第三章、 材料與方法
第四節、 血液透析患者血液的分析
一、 脂質過氧化產物Malondialdehyde 之測定
當自由基攻擊細胞膜上的多元不飽和脂肪酸之後，會進行連鎖反應，
導致脂質過氧化作用。此過氧化反應的次級產物丙二醛（malondialdehyde, MDA）可與thiobarbituric acid（TBA）reagent 結合形成紅色物質TBARs，
可以分光光度計測之，作為動物體中是否產生脂質過氧化作用的指標，
單位以nmole/gHb表示。
此物質之測定是參考Yang（2006）(85)的分析方法。
（一） 藥品與儀器設備 1. 藥品與器皿
¾ 磷酸：H3PO4，SIGMA
¾ 硫代巴比妥酸：Thiobarbituric acid TBA，SIGMA-ALDRICH
¾ 三氯乙酸：Trichloroacetic acid TCA，Riedel-de Haen
¾ 標準品：Tetraethoxypropane，SIGMA
¾ 氰變性血紅素：Cyanmethemoglobin，SIGMA
¾ Drabkin´s solution，SIGMA
¾ 定量瓶：BRAND，100、1000 mL
¾ 微量吸管：BRAND，Transferpette，10、100、1000 μL
¾ 燒杯：BRAND，50、100 mL
¾ 塑膠比色槽：Cuvettes 2. 儀器設備
¾ 微量天平：AND HR200
¾ 離心機：Eppendorf，centrifuge 5415D
¾ 恆溫水浴震盪器：Shaker bath model B603，FIRSTEK SCIENTIFIC
¾ 分光光度計：Spectrophotometer，UV-160A，SHIMADZU
（二） 品保與品管措施
1. 檢量線之建立與儀器偵測極限
配製儲備溶液（stock solution），取 48 μl Tetraethoxypropane 放至定量 瓶，以去離子水定量至100 mL，配製成 0.48 μg/mL 之儲備溶液，再配成 檢量線濃度範圍為0.006～0.48 μg/mL 之標準品，其檢量線之相關係數超 過0.995，將檢量線最低點連續分析七次，計算其濃度三倍標準差即為儀 器偵測極限（Limit of Detection），其值為 0.00184 μg/mL。
由於是分析紅血球中的MDA， 所以必須要做血紅素的校正，另製儲 備溶液（stock solution），秤重 0.36 g Cyanmethemoglobin 放至定量瓶，
並以Drabkin’s solution 定量至 2 mL，再從中取 40 μL 以 Drabkin’s solution 定量至10 mL，配成檢量線濃度範圍為 0～180 mg/mL 之標準品，其檢量 線之相關係數超過0.995。
2. 儀器再現性
配製中度濃度之標準品，重複分析七次，求算出七次的平均值及標準 差，以標準差除以平均值即可得變異係數（CV%），其值為 0.89%，變異 係數值小於7%，代表儀器分析之穩定性。
（三）分析步驟 1. MDA 分析步驟
↓將已用 PBS buffer 清洗過四次的紅血球混合均勻
↓取 100 μL 0.44 M H3PO4至 eppendorf 中
↓加入 250 μl 0.6% TBA
↓加入 1 mL 的紅血球
↓95℃水浴 1 小時
↓冰浴 10 分鐘
↓加入 150 μL 20% TCA
↓以 13000 rpm 轉速離心 10 分鐘
↓取上清液
↓分光光度計 Spectrophotometer 上機分析，吸光值 532 nm 2. Hemoglobin 分析步驟
↓取 2 mL Drabkin’s solution 至離心管
↓加入 8 μL lysate
↓分光光度計 Spectrophotometer 上機分析，吸光值 540 nm
二、抗氧化酵素Glutathione Peroxidase 活性之測定
此物質之測定是參考 Paglia and Valentine（1967）(86)的分析方法。在 cumene hydroperoxide 存在下，glutathione peroxidase（GPX） 會 催 化 glutathione 氧化成 oxidized glutathione（GSSG），而GSSG 會由 glutathione reductase（GR）再還原成 GSH，此時會消耗掉 NADPH，因此測 NADPH 之消耗量即可求得GPx 之活性。以下為其反應式：
2GSH＋ROOH GPx ROH＋GSSG＋H2O GSSG＋NADPH＋H＋ GR 2GSH＋NADP＋
（一）藥品與儀器設備 1. 藥品與器皿
本研究採用市售的酵素組合劑 (Randox, RS 504)
¾ Reagent: glutathione 4 mmol/L glutathione reductase ≧0.5 U/L
NADPH 0.28 mmol/L
¾ Buffer: phosphate buffer 0.05 mmol/L; pH 7.2
EDTA 4.3 mmol/L
¾ Cumene hydroperoxide 0.18 mmol/L
¾ 微量吸管: BRAND, Transferpette, 100、1000 μL
¾ 燒杯: BRAND, 50
¾ 塑膠比色槽: Cuvettes
2. 儀器設備
¾ 自動生化分析儀：Express plus, CHIRON DIAGNOSTICS
（二）品保與品管措施
↓將 Reagent 和 Cumene hydroperoxide 放入轉盤
↓儀器依序將 Reagent 和 Cumene hydroperoxide 加入 Cuvettes
%
↓混勻後，使用自動生化分析儀分析
↓於 37℃、波長 340 nm 條件下
↓紀錄 2 分鐘內吸光值之變化
求得每分鐘吸光值的變化(ΔA)後，使用 kinetic 方法推斷濃度，
U/L of heamolysate = 8412×ΔA (340 nm/min)；ΔA=Asample-Ablank
酵素活性單位：GPX U/L表示，1U的定義為每一分鐘減少1 μmole的 NADPH。
三、血中微量元素濃度之測定
全血中微量元素含量分析是參考美國疾病管制局 2004 年編定，編號 ITB001A 之血中鉛、鎘與汞感應式耦合電漿質譜附動態反應室法(87)。
（一）藥品與儀器設備 1.藥品與器皿
¾ 10%硝酸：Nitric acid, Selectipur UPS, MERCK
¾ Triton X-100：98%, PLUSEONE
