蘇秋竹1,3、馮鈞育1、高清文1、曾國欽2、徐世典2
1 行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所
2 國立中興大學植物病理學系
3 聯絡作者，電子郵件信箱：[email protected]
摘 要
梨葉緣焦枯病(pear leaf scorch)為台灣特有之病害，普遍發生於横山梨 (Pyrus pyrifolia)栽植區，梨葉緣焦枯病菌之培養性狀及具波浪狀細胞壁 (ripple cell wall) 的特性與侷限導管細菌(xylem-limited bacteria) Xylella fastidiosa 相同，但梨葉緣焦枯病菌與其他寄主植物來源之 X. fastidiosa 菌株 間無血清相關性，且以 X. fastidiosa 廣效性引子對 272-1-int/272-2-int 及 RST31/RST33 對梨葉緣焦枯病菌菌株進行 polymerase chain reaction (PCR) 反應時，亦無任何基因產物。利用隨機引子(OPA11)進行 random amplified polymorphic DNA (RAPD)分析，成功獲得對梨葉緣焦枯病菌獨有核酸片段 大小為1412 bp，從核酸序列中設計得到一組專一性引子對 PLS-F/PLS-R 可 增幅出416 bp 大小之專一性基因產物。此一引子對可直接進行梨葉緣焦枯 病田間罹病梨樹組織之PCR 檢測。利用 RAPD-PCR、enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-PCR (ERIC-PCR)及 BOX-PCR 三種 DNA 指紋 圖譜技術分析所得之親緣樹狀圖皆可將 8 種寄主植物之 X. fastidiosa 菌株 區分為4 個菌群，分別為：(1)梨菌群、(2)夾竹桃及葡萄菌群、(3)桑椹菌群 及(4)胡桃樹、李樹、桃樹及無花果菌群。此等指紋圖譜技術均可有效鑑別 梨葉緣焦枯病菌，並顯示其為 X. fastidiosa 菌群中唯一之獨立菌系。進一 步利用鄰聚法（Neighbor Joining）進行 10 種不同寄主植物之 X. fastidiosa 菌 株系統親緣分析（phylogentic analysis），由16S rRNA 序列及 16S-23S rRNA 區間序列所構建的親緣演化樹（phylogentic tree）皆可明顯區分為 2 個菌群，
分別為梨葉緣焦枯病菌菌群及其他9 種寄主植物 X. fastidiosa 菌群，而其他 寄主植物X. fastidiosa 菌群皆可再細分 4 個次菌群，分別為(1)夾竹桃菌群、
(2)葡萄及桑椹菌群、(3)咖啡及柑橘菌群及(4)胡桃樹、李樹、桃樹及無花果 菌群。由以上結果顯示，梨葉緣焦枯病菌為Xylella 屬內僅侷限於台灣獨立 的菌群與其他寄主植物X. fastidiosa 菌株間為較低同源性，應可支持梨葉緣 焦枯病菌為Xylella 屬內亞種分類地位，甚至可能為新種。本文研發有關侷 限導管細菌PCR 鑑定與偵測技術，未來有潛力應用於梨葉緣焦枯病菌之蟲 媒及中間寄主植物快速偵測。合理的管理栽培制度應可減輕梨葉緣焦枯病 之嚴重度，剷除罹病株，可減少其感染源，無性繁殖時應避免剪取罹病株 之枝條扦插或芽供接穗之用，化學治療方面，注射四環黴素於每年 5 月及 10 月各注射一次，有相當程度之療效，配合增施有機肥可維持病樹正常生 產力。
關鍵詞﹕梨葉緣焦枯病、侷限導管細菌、聚合酵素連鎖反應、偵測、DNA 指紋圖譜技術、16S rRNA 基因序列、16S-23S rRNA 基因區間序 列、系統親緣分析
緒 言
梨為薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomoideae)梨屬(Pyrus)植物，屬於落葉喬 木，原產於亞洲、歐洲及非洲等地，種類極多，全世界栽培地區亦很廣泛，
主要栽培種有西洋梨(P. communis L.; European pear)和沙梨(P. pyrifolia Nakai; Chinese sand pear or Japan sand pear)，目前許多商業化栽培品種 (commercial cultivars)皆屬於此二種。台灣梨栽培種為沙梨，依栽培之模式 可分為二類：一為高需冷性，如新世紀、幸水、豐水、新興、秋水、福壽、
雪梨等品種，需種植於高海拔山區，才能正常萌芽、開花、結果；另為低 需冷性品種主要是橫山梨，在低海拔地區即能正常開花結果(50)，最近30 年 來栽植橫山梨之果農流行以人為落葉方式進行產期調節，或以溫帶品種之 梨穗寄接橫山梨徒長枝基部，生產高品質之『寄接梨』以提高橫山梨產業 之經濟效益(49)。
