量線。取 40 μL 樣品溶液，加 入 200 μL 0.1%之 p-dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA)溶液，混 合均勻，靜置 10 分鐘，再以 640 nm 測其吸光值並計算總黃酮醇含 量。總黃酮醇含量以 mg (+)-catechin equivalent/g dry weight 表示。

136

三、抑制α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)之研究：

此部份實驗所用水萃取物樣品仍溶於二次水，但乙醇萃取物則改 溶於DMSO 中，DMSO 的最終濃度為 0.5% (預試驗顯示 DMSO 在此 濃度下，對酵素活性無影響)。實驗步驟依 Tadera 等⁽²¹²⁾人的方法加以 修飾，取20 μL 適當濃度的試驗品溶液(以不同濃度的(+)-catechin 及 quercetin 溶液做正對照組)，加入 100 μL 3 mM 之 4-nitrophenyl α -D-glucopyranoside 溶液(溶於 pH 6.8 的磷酸緩衝液中)，再加入 20μL 的α-glucosidase 溶液(0.5 U/mL)，置於 37℃下反應 30 分鐘，再以 400 nm 測其吸光值。吸光值愈低，表示抑制活性愈強。抑制率計算公式 如下：【1- (ABS sample /ABS control)】×100。

四、統計分析：

本研究實驗結果之數據，皆以mean ± S.D.表示，先進行單因子變 異數分析(one-way ANOVA)，再以Scheffe’s multiple range test 來檢定 其間差異之顯著性，凡p值小於0.05時，則認為其差異具有統計上意 義。

137 Species Water extract yield

(% w/w)^a

Ethanol extract yield (% w/w) 草(31.66 %)、藤三七(22.73 %)、落葵(21.62 %)、土人參(15.58 %)、怡 心草(11.51 %)、番石榴(10.23 %)、舖地錦竹草(8.43 %)。乙醇萃取率 由高而低依序為蛇莓(18.01 %)、落葵(17.61 %)、綠莧草(13.51 %)、藤

138

三七(9.51 %)、消渴草(8.99 %)、土人參(7.05 %)、舖地錦竹草(2.73 %)、

怡心草(2.43 %)、番石榴(2.40 %)。

第二節 抗氧化活性之研究

1.Trolox 當量的總抗氧化能力測定(TEAC)

此實驗主要是藉由清除一相當安定的陽離子自由基ABTS⁺‧，來 探討抗氧化物之抗氧化能力。自由基ABTS⁺‧呈藍綠色，可在 734 nm 波長下被吸收，所以，可以儀器檢測734 nm 波長下吸光值的降低，

來評估自由基 ABTS⁺‧被清除的程度。吸光值越低表示樣品清除 ABTS⁺‧自由基能力越強。而trolox 為一水溶性的維生素 E 類似物，

已知具有強效抗氧化力⁽²²⁷⁾，本實驗藉由 trolox 的檢量線，可將樣品 之 吸 光 值 換 算 成 相 當 trolox 濃 度 (mM) 的 抗 氧 化 能 力 ， 即 以 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)值表示，而 TEAC 值愈高 表示清除 ABTS⁺‧自由基能力越強。TEAC 值被定義為 1000ppm 的 樣品相當trolox 標準溶液抗氧化力之濃度值(mM)。結果如圖 41。

139

0.6 water extracts

ethanol extracts

圖 41 台灣產 9 種治療糖尿病藥用植物之水萃取物(黑色)及乙醇萃取 物(灰色)之 TEAC 值比較。代碼各為 AC(藤三七)、AP(綠莧草)、BA(落 葵)、CR(舖地錦竹草)、DI(蛇莓)、番石榴(PG)、消渴草(RT)、怡心草 (TC)、土人參(TP)。(Each value represented mean ± S.D.，n=3)

