黏附因子與動脈粥狀硬化

細胞黏附因子就是表現在細胞表面的分子，作為此細胞和其他細胞 或細胞外基質黏附的媒介。約在1993 年，研究者對於血管內皮細胞和 循環血液中白血球上的細胞黏附因子已有廣泛的認知【104】。而這些可 溶性的黏附分子大致分為三類：

（1）Selectins：包含：噬酸性中性球（eosinophils）、單核球、淋巴 球表現的L-selectin（CD62L）、內皮細胞表現的 E-selectin（CD62E）、

內皮細胞和血小板表現的P-selectin（CD62P）等。

（2）Immunoglobulin superfamily 為免疫球蛋白的超級家族，如：血 管細胞黏附因子（vascular cell adhesion molecule, VCAM-1）、細胞間黏 附因子（intercellular adhesion molecule, ICAM-1）【104】。

（3）Integrins：大多分佈於淋巴球、單核球與顆粒球上，每種不同

的細胞帶有不同的intergrins，包括：

（A）VLA-4（α4β1: CD49d/CD29）：分佈於噬酸性白血球

（eosinophils）、淋巴球與單核球。

（B）LFA-1（αLβ2: CD11α/ CD18）：分佈於多核型態白血球

（polymer-phonuclear leukocytes, PMN）、單核球和淋巴球。

（C）Mac（αMβ2: CD11b/CD18）：分佈於多核型態白血球、單核

球、自然殺手細胞與T 細胞【105】。

在高血壓病患之血漿中的可溶性黏附因子，如：VCAM-1、ICAM-1 較 正常血壓的人高【106,107】，但 E-selectin 則和血壓正常者沒有顯著差異

【107】。對於高血壓合併出現高膽固醇血症病患，高膽固醇血症會增強 血漿可溶性黏附因子的活性【106】。高三酸甘油酯症年輕人和正常年輕

人相比，其 VCAM-1、ICAM-1 濃度較高，且血管舒張力（brachial artery flow mediated vasodilation）亦不正常【108】。細胞表面所表現的黏附因 子，除了參與細胞的遷移（migration）、訊號傳遞和其他血管生理反應，

其亦可與內皮和血球細胞作用，是造成初期動脈粥狀硬化發展的重要步 驟【109】。在動脈粥狀硬化損傷血管的內皮細胞模式中，發現VCAM-1、

ICAM-1、E-selectin 與動脈粥狀硬化的生成有相關性。因此，偵測循環

血液中的黏附分子不只能代表內皮功能不良，更是早期動脈粥狀硬化的 指標【110】。

VCAM-1（CD106）專一性的分佈於血管內皮細胞上，可以辨識表 現在噬酸性白血球（eosinophils）上的 α4-integrin，此醣蛋白也會出現在 單核球和淋巴球上，但卻不會出現在中性顆粒球（neutrophils）上。抑

制VCAM-1 和 α4-integrin 的結合，則可抑制嗜酸性白血球、淋巴球、單 核球黏附到血管內皮細胞，預期可有效治療多種發炎性疾病【105,111】。

第九節 單核球趨化因子與動脈粥狀硬化

循環血液中的單核球和T 細胞會不斷黏附到血管內皮上，此為早期 動脈粥狀硬化生成的標記【112】。單核球趨化因子（monocyte chemoattrac tant protein 1 ,MCP-1）對於黏附於血管內皮細胞的單核球之進入血管壁

內膜扮演重要角色。許多的細胞都會分泌 MCP-1，如：內皮細胞、平滑 肌細胞、巨噬細胞，而這些細胞在動脈粥狀硬化的生成都佔有舉足輕重 的地位【113】。

臨床的研究中，發現血漿中的 MCP-1 的濃度和心血管疾病如：高 脂血症的危險因子相關；且在急性心肌梗塞相較於穩定心絞痛的病患，

血中有較高的 MCP-1 濃度【114】。血管平滑肌細胞內的氧化脂質會透 過NF-κB，調控 MCP-1 的基因表現【115】。紐西蘭白兔的動物模式中，

給予0.5 %膽固醇飲食相較於正常飲食兔子之胸主動脈 MCP-1 mRNA 和 蛋白質的表現量都較高，而在給予estradiol 後則發現其可降低高膽固醇 飲食兔子胸主動脈 MCP-1 mRNA 和蛋白質的表現【116】；亦有研究指 出，補充紐西蘭白兔類黃酮物質如：naringin 和 naringenin，則可以降低 肝中ACAT （acyl-CoA: cholesterol acyltransferase）的活性，以及胸主動 脈VCAM-1 與 MCP-1 mRNA 的表現【117】。

第三章 實驗設計

先以體外試驗：捕捉 DPPH 自由基、抑制 LDL 氧化與總抗氧化能 力（trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC）測定綠原酸和 probucol 的抗氧化能力，接著進行動物實驗。