梨葉緣焦枯病(Pear leaf scorch)為台灣低海拔地區(海拔 1200 公尺以下) (sycamore)、桑椹(mulbery)、柑桔(citrus)及咖啡樹(coffee)等(11, 21, 25, 26, 44, 53, 69, 77)，其中許多病害造成產業之嚴重損失，最典型例子如北美葡萄皮爾斯病 (Pierce’s disease, PD)及南美柑橘斑駁黃化病(citrus variegated cholorsis, CVC)，目前為北美葡萄與巴西柑橘產業主要限制因子(40)。有關X. fastidiosa 之歷史沿革，1892 年時 N. B. Pierce 首先於美國加州地區(California)發現葡 萄(Vitis vinifera L.)之 PD 病害，由於此病在美國東南部發生相當嚴重，導致 由歐洲引進之葡萄樹種大量死亡，造成農民重大損失(32)，爾後發現此病可 物引起。其後Hopkins 和 Mollenhauer 藉由電子顯微鏡觀察病株導管組織時 發現有病原菌之存在，由於其形態及細胞壁構造與 Rickettsiaceae 極為相 似，故稱此病原菌為“Rickettsia-like bacteria (RLB)”由於此類病原菌存在於 導管又稱侷限導管細菌(38)。然而此病原菌直到 1978 年 Davis 等人(18)利用 JD-1 培養基才可以人工培養，並完成柯霍氏法則，使得有關此菌之研究範
疇更為廣闊。1987 年 Wells 等人(78)根據DNA 的 G+C 比、血清學(serology) 資料、脂肪酸(fatty acid)分析及 16S rRNA gene 等分析結果，指出此病原菌 並非 Rickettsiaceae，亦不屬於其它病原細菌，因而建議給予此類侷限導管 細菌一新的名字Xylella fastidiosa，以建立一新屬(genus)及此一新屬中唯一 的一種(species)。
目前全世界X. fastidiosa 所引起的病害，已被證實的寄主植物超過 145
種(35, 37, 40)，這些來自不同寄主植物之X. fastidiosa 菌株，依交叉接種試驗資
料似乎可再細分為病原型(pathotype)，例如來自於葡萄、苜蓿及杏仁之菌株 稱為PD 菌群，來自柑橘及咖啡之菌株稱為 CVC 菌群，來自桃樹及李樹之 菌株為同一菌群(66)，而其他寄主植物之X. fastidiosa 菌株目前仍缺乏交叉接 種試驗之資料，主要受限於傳統之交叉接種試驗耗時費力，同時X. fastidiosa 為國際檢疫病原菌其菌株不易取得，另一方面X. fastidiosa 不易培養且生長 速度緩慢，無法應用傳統之生理生化特性進行種內菌系的鑑別。
梨葉緣焦枯病病徵學
梨葉緣焦枯病罹病株田間病徵於每年6-7 月(寄接梨果實採收期)開始出 現葉緣焦枯，主要特徵是葉片邊緣及葉尖處出現褐化現象，褐化部分會轉 為焦枯，有些鄰近健全葉片組織會有黃化現象，褐化之部位會逐漸向葉之 中肋方向擴大癒合，焦枯之面積有些僅佔葉之小部分，較嚴重者可達葉面 積一半，並會提早落葉，罹病枝條隨著季節發展葉緣焦枯之葉片會漸增加，
徒長枝之葉片通常至8-9 月才開始出現病徵，由下位葉逐漸往上出現葉緣焦 枯之趨勢(圖一)；罹病的枝條逐年有明顯生長受阻，罹病株高接之果實較 小，影響產量，嚴重者枝幹會逐年枯死，最後整株會逐漸死亡(48)。
X. fastidiosa 引起植物病害主要造成之病徵包括葉片邊緣焦枯、葉片離 層產生、枝枯、延緩植物生長和植物活力衰弱導致死亡，其致病機制，一 般學者皆認為病原細菌及植物之充塞細胞(tyloses)與膠質(gum)阻塞罹病植
物之導管(8, 53, 54, 55, 58)，導致水份壓力(water stress)之產生，促使植物輸送水
份之功能失調(3, 22, 23, 33, 53)，此論點亦衍生出植物毒素(phytotoxin)(45, 53, 68)和
生長調節劑失調(growth regulator inbalance)(23, 34)兩個假說(hypotheses)來解 釋其致病機制，但確實之原因仍需更多之證據證實。
梨葉緣焦枯病根據電子顯微鏡觀察，病菌聚集在輸送水分之導管內，
部份或全部阻塞(圖二)，導致罹病株寄主生理代謝失調，因而每年寄接梨採 收期顯現葉緣焦枯之病徵？依據農委會張淑賢處長之分析結果，罹病株表 現葉緣焦枯之葉片與正常葉片比較，顯示罹病株有明顯缺鉀現象，但鈣、
鎂略有增加，其他營養成份並無差異，但施用鉀肥並無法減輕其病徵之表 現，顯示罹病株病徵之表現是病原菌棲息寄主之導管才引起梨樹生理失調 所致。
梨葉緣焦枯病原菌特性
梨葉緣焦枯病由侷限導管細菌X. fastidiosa 所引起，細菌為革蘭氏陰性 菌 (Gram-negative)、桿狀(rod-shaped)、具有波浪狀細胞壁(ripple-cell wall)，
大小約0.2~0.5×1.1×3.4 μm，病原菌在 PD3、PD2、BYCE、PW 和 CS20 五 種培養基皆能生長，但在一般性培養基仍無法生長，在 PD2 固體培養基之 菌落形成圓形突起，乳白色，具平滑邊緣，培養14 天達 0.1~0.2 mm 大小(46,