除了蛇莓及番石榴，其餘 TEAC 值皆為水萃取物大於乙醇萃取 物。水萃取物之TEAC 值由高而低依序為舖地錦竹草(0.49±0.04)＞番 石榴(0.48±0.06)、蛇莓(0.48±0.02)＞消渴草(0.47±0.00)、藤三七(0.47±

0.03)＞土人參(0.39±0.01)＞綠莧草(0.38±0.01)＞怡心草(0.33±0.00)＞

落葵(0.20±0.00)。乙醇萃取物之 TEAC 值由高而低依序為番石榴(0.50

140 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ)形成錯合物，此錯合物於 593 nm 波長有最大吸收波峰，在此波長觀察抗氧化物還原Fe³⁺的能力。結果 如圖42。

全部樣品的FRAP 值皆為水萃取物大於乙醇萃取物。水萃取物之 FRAP 值由高而低依序為番石榴(12.98±0.19)＞蛇莓(11.45±0.26)＞舖 地錦竹草(4.86±0.10)＞藤三七(4.81±0.09)＞消渴草(4.12±0.15)＞綠莧 草(3.42±0.07)＞土人參(3.00±0.12)＞怡心草(2.95±0.04)＞落葵(1.22±

0.02)。乙醇萃取物之 FRAP 值由高而低依序為番石榴(10.66±0.21)＞

蛇莓(2.79±0.00)＞綠莧草(1.78±0.03)＞消渴草(1.76±0.05)＞舖地錦竹 草(1.55±0.03)＞怡心草(0.79±0.02)＞土人參(0.60±0.01)＞藤三七(0.46±

141 FRAP (μmol Fe2+ /mg)

0

14 water extracts

ethanol extracts

圖 42 台灣產 9 種治療糖尿病藥用植物之水萃取物(黑色)及乙醇萃取 物(灰色)之 FRAP 值比較。代碼各為 AC(藤三七)、AP(綠莧草)、BA(落 葵)、CR(舖地錦竹草)、DI(蛇莓)、番石榴(PG)、消渴草(RT)、怡心草 (TC)、土人參(TP)。(Each value represented mean ± S.D.，n=3)

142 取物(圖 43A)在 62.5μg/mL 的稀釋濃度時，只有番石榴(根)(PGW)、

蛇 莓(DIW) 具 有 明 顯 的 濃 密 度 白 點 ， 但 白 點 密 度 低 於 同 濃 度 的 catechin，此時 GSH 的白點仍未明顯。全部水萃取樣品中則以落葵 (BAW)的白點出現最慢，即抗氧化力最差。而乙醇萃取物(圖 43B)在 62.5μg/mL 的稀釋濃度時，只有番石榴(根)(PGE)具有明顯的濃密度 白點，其白點密度約與同濃度的BHT 相近，但仍不及同濃度 quercetin 的白點密度，至於蛇莓(DIE)則於 125μg/mL 的稀釋濃度始有明顯白 點出現，而藤三七(ACE)、落葵(BAE)、怡心草(TCE)及土人參(TPE) 在全部濃度下，幾乎未見明顯白點。由此可知，番石榴(根)及蛇莓的

143

水及乙醇萃取物仍是屬於較強的抗氧化物。

圖 43 台灣產 9 種治療糖尿病藥用植物之水萃取物(A，上圖)及乙醇 萃取物(B，下圖)清除 DPPH 自由基之 TLC 板染色試驗。濃度為 1000、

500、250、125 及 62.5μg/mL，W 表示水萃取物，E 表示乙醇萃取物。

144 4.DPPH 自由基清除效應

DPPH 為一種相當穩定的自由基，其為紫藍色，在 517 nm 波長 下有強的吸收光，當DPPH 與具有供氫能力之抗氧化劑反應時，其顏 色會消失，因此，在517 nm 的吸光值就會降低，而吸光值降的越低，