以紐西蘭大白兔（New Zealand White rabbits, NZW rabbits）餵食高

油高膽固醇飲食導致高血脂症，且誘發血管動脈粥狀硬化的模式來進行 研究。

紐西蘭大白兔飼養於動物中心，飼養於十二小時交替的日夜循環，

室溫控制於 21±1 ℃、溼度約 40~60 %，每隻兔子單獨飼養於籠子中。

進入實驗期前，先以 rabbit chow 飼養一到兩個禮拜，使兔子適應 100 g/d 的飼料攝取量。24 隻紐西蘭大白兔體重約 2~2.5 kg，隨機分為四組，分

別為餵食rabbit chow 的正常組（normal group，N）；第二組為餵食含有 10 %大豆油、0.5 %膽固醇的高油高膽固醇組（high cholesterol diet group，C）；第三組則是餵食高油高膽固醇組加 probucol（1 g/Kg diet）

（high cholesterol + probucol diet group，P）；第四組則是餵食高油高膽 固醇組加綠原酸（1 g/Kg diet） （high cholesterol + chlorogenic acid diet group，CA），且自由給予飲水。每天記錄飲食量，每週記錄兔子的體重，

以作為飲食與兔子正常生長狀況的評估。實驗期為 8 週，於 0 週、4 週 進行耳靜脈抽血，進行抽血實驗前禁食 12 小時；兔子於 8 週利用 CO2

進行犧牲，犧牲前亦禁食 12 小時。犧牲後，取出的組織分別依實驗不

同，暫時存放於 DEPC 水或 PBS 進行清洗分裝，並立即冰入-80 ℃冰箱。

實驗流程簡圖如下：

圖3-1 體外實驗流程簡圖

Chlorogenic acid Probucol

捕捉 DPPH 自由基 抑制 LDL 氧化 總抗氧化能力測試 （TEAC）

進行體內試驗

備註：TEAC：Trolox equivalent antioxidant capacity

圖3-2 體內實驗流程簡圖

紐西蘭大白兔

正常組 (N) 控制組 (C) 綠原酸組 (CA) probucol 組 (P) Rabbit chow 10 % soy oil 10 % soy oil 10 % soy oil 0.5 % cholesterol 0.5 % cholesterol 0.5 % cholesterol 0.1 % 綠原酸 0.1 % probucol

0 週 抽血：膽固醇、三酸甘油脂（TG）

4 週 抽血：膽固醇、三酸甘油脂（TG）

8 週 血清 血脂 （膽固醇、TG、LDL-C、HDL-C）

抗氧化指標 TBARS

LDL-Lag phase 血管 組織切片

ROS 測量：Luminol-CL 萃 RNA：RT-real time PCR

第四章 材料與方法

< 一 > 體外試驗-1：捕捉 DPPH 自由基（DPPH radicals scavenging ability）

A 器材：

DPPH（Sigma, MO, USA）

B 儀器：

分光光度計（HITACHI U-2000 spectrophotometer, HITACHI, Japan）

C 原理：

DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）可溶於酒精中，呈現深紫色，

被抗氧化劑捕捉後會呈現淺黃色，且在 517 nm 有最大吸光值，所以利 用其顏色變化的原理來評估物質的抗氧化性。

D 步驟：

將不同濃度的chlorogenic acid 和 probucol 分別加入 DPPH 自由基之 甲醇溶液，混和30 min 後，以 spectrophotometer 在波長 517 nm 測吸光 值。整個實驗流程均需避光進行。當吸光值愈低表示清除DPPH 自由基 能力愈強，以未添加chlorogenic acid 或 probucol 為控制組，以控制組吸

acid 和 probucol 的濃度（IC50）。

E 計算方式：

清除率（%） = 控制組吸光值-實驗組吸光值 X 100 % 控制組吸光值

< 二 > 體外試驗-2：抑制 LDL 氧化作用

A 儀器：

ELISA plate reader（μ QUANT, Bio-Tek, USA）

B 步驟：

從健康人的血清中分離出 LDL，先進行蛋白質定量並經 PBS 稀釋 至 0.9 mg/ml 後均分至各試管中。之後各試管再加入不同濃度綠原酸和 probucol，並以 50 μM CuSO4誘發氧化，再利用EDTA 終止氧化。加入 2-propanol 沈澱蛋白質，並以 12000 rpm 離心 10 分鐘後，吸取上清液在 波長234 nm 測吸光值，以未添加其他抗氧化劑之 CuSO4誘發 LDL 氧化 組別做為控制組，以下列算式求的抑制百分比為橫軸，抗氧化劑濃度為 縱軸做出抑制曲線，求綠原酸或probucol 抑制 50 %之 LDL 氧化時，所 需莫耳濃度即為IC50。

C 計算：

抑制LDL 氧化（％）＝（控制組吸光值–實驗組吸光值）X 100 % 控制組吸光值

< 三 > 體外試驗-3：總抗氧化能力測試（Trolox equivalent antioxidant capacity , TEAC assay）

A 儀器：

分光光度計（HITACHI U-2000 spectrophotometer, HITACHI, Japan）

B 試劑炮製：

Peroxidase 由原來濃度 1000 unit/mg， 用二次水稀釋成 44 unit/mg；由 30% H2O2原液取57 μL 加二次水泡成 1L 的 500 μM H2O2；取 8.23 mg ABTS 用 95 %酒精泡成 20 mL 的 750 μM ABTS 溶液。

