HPLC 分析

在初步化學分析方面，要以儀器偵測到反應物生成，一般來說可以使 用分光光度計、液相層析儀、氣相層析儀等儀器來分析。在吸收光譜的方 法中，化學物質在不同的波長之下，有不一樣的吸光值，而不同的化學物 質在同一波長之下，所能觀察到的吸光值也不同，因此若是利用分光光度 計的吸收光譜來作為輔助分析化學反應的工具，可以將混合化學物掃全波 長，就化學物反應之後，由於結構上的改變而使有最大吸收值的波長改 變，來判定是否有反應發生或是新物質的生成。但是因為使用分光光度計 沒有觀察到明顯的波長位移，因此本研究參考了文獻回顧中提到的 Lin et al. (2003) 使用高效率液相層析儀(HPLC)分析混合毒化物的文獻，選定了 HPLC 作為本研究化學分析的主要工具。Lin et al. (2003) 在其研究中，使 用 HPLC 分析 malononitrile 與長鏈醛類，並偵測出混合後有第三物質的出 現，解釋了 malononitrile 混合長鏈醛類之後，會有交互作用產生，生成一 酸性物質，而使得在 microtox 毒性試驗的螢光菌上，呈現一毒性增強的效 應。

本研究利用 HPLC 分析中，不同化合物經過分離管柱，也就是固定 相，所需要的停留時間不同，而在連結的電腦螢幕上出現的偵測訊號 peak 的時間不同，此種定性的原理，來分析苯胺類以及醛類在單一存在和混合 之後的 peak 出現情況，觀察是否在混合之後會出現第三種化學物質的 peak，或是原本單一分析的結果和混合分析的結果訊號比較之下有無差 別，進而探討苯胺類和醛類產生的交互作用。

本研究使用 Photodiode Array Detector 作為偵測器，分離管柱為 C18 管柱，混合分析的濃度以進行 Microtox 混合毒性試驗的濃度來分析，單一

分析的部份也是使用和在混合試驗中同濃度的單一化學物質來分析，以便 比較其訊號值有無增減。而在這裡要說明，對於醛類的標準分析方法為 DNPH 衍生法，需要使用採集揮發的醛類氣體，並加入衍生試劑，才能在 HPLC 上觀察到醛類的偵測訊號，否則無論使用任何分離管柱或是任何移 動相皆無法在實驗濃度的情況下偵測到本研究中所使用的醛類化合物。但 如此一來，加入衍生試劑會使得混合毒性的分析更為複雜，因為無法確定 新物質的產生是否為衍生試劑所造成，因此，本研究利用適合苯胺類在混 合試驗濃度下的 HPLC 分析條件來進行分析，主要觀察苯胺類的 peak 變化 情形以及新物質的 peak 是否產生。在參考文獻還有進行分析試驗的測試 下，得知苯胺類在 205nm 的波長以及在 60%甲醇/40%去離子水的移動相 沖提之下，可以觀察到明顯易辨認的最大的訊號值，因此以此固定作為所 有分析的條件，以便比較訊號值的差異。

本研究以上述條件進行了 3-chloroaniline +甲醛、3-chloroaniline +戊二 醛、4-chloroaniline +甲醛、4-chloroaniline +戊二醛、3,4-dichloroaniline + 戊二醛五組的單一以及混合分析，這些組別都是在混合試驗結果中，不符 合 RA 模式預測而呈現相加或拮抗的混合組別。在這些混合物質的分析 中，除了苯胺的 peak 之外，並無發現其他新物質的 peak 產生，但並不能 就此直接推斷苯胺和醛類混合時，沒有化學反應發生，有可能是因為分析 時的條件，例如偵測器的極限、新物質的結構是否能被偵測器偵測到、移 動相的種類和比例、管柱的種類、分析時的移動相流速等因素，導致生成 物新物質無法顯現出 peak，亦或是新物質 peak 出現的時間和苯胺類的出 現時間太接近，偵測到的 peak 無法分離而無法辨別是原來的苯胺或者是新 的生成物。而在參考的 Lin et al. (2003) 這篇文獻當中，作者在分析

malononitrile 與醛類之前，先將此兩種毒化物經過一連串的前處理，包括 將 malononitrile 與醛類加上膠體粒子一貣混合攪拌(因為膠體粒子能促進

浴，並混合搖晃 24 小時，最後再使用 HCl 將 pH 值調整至 2.5 的酸性情況，

經由這些前處理之，才能在 HPLC 上觀察到 malononitrile 與醛類混合後產 生的新物質 peak。因此能否觀察到有第三種物質的生成，除了 HPLC 的分 析條件是否符合生成的新物質所能被偵測到的條件，還要考慮到生成物的 peak 是否能和反應物的 peak 分離到我們能夠觀察到的程度，並且新物質 的生成是否受到環境的影響，是否要經過某些環境的調整才能完整地生 成，而在毒性試驗中環境是否能成功再造，而用在分析的情況下，這些都 是影響到 HPLC 能否偵測到新物質產生的問題。

雖然在本研究的 HPLC 分析當中，並無發現新物質的 peak 出現，但就 單一和混合分析中的 peak 面積變化，也是可以觀察苯胺類和醛類混合之 後，反應物訊號的改變，推測反應物量的變化，進而探討有交互作用產生。