表示抗氧化劑(AH)的供氫能力越強，也就是指該抗氧化劑清除自由基 的能力越強。其反應式如下：

DPPH․(violet) + AH → DPPH：H(decolorized) + A․

實驗結果如圖44A 及圖 44B，橫軸代表樣品之濃度，縱軸則為樣 品清除DPPH 自由基的清除率，圖中可清楚看到不同植物之水或乙醇 之萃取物，皆顯示隨樣品的濃度增加，其對DPPH 自由基的清除率也 逐漸上升。而由其數據計算出樣品對DPPH 自由基清除率達 50%時的 樣品濃度(即所謂的 IC50值)，製成表 7，IC50值越小表示清除 DPPH 自由基能力越強。

145

Concentration (μg/mL)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Scavenging activity of DPPH radicals (%)

0

Concentration (μg/mL)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Scavenging activity of DPPH radicals (%)

0 萃取物(B，下圖)之 DPPH 自由基清除作用。濃度為 1000、500、250、

125、62.5 及 31.25μg/mL，W 表示水萃取物，E 表示乙醇萃取物。(Each value represented mean ± S.D.，n=3)(P < 0.05)

146

表 7 台灣產 9 種治療糖尿病藥用植物之水萃取物及乙醇萃取物對 DPPH 自由基清除作用之 IC₅₀(μg/mL)值比較^a

Species and positive controls

Water extract IC50

(µg/mL)

Ethanol extract IC50

(µg/mL)

a Values represented mean ± S.D. of three parallel measurements.

b N.D.：Not detected.

147

取物之 IC50值與 BHT 相近，為 13.66μg/mL。而大多數樣品的水萃 取物之IC50值是小於乙醇水萃取物的，只有番石榴(根)例外。另外，

水萃取物中以落葵的IC50值最大，而乙醇萃取物中，落葵的IC50值仍 然很大(3714.65μg/mL)，僅次於土人參。

5.還原力測定

此實驗主要以測定普魯士藍(prussian blue，K4[Fe(CN)6]3)的產生量 為指標，是利用赤血鹽(potassium ferricanide，PFC，K3Fe(CN)6)提供 Fe³⁺，當樣品與 Fe³⁺反應，即將其還原成 Fe²⁺黃血鹽(K4Fe(CN)6)，黃

148

(0.983±0.029)＞舖地錦竹草(0.829±0.023)＞綠莧草(0.590±0.029)＞土 人參(0.524±0.009)＞怡心草(0.401±0.014)＞落葵(0.207±0.011)，而 GSH 的吸光值為1.230±0.011，只有番石榴(根)及蛇莓的還原力大於 GSH，

落葵的還原力最差。而乙醇萃取物之還原力由高而低依序為番石榴 (0.886±0.053)＞蛇莓(0.456±0.011)＞綠莧草(0.340±0.010)＞舖地錦竹 草(0.151±0.004)＞消渴草(0.149±0.002)＞怡心草(0.132±0.011)＞土人 參(0.096±0.006)＞落葵(0.034±0.004)＞藤三七(0.029±0.002)，BHT 的 吸光值為 1.380±0.032，全部樣品的乙醇萃取物之還原力皆小於 BHT，但番石榴(根)及蛇莓的還原力仍是最強的，最差者為落葵及藤 三七。同時，全部樣品的水萃取物還原力皆大於乙醇萃取物。

149

C oncentration (μg/mL)

0 500 1000 1500 2000

Δ 700nm

Concentration (μg/mL)

0 500 1000 1500 2000

Δ 700nm 萃取物(B，下圖)之還原力試驗。濃度為 2000、1000、500、250、125、

62.5 及 31.25μg/mL，W 表示水萃取物，E 表示乙醇萃取物。(Each value represented mean ± S.D.，n=3)(P < 0.05)