48)，梨葉緣焦枯病罹病株條全年皆可自枝條莖部汁液分離到病原菌，其月 平均分離率 4％~85％，顯示病菌整年皆可存活枝條內，由分離率之變化，
枝條內病菌從每年10 月至翌年 1 月為高峰期，而 3 月至 5 月為低峰期，罹 病株葉柄亦可分離到病菌，但需葉緣焦枯病徵出現時才能成功分到病菌，
顯示葉片內之侷限導管細菌，在葉片生長中期後才由枝條移動進入葉片 內，但根部汁液無法成功分離到病菌(74)。
有關X. fastidiosa 病原菌成功培養沿革，1978 年底 Davis 等人(18)首次利用JD1 培養基成功分離到造成 PD 及 ALS 之病原菌後，為改進病原菌於培養基上 之生長速度和狀況，1980 年 Davis 等人(20)將JD1 培養基加以修正而發展出 培養效果較佳之 PD2 培養基，隨後 1981 年 Davis 等人(19)又將 PD2 培養基 加以修改，以potato starch 取代 PD2 培養基中之 BSA 成份，並命名為 PD3 培養，及將 PD2 培養基中之 BSA 改為 charcoal，並命名為 PD4 培
A B
圖一、梨葉緣焦枯病病徵(A)葉片不同程度葉緣焦枯病徵(B)罹病梨樹枝條呈 現葉緣焦枯病徵。
Fig. 1. Symptoms of pear leaf scorch. (A) Different degrees of scorch symptoms on leaves. (B) Leaf scorch symptoms on the twings of diseased tree.
圖二、梨葉緣焦枯病侷限導管細菌棲息梨樹組織導管內之情形及其微細構 造之照片。
Fig. 2. Micrographs of xylem-limited bacteria found in pear tissues with leaf scorch and its ultrastructure. Left- (A) Cross section shows bacterial aggregate in tracheids (arrows) of leaf lateral vein tissue; and (B) longitudinal section shows total occlusion of tracheid by bacterial aggregate. (C) Cross section shows partial occlusion by bacterial aggregate and (D) strandlike structure (arrows) a associated with xylem-limited bacteria.(Bar= 3 μm). Right-Ultrathin sections shows rod-shape and ripple-walled cells (arrow) in (A) diseased tissue and (B) axenic culture. (C) Cultured bacterium by negative stain. (Bar= 0.3 μm).
養基，此兩種培養基培養效果與PD2 培養基效果一樣佳。此外由於 JD1 系 列培養基無法培養phony peach disease 及 plum leaf scald，故 Davis 等人又 針對此兩種病之病原菌開發出 PW 培養基，而同年 Wells 等人(79)亦同時針 對以上兩種病之病原菌開發出組成份不同於 PW 培養基之 BCYE 培養基。
爾後Chang 和 Walker(10)也開發出另一種類型之培養基，稱為CS20 培養基，
用於分離培養造成oak leaf scorch 之病原菌，由於 X. fastidiosa 屬於難分離 培養之細菌，加上對此菌之生長條件所知有限，因此以往所開發出之常用 培養基中皆含有未確定組成份之物質，造成了對於此菌之營養需求、代謝 過程及可能之生物合成機制皆無法探討，直至1993 年 Chang 和 Donaldson(9) 才成功開發出化學組成份確定之培養基(chemically defined medium)，稱之為 XF-26 培養基，使能對此菌之營養需求有更進一步之了解。雖然過去 X.
fastidiosa 病原菌生長需特殊成份，但亦有報告(12, 24, 44)指出 mulberry leaf scorh 和 PD 病害之有些菌株能成功在 nutrient agar(NA)上生長，似乎此二種 寄主菌株營養需求較X. fastidiosa 其他不同寄主菌株較不嚴苛？
梨葉緣焦枯病菌經由嫁接途徑可成功傳播至健康梨樹(48)，同時田間觀
梨葉緣焦枯病菌經由嫁接途徑可成功傳播至健康梨樹(48)，同時田間觀