本分析研究中所使用的分析濃度符合 Microtox 混合毒性試驗中的濃度。

由於考慮到背景值的干擾，以及背景物質的脈衝，因此先進行了溶劑 的 HPLC 分析。因為毒化物溶液皆以去離子水為溶劑配製而成，所以先要 分析去離子水在本研究設定的條件之下，HPLC 偵測出來的脈衝曲線變 化，如圖 5.3.2.1 所示，由於訊號值非常低，圖形呈現非常雜亂的情形，單 位的範圍也在非常小的數值內，而在圖 5.3.2.2 可以發現戊二醛的脈衝圖和 去離子水非常相似，皆在一非常小的數值範圍內跳動，觀察不到特別高的 脈衝。這是因為先前提到的醛類的標準分析方法為 DNPH 衍生法，無法在 不加入衍生試劑反應的情況下在 HPLC 上觀察到 peak，因此在本研究設定 的條件下，戊二醛在 HPLC 的分析結果看貣來和背景值是一樣的。而由於 在 Microtox 的試驗中，必須添加滲透壓調節液(Microtox Osmosis

Adjustment Solution ; MOAS)來調整實驗環境成為適合海洋發光菌的環 境，其成分為 22%的食鹽水，因此在 HPLC 分析當中，也把 MOAS 加入 分析，使其儘量符合 Microtox 毒性試驗的環境。圖 5.3.2.3 為 MOAS 的 HPLC 分析圖，可以清楚地在 1.652 分鐘的地方觀察到一面積為 767262 μV*sec

的脈衝，在多於五次的分析後，確定為 MOAS 在 HPLC 分析時會出現的脈 衝圖形。而在五組 HPLC 試驗當中，在 4-chloroaniline +戊二醛的分析發現，

混合後的 4-chloroaniline +戊二醛所能偵測到的脈衝，不論是在 peak 的高 度或是面積方面，皆比 4-chloroaniline 單一分析時的 peak 還要來得低，也 就是說，4-chloroaniline 在與戊二醛混合後，脈衝值大幅下降，甚至只有單 一存在時的十分之ㄧ。由 HPLC 的分析脈衝圖來討論，在圖 5.3.2.4，

4-chloroaniline 的單一分析圖可以看到，4-chloroaniline 單一存在時，peak 出現在 4.102 分鐘，peak 面積為 3173382 μV*sec，而加入 MOAS 後，可 能因為 MOAS 加的量非常少(如實驗步驟所述)，濃度並不算太高，所以在 圖 5.3.2.5，也就是 4-chloroaniline 加上 MOAS 的分析，並沒有觀察到 MOAS 的 peak 出現，依然只有 4-chloroaniline 的 peak，出現在 4.111 分鐘，面積 為 1321978μV*sec，相比之下面積有削減，但可能是因為加了 MOAS 而 溶液的性質改變的關係。再看到 4-chloroaniline +戊二醛的分析結果，即圖 5.3.2.6，可以發現雖然出現 peak 的時間是 4.153 分鐘，和單一只有

4-chloroaniline 時是差不多的停留時間，但 peak 的面積卻減少至 331631 μV*sec，幾乎是單一 4-chloroaniline 分析時的十分之ㄧ，降低的程度可以 非常明顯地觀察到；而在添加了 MOAS 的 4-chloroaniline +戊二醛混合分 析結果，即圖 5.3.2.7 也可以發現雖然 peak 出現時間是 4.214 分鐘，和前述 的 4-chloroaniline peak 出現時間幾乎一樣，但 peak 的面積卻也下降至只有 22937μV*sec，比沒有含 MOAS 的混合分析還要來得更低。

在 4-chloroaniline 如此明顯的變化之下，雖然無法觀察到新物質的 peak 產生，但可以藉由此分析結果推論 4-chloroaniline 在與戊二醛混合之後削 減的量，可能產生了會降低海洋發光菌抑制的物質，而使得混合毒性呈現 減弱的現象，所以與模式預測的毒性效應不符合。即使此物質並不能在實 驗設定的分析條件下被測得，但在前述相關的文獻的探討之下，是可以推 論苯胺與醛類存在著可能發生交互作用的機會非常大，並且影響了

Microtox 毒性試驗的毒性效應，使得混合毒性效應較模式推測要來得弱。

並且雖然在加了 MOAS 的情況之下，HPLC 的分析結果並沒有很劇烈的改 變，但是不能排除化學物和 Microtox 試驗中所使用的海洋發光菌之間，是 否有更複雜的生物反應作用，或是與海洋發光菌生物體內的酵素影響有 關，其酵素可能促進了某些反應的發生，使得發光抑制降低，表現出來的 毒性效應也受影響而減弱。

對於其他沒有偵測到濃度改變或者是新物質 peak 產生的混合毒性試 驗組別，並不能完全排除化學物質間交互作用反應的可能性。在 HPLC 的 分析方面，化學物質在偵測器上觀察到的 peak 常和管柱固定相有很大的關 係，固定相的吸附能力是造成化學物在管柱中停留時間不同的主要原因，

若是新物質的產生和該管柱之間的作用力非常強，則有可能會有無法沖提 出管柱的可能性，如此一來，我們也無法在偵測器上觀察到新物質的 peak，而只能觀察到原物質 peak 的訊號值下降。另外還有個可能性是新物 質生成的濃度太低，無法被 HPLC 分析出來，或者是在兩化學物間之化學 反應相關的官能基變化，並不能被此分析偵測條件給測得，比方說，此條 件是適用於偵測烴基改變的反應，但可能在混合毒性內發生的反應是由硝 基的變化造成的，因此在這種情況下，便不能成功地測得化學反應發生的 情況。所以在沒有觀察到 peak 改變的 HPLC 分析圖，還是不能排除原物質 已經發生交互作用化學反應的可能性。

圖 5.3.2. 1 去離子水之 HPLC 分析圖

圖 5.3.2. 1 去離子水之 HPLC 分析圖