150

第三節 抗氧化成分之研究

台灣產9 種治療糖尿病藥用植物之水萃取物及乙醇萃取物，其所 含總多酚類、總類黃酮及總黃酮醇之含量分析，結果如表 8 所示。

1.總多酚類(polyphenols)含量測定

總多酚類含量以mg (+)-catechin equivalent/g dry weight 表示，在 9 種植物材料中，多數的水萃取物所含總多酚類是大於乙醇萃取物 的，只有綠莧草及怡心草例外。水萃取物中以番石榴(PGW)、蛇莓 (DIW)所含總多酚類最多，落葵(BAW)最少。乙醇萃取物中，番石榴 (PGE)所含總多酚類最多，怡心草(TCE)次之，落葵(BAE)、藤三七(ACE) 最少。

2.總類黃酮(flavonoids)含量測定

總類黃酮含量以mg rutin equivalent/g dry weight 表示，在 9 種植 物材料中，多數的水萃取物所含總類黃酮是大於乙醇萃取物的，只有 落葵、怡心草及消渴草例外。水萃取物中以番石榴(PGW)、蛇莓(DIW) 所含總類黃酮最多，怡心草(TCW)、落葵(BAW)最少。乙醇萃取物中，

蛇莓(DIE)所含總類黃酮最多，土人參(TPE)次之，但番石榴(PGE)卻 最少。

151

表 8 台灣產 9 種治療糖尿病藥用植物之總多酚類、總類黃酮及 總黃酮醇之含量比較 ^a

Species Total polyphenols (μg CE/mg)^b

Total flavonoids (μg RE/mg)^c

Total flavonols (μg CE/mg)^b

a Values represented mean ± S.D. of three parallel measurements.

b Data expressed in μg (+)-catechin equivalent / mg dry weight (μg CE/mg).

c Data expressed in μg rutin equivalent / mg dry weight (μg RE/mg).

152 3. 總黃酮醇(flavonols)含量測定

總黃酮醇含量以mg (+)-catechin equivalent/g dry weight 表示，在 9 種植物材料中，多數的水萃取物所含總黃酮醇的量是與乙醇萃取物 相近的。水萃取物中仍以番石榴(PGW)所含總黃酮醇最多。乙醇萃取 物中，也以番石榴(PGE)所含總黃酮醇最多。

4. 總抗氧化活性與總多酚類、總類黃酮及總黃酮醇含量間的相關性 植物所含多酚化合物對於其抗氧化性及其生物活性扮演著重要 角 色 ， 並 有 研 究 報 告 指 出 多 酚 化 合 物 與 抗 氧 化 性 具 有 正 相 關 性

(229,230)。而水萃取物與乙醇萃取物在總抗氧化活性(此處選用 FRAP 結

果代表總抗氧化活性)與總多酚類、總類黃酮及總黃酮醇含量間的關 係，以相關係數(Correlation coefficients，R²)表示。結果如圖 46A、46B、

47A、47B、48A 及 48B 所示，在水萃取物方面，FRAP 與 3 種成分 間的正相關性趨勢為總多酚類(R²=0.865)＞總類黃酮(R²=0.652)＞總 黃酮醇(R²=0.489)。在乙醇萃取物方面，FRAP 與 3 種成分間的正相 關性趨勢為總黃酮醇(R²=0.963)＞總多酚類(R²=0.896)＞總類黃酮 (R²=0.235)。由此可知，本實驗的 9 種藥用植物水萃取物與乙醇萃取 物之總抗氧化能力與總多酚類是具有正相關性的。

153

R²=0.865

Total polyphenol content in the water extracts (μg CE/mg)

0 100 200 300 400 500 600 700 800

FRAP (μmol Fe2+ /mg)

0

Total polyphenol content in the ethanol extracts (μg CE/mg)

0 100 200 300 400 500 600

FRAP (μmol Fe2+ /mg)

0

154

R²=0.652

Total flavonoid content in the water extracts (μg RE/mg)

0 50 100 150 200 250 300

FRAP (μmol Fe2+ /mg)

