C YTOCHROME P450 2C19 基因型判定

（一） 萃取去氧核醣核酸 (DNA)之方式

1. 將 9ml RBC Lysis solution 加入 15ml 離心管，將 3ml whole blood sample 混合，均勻搖晃數次。

2. 以 3000rpm 離心 15 分鐘後倒掉上清液，加入 6 ml RBC Lysis solution 均勻搖晃，以 3000rpm 離心 15 分鐘。

3. 倒掉上清液後，加入 Proteinase K 20μl 與 3 ml Cell Lysis solution，上下劇烈混合約 20 秒。

4. 置於 37℃水浴槽，靜置整個晚上(overnight)。

5. 加入 RNAse 15μl，稍稍震盪後，置於 37℃水浴槽 15 分鐘，

然後在室溫冷卻。

6. 加入 1ml Protein Precipitation solution， 均勻搖晃，置於 4℃冷卻 30 分鐘，使其作用完全。

7. 以 3000rpm 離心 25 分鐘。在沒有污染的前提下，把上清 液吸取至新的15ml 離心管，加入 3ml isopropanol 均勻搖 晃，等待核酸盡可能聚集。

8. 可看見棉絮般懸浮時，以 3000rpm 離心 25 分鐘。倒掉上 清液，加入1ml 70% ethanol。

9. 把 DNA pellet 吸到新的 1.5ml eppendorf tubes。以 12000rpm 離心10 分鐘。之後小心地倒掉上清液，以 12000rpm 離心 5 分鐘。

10. 小 心 地 吸 除 殘 餘 上 清 液 ， 風 乾 15min ， 再 加 入 DNA Rehydration solution，置於 37℃ 水浴槽，靜置整個晚上 (overnight)。

11. 以分光光度計 (Spectrophotometer) 測量於 260 nm 紫外光 波長之比值，以判斷所萃取到之DNA 的品質。

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（二）

(Genotype) 之測定

1. 患者將於內視鏡治療後的第一天接受抽血檢查並留取 Genomic DNA。

2. 聚合酶鍊鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)材料 Genomic DNA 100 ng

VAS Taq 10X buffer 2.5 μl VAS Taq polymerase 0.3 μl dNTP (2.5mM) 2.5 μl

Forward primer (10μM) 0.5 μl Reverse primer (10μM) 0.5 μl

蒸餾水 16.7 μl

Total 25μl

3. Primers Exon 4

Forward primer 5’-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3’

Reverse primer 5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’

Exon 5

Forward primer 5’-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3’

Reverse primer 5’-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3

4. PCR 反應環境

1 cycle 94℃ 7 min 35 cycles 94℃ 45 sec 35 cycles 46℃ 45 sec 35 cycles 72℃ 1 min

1 cycles 72℃ 10 min

PCR 儀器：PTC-100 Programmable Thermal Controller ( MJ Research Inc, MA, USA)

5. 限制酶截切片段長多樣性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)材料

PCR 產物 2.0 μl

VAS Taq 10X buffer 2.0 μl

Bam HI (10U/μl) 1.0

Sma I (10U/μl) 1.0

6. 利用萃取得到的DNA依上述條件進行聚合酶鏈鎖反應。

7. 聚合酶鏈鎖反應的產物分別以Bam HI及Sma I在25℃作用3 小時，將產物在3%的洋菜膠，100 伏特電壓，30 分鐘，進 行洋菜膠體電泳分析。

8. 取出洋菜膠體，以EtBr 將洋菜膠體染色及去染色後，於紫 外燈光下觀察經PCR-RFLP 後之banding types，藉此判定檢 體為何種基因型。

9. 依PCR-RFLP的產物進行判讀，exon 4若只有一條未切的329 bp (Base pair)片段，則為A/A 同型合子(Allele)，即mutation type，基因型以m2/m2 表示；若同時出現329 bp 及被切的

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239 bp 和90 bp 三個片段，則為G/A 異型合子，基因型以 m2/wt表示；若只出現239 bp 及90 bp 兩個片段，便是G/G 同型合子，即wild type，基因型以wt/wt 表示。

10. 依PCR-RFLP的產物進行判讀，exon 5若只有一條未切的 169 bp片段，則為A/A 同型合子(Allele)，即mutation type，

基因型以m1/m1 表示；若同時出現169 bp 及被切的120 bp 和90 bp 三個片段，則為G/A 異型合子，基因型以m2/wt表 示；若只出現120 bp 及49 bp 兩個片段，便是G/G 同型合 子，即wild type，基因型以wt/wt 表示。

11. CYP2C19 的基因型須綜合第四及第五表現序列的基因型 來判定；故可得6 個基因型: wt/wt (wt/wt 和wt/wt)，wt/m1 (wt/m1 和wt/wt)，wt/m2(wt/wt 和wt/m2)，m1/m2 (wt/m1 和 wt/m2 或m1/m1 和m2/m2 或m1/m1和wt/m2 或wt/m1 和 m2/m2)，m1/m1 (m1/m1 和wt/wt)及m2/m2 (wt/wt和m2/m2)。

其中wt/wt 歸類為homozygous extensive metabolizer (以下 簡 稱 homEM) ； wt/m1 和 wt/m2 歸 類 為 heterozygous extensive metabolizer (以下簡稱hetEM)；m1/m2、m1/m1 及 m2/m2 則歸類為poor metabolizer。(如圖五)

六、 Pantoprazole 的治療

內視鏡檢查與處置後，受試者將安排住院追蹤並隨機分配接受高劑 量 或 標 準 劑 量 之 氫 離 子 幫 浦 抑 制 劑 － －pantoprazole (Pantoloc, ALTANA PHARMA AG, Germany)。高劑量組將在 Pantoloc 八十毫克快 速靜脈注射後，給予每小時八毫克的Pantoloc 靜脈注射；標準劑量組則 接受每二十四小時四十毫克之Pantoloc 靜脈注射，兩組受試者皆接受七

十二小時靜脈注射氫離子幫浦抑制劑。七十二小時後，受試者每天口服 四十毫克Pantoloc 並追蹤三十天。追蹤結束後，若患者的快速尿素測試 或組織病理檢查呈陽性者將視為幽門螺旋桿菌感染，他們將接受為期七 天之幽門螺旋桿菌根除治療。