¾ 氫氧化四甲基銨：Tetramethylammonium Hydroxide TMAH, GR, MERCK
¾ 乙醇：Ethanol, BAKER
¾ 標準品：
1000±10 mg/L, MERCK）
Arsenic 100 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
Copper 5000 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
Mercury 100 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
Lead 500 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
Zinc 5000 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
Cadmium 100 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
Nickel 100 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
Selenium 500 μg/L in 10% HNO3（standard for ICP, MERCK）
¾ 定量瓶：BRAND, 100、1000mL
¾ 定量吸管：BRAND Transferpette, 10 mL
¾ 微量吸管：BRAND Transferpette, 100、1000μL
¾ 燒杯：BRAND, 50、100 mL
¾ 離心管：IWAKI, 15、50 mL 2.儀器設備
¾ 感應耦合電漿質譜儀（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry, ICP-MS）：Perkin Elmer, ELAN DRCⅡ，含 1.樣品導入裝置：霧化器 與蠕動幫浦 2.原子化及離子源：電漿產生器與火炬組 3.質量分析儀
（Mass Analyzer）：四極柱（Quadrupole Mass Spectrometer）4.偵測器：
電子倍增器（Electron Multiplier）來偵測離子並放大訊號。
儀器分析條件 ICP parameters
RF power（W） 1100 Plasma gas flow（L/min） 17 Auxiliary gas flow（L/min） 1.3 Nebulizer gas flow（L/min） 0.97
Nebulizer Meinhard Nebulizer Spray chamber Cyclic Spray chamber Sampling cone Pt
Skimmer cone Pt DRC parameters
NH3 flow rate（mL/min） 0.6 Quadrupole rod offset（Ⅴ） -5.5 Cell path voltage（Ⅴ） -19 Cell rod offset（Ⅴ） -7 Rejection parameter a 0 Rejection parameter q 0.25 Autolens On Mass spectrometer settings
Dwell time（ms） 50 Sweeps 20
Readings 1 Replicates 3
（二）品保與品管措施
1.檢量線之建立與儀器偵測極限
配製儲備溶液I（stock solution I），分別加入 100 μg/L 的砷、鎘、汞、
鎳，500 μg/L 的鉛、硒及 5000 μg/L 的銅、鋅於同一只定量瓶中，以 10%
硝酸定量至100 mL，再稀釋成 10%的儲備溶液Ⅱ，配成砷、鎘、汞、鎳 檢量線濃度範圍為0.02～1 μg/L，鉛、硒檢量線濃度範圍為 0.1～5 μg/L，
銅、鋅檢量線濃度範圍為1～50 μg/L 之標準品，檢量線配製至少六點（不 包括空白零點）已知濃度之標準溶液與其相對應儀器感應訊號值，再繪 製成相關線性圖，計算其相關係數 r2值，此值均大於 0.995。ICP-MS 八 種元素儀器偵測極限，為檢量線最低點濃度連續上機分析七次，計算其 濃度三倍標準差，範圍介於0.0043～0.7036 之間。
全血分析之檢量線範圍、r2值及偵測極限如下：
濃度範圍（μg/L）
Element
最低 最高
r2 偵測極限（μg/L）
As 0.02 1 0.9999 0.0461
Cd 0.02 1 0.9999 0.0043
Cu 1 50 0.9999 0.1027
Hg 0.02 1 0.9997 0.0134
Ni 0.02 1 0.9997 0.0296
Pb 0.1 5 0.9999 0.0898
Se 0.1 5 0.9998 0.0365
Zn 1 50 0.9999 0.7036
2.檢量線之確認
以不同檢量線標準溶液來確認檢量線的適用性，其濃度取檢量線中間 濃度確認之；利用已建立檢量線求得濃度，比對標準溶液濃度，求其變 異係數（CV）值，CV 值都小於 7%。
各微量元素之檢量線確認圖詳見圖一～八。
3.空白樣品分析（Blank）
每批次執行兩個空白樣品分析，確認待分析樣品在分析過程無遭受污 染。
4.儀器再現性（Precision）
標準品中間濃度重複分析七次，求算出七次的平均值及標準差，以標 準差除以平均值即可得變異係數（CV%）值，其變異係數值為 1.42%～
9.91%，代表儀器之精密度。
5.準確性（Accuracy）
購買濃度經確認之參考標準樣品（SRM），SeronormTM Trace Elements Blood L-2 LOT 0503109，以相同方法分析，對照其經確認之濃度，藉此 確認分析結果的準確度，檢測出的濃度除以標準品的濃度其值應介於
80%～120%。
Se 123 139 113.1 Zn 5038 4825.5 95.8
（三）分析步驟
↓準備 15 mL 離心管
↓加入 9 c.c.含 0.5 mL Triton X-100、10 mL TMAH、100 mL Ethanol、1 mL Au 之稀釋液。
↓將全血混合
↓加入 0.2 mL 全血血液
↓1500 rpm 離心 5 分鐘
↓上機 ICP-MS 分析
每次前處理都在抽風櫃進行操作，每個實驗器皿都用中性洗液清洗 後，泡20%硝酸 12 小時以上，再以二次純水清洗晾乾後使用(88)。