0

Total flavonoid content in the ethanol extracts (μg RE/mg)

10 20 30 40 50 60 70 80

FRAP (μmol Fe2+ /mg)

0

155

R²=0.489

Total flavonol content in the water extracts (μg CE/mg)

10 15 20 25 30 35 40 45

FRAP (μmol Fe2+ /mg)

0

Total flavonol content in the ethanol extracts (μg CE/mg)

10 20 30 40 50 60 70 80

FRAP (μmol Fe2+ /mg)

0

156

第四節 抑制α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)之研究

我們以此部份實驗作為所選 9 種治療糖尿病藥用植物之水萃取 物 及 乙 醇 萃 取 物 之 體 外 降 血 糖 活 性 評 估 ， 而 α-glucosidase (EC 3.2.1.20；α-D-glucoside glucohydrolase)的來源是取自 Baker´s yeast (麵包酵素)，受質為 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，其原理為受 質本身雖無顏色，但在α-glucosidase 對其進行水解後，所得產物具 有黃色的顯色，於400 nm 下測其吸光值，吸光值越高表示水解產物 越多，即酵素活性越大，藥物對該酵素的抑制能力越差。

1.實驗條件之預試驗

但由於考量α-glucosidase 本身的酵素影響條件及實驗的最佳條 件，我們預先進行實驗條件之預試驗，包括受質(初)濃度、反應時間、

α-glucosidase 濃度及緩衝液之酸鹼值等四項。而依結果我們發現受 質(初)濃度在 2.4 mM 之後，catechin 及番石榴(根)水萃取物對α -glucosidase 的抑制率開始下降，而兩者的 IC50則在 3.2 mM 之後，明 顯上升，故將受質(初)濃度選定為 2 mM(圖 49A 及圖 49B)；反應時間 方面，由圖50A 及圖 50B 顯示反應 30 分鐘時，catechin 對α-glucosidase 的抑制率達到最高水平，而不加藥物(只有加水)的對照組，其於 400 nm 的吸光值於 30 分鐘亦達最高水平，故將反應時間選定為 30 分鐘；

α-glucosidase 濃度方面，由圖 51 顯示α-glucosidase 濃度降至 0.01

157

U/well ( 指 96-well 微 量 盤 ) 時 ， catechin 及 蛇 莓 水 萃 取 物 對 α -glucosidase 的抑制率達最高，故將α-glucosidase 濃度選定為 0.01 U/well；緩衝液之酸鹼值方面，由圖 52 顯示 pH 值在 6.8 時，不加藥 物(只有加水)的對照組，其於 400 nm 的吸光值達到最高值，而 pH 值 降至5.5 時，吸光值大幅下降，表示α-glucosidase 的活性明顯受到破 壞，故將緩衝液之酸鹼值定為6.8。

158

S u b stra te co n cen tra tio n (m M )

0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5 4 .0

α-Glucosidase inhibition (%)

4 0

α-glucosidase 濃度為 0.05 U/well，反應時間為 10 分鐘。(Each value represented mean ± S.D.，n=2)(P < 0.05)

159 Incubation time (min)

0 10 20 30 40 50 60

α-Glucosidase inhibition (%)

20 40 60 80 100

Catechin 2000μg/mL Catechin 1000μg/mL

圖 50A Catechin 於不同反應時間下對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

Catechin 濃度為 1000 及 2000μg/mL，而反應時間為 10、20、30、40、

50 及 60 分鐘，α-glucosidase 濃度為 0.05 U/well，受質濃度為 4 mM。

50 及 60 分鐘，α-glucosidase 濃度為 0.05 U/well，受質濃度為 4 mM。

在文檔中 台灣產九種治療糖尿病藥用植物之抗氧化及降血糖相關性之研究;Studies on the Relationship between Antioxidant and Antihyperglycemic Activities of Nine Antidiabetic Medicinal Plants Originated from Taiwan (頁 152-0)