C 步驟：

將0.5 mL 之 44 unit/mg peroxidase、0.5 mL 之 500 μM H2O2以及 0.5 mL 之 750 μM ABTS（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline -6-sulfonic acid））與 3 mL 的二次水混和均勻，於室溫反應 6 分鐘後生成穩定之藍 綠色的陽離子自由基 ABTS•⁺，再分別加入 0.5 mL 不同濃度的 trolox

用 trolox 清除 ABTS•⁺陽離子自由基的能力來定義 chlorogenic acid 的 TEAC。利用相同方式，測定 probucol 的抗氧化力。TEAC 值愈大表抗 氧化能力愈佳。

D 計算：

（1）利用 trolox 檢量線求得樣品的濃度 （2）TEAC 值= 樣品的吸光值

0.028^註 X 樣品的濃度 註：0.028 是迴歸係數

< 四 > 飼料製備

A 藥品：

Cholesterol（Sigma, MO, USA）

Probucol（Sigma, MO, USA）

Chlorogenic acid（Sigma, MO, USA）

大豆油（泰山，Taichung，Taiwan）

兔飼料（福壽牌，Taichung，Taiwan）

B 步驟：

秤取十天份的 cholesterol, probucol, chlorogenic acid 與一般兔飼料

（rabbit chow）。先將冷凍的飼料熱炒，逼出飼料內的水氣，使飼料較容 易吸附油脂，倒入秤好的cholesterol、probucol 或 chlorogenic acid，接著 加入十天份的大豆油以低溫拌炒均勻，注意火候不要太大以免燒焦。炒 好放入夾鏈袋，標明製作日期、天份、飲食種類、實驗室負責人，儲存 於-20 ℃冰箱。

< 五 > 抽血

A 器材：

23 1/2 G 蝴蝶針（華杏，Meditop Corporation, Malaysia）

棉花（藤旺，彰化，台灣）

10 mL 針筒（特浦，高雄，台灣）

15 mL 離心管（Sastedt, Germany）

兔架 B 步驟：

抽血實驗需兩人以上方可進行。將兔子從籠中抱出，先進行安撫使 其情緒穩定，將其抱入兔架固定，使其身體無法動彈。一人用雙手固定 兔子的頭部，避免其因疼痛而亂動導致更嚴重傷害，且在固定頭部的同 時，注意兔子的呼吸，以及眼睛瞳孔狀況。若有眼睛翻白、瞳孔縮小的

情形，則需趕快鬆開兔架使兔子回覆呼吸。先噴酒精且按摩兔子耳朵直 到血管清楚浮現，再將蝴蝶針整支插入血管內，以免因為兔子掙扎而針 脫落，整支插入後開始進行抽血。取出全血先冰於4 ℃，待進一步處理。

< 六 > 分離血清（Isolation of serum）

A 儀器：

往復式震盪恆溫水浴機（Reciprocal shaking baths, TKS, Taiwan ） 離心機（Himac CR21, HITACHI, Japan）

氮氣（吉源行, Taichung, Taiwan）

B 步驟：

血清分離過程全程避光。從冰桶中取出兔子全血，立即放入 37℃水 浴槽，水浴 1.5 小時，取出水浴槽中的樣本放入 4 ℃冰箱中 1 小時，以 利血液凝結、血球沉澱；再反覆以 4 ℃、4000g 離心 15 分鐘，抽取上 清液。上清液即為血清，血清充氮氣並保存於4 ℃或-20 ℃。

< 七 > 組織切片染色（Histochemistry）

A 器材：

包埋盒 10 % 福馬林 B 藥品泡製：

10 % 福馬林：取甲醛原液（原液濃度：37 %） 270.3 mL 加入 DDW 至1 L。調配成 10 %福馬林溶液放置室溫即可使用。

C 步驟：

犧牲時，將血管放入PBS 中稍微清洗，縱切下約 3~5 mm 血管放入 包埋盒中，將包埋盒完全浸置於10 %的福馬林，固定組織。接著進行組 織脫水，用石蠟浸潤並包埋，組織內的水分會被石蠟所取代，組織經過 石蠟包埋成臘塊，有利於保存；接著用切片機切成約 3-5 μm 的石蠟切 片，並且用蘇木紫-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色。蘇木紫可將細

胞核染為藍紫色，伊紅則可將細胞質染為淡粉紅色。利用 alphaimage 2200 軟體計算內膜增厚的面積，將內膜增厚(含血管管腔)之面積減去血

管管腔面積，即得到血管內膜增厚的面積。相較於控制組的內膜增厚百

管管腔面積，即得到血管內膜增厚的面積。相較於控制組的內膜增厚百