國 立 交 通 大 學
環 境 工 程 研 究 所
碩 士 論 文
反應性醛腈與極性麻醉含鹵素取代基苯胺之混合毒性試驗
Combined toxic effects of reactive toxicants and
polar narcotic toxicants - halogen - anilines
研 究 生: 廖 庭 宇
指 導 教 授: 陳 重 元 教授
反應性醛腈與極性麻醉含鹵素取代基苯胺之混合毒性試驗
學生：廖庭宇 指導教授：陳重元 國立交通大學環境工程研究所 摘要 本研究針對反應性類毒性物質-醛類與腈類，以及極性麻醉毒性物質-含鹵素取代基苯胺，以 Microtox 生物試驗進行混合毒性試驗，實驗結果顯 示，此兩類不同機制的毒性物質混合後，在劑量反應曲線之斜率較小與斜 率較大的毒化物混合結果部份，呈現拮抗的毒性效應；而在劑量反應曲線 之斜率較小的毒化物互相混合結果部份，則大部分產生相加或拮抗的毒性 效應，其交互作用主要為相加以及拮抗作用。根據非交互作用混合毒性理論 (Non-interactive multiple toxicity
theory；Christensen ＆ Chen, 1989)，不同機制且具平緩劑量-反應曲線之毒化 物混合應產生協同作用之混合效應，本研究所得之結果與上述理論有明顯差異。 推測本研究毒化物的混合可能產生化學物質間的交互作用 (Interactive)，因 此進一步使用高效率層析儀分析混合試驗的毒性化學物質，並參考相關文 獻的探討。而在高效率層析儀的分析方面，發現 Glutaraldehyde 以及 4-Chloroaniline 的混合組別分析中，與 4-Chloroaniline 的單一分析比較， 4-Chloroaniline 的訊號值大幅下降；相關文獻中也發現醛類和苯胺類容易 產生縮合化學反應，生成亞胺(imine)類物質；isobologram 中也發現
4-chloroaniline +甲醛、3-chloroaniline +戊二醛、3,4-dichloroaniline +戊二醛 的混合呈現不符合非交互作用理論的圖形，以及在質譜儀的分析方面，也 發現混合後的毒性物質產生了新的分子量，因此推斷本研究的混合試驗化 學物質間有可能產生化學性的交互作用而使得毒性呈現拮抗或相加。 本研究的混合毒性試驗中，得到了大部分為毒性下降以及相加性的結 果，即此兩類機制毒化物混合後對環境的衝擊減小或和個別單一存在時對 環境的衝擊相同。而在非交互作用理論之下的混合毒性預測和試驗結果不
完全符合之情況下，混合毒性的探討也要將兩毒化物間的交互作用納入考 量，這使得毒化物的混合呈現更複雜的混合效應。
Combined toxic effects of reactive toxicants and polar
narcotic toxicants - halogen - anilines
Student : Ting-Yu Liao Advisor : Dr. Chung-Yuan Chen
Institute of Environmental Engineering National Chiao-Tung University
Abstract
The combined toxic effects of reactive organic toxicants (aldehydes or nitriles) and polar narcotic halogenated anilines were evaluated using the Microtox test. The effects of the mixtures of the above compounds, which contain different mechanisms of toxicity, were investigated using
equit-toxic-ratio tests and isobologram analyses. Both less-than-additive and additive effects were observed from the above mixtures.
According to Non-interactive multiple toxicity theory (Christensen ＆ Chen, 1989), greater- than-additive (synergistic) effects will perform when toxicants have different mechanisms and flat concentration-response curves mixed. The toxicity test results of this research are not corresponding with the Non-interactive multiple toxicity theory. Due to the different toxicity effects, here assume that the interactive effect exist. HPLC (High-performance liquid chromatography), isobologram and MS (Mass Spectrometry) were used to analyze the toxic mixtures. The analysis results indicate there may be interactive effect among the toxic mixtures of this research.
Most of the mixtures evaluated by the present study revealed antagonistic or addictive effects; which indicates that the impact to the environment from the aforementioned mixtures are expected to be less severe or the same compared with the toxicants existed alone.
誌謝
這兩年的研究所生涯，真的說長不長，說短，好像也經歷了不少事情， 學到了不少新的觀念，也成長了不少。 首先要感謝老師，陳重元教授兩年以來的教導，讓我在研究的領域上 開闊了另一片視野，也學到了許多做研究應有的態度，以及在我的論文上 給予許多意見和指導，讓我能順利完成我的研究。並感謝我的口試委員趙 木榮教授以及林志高教授給予的許多寶貴意見和建議，對論文後續的研究 有很大的幫助，尤其感謝趙木榮老師和助理黃小姐細心協助並提供我使用 MS 分析，使我的論文能更加完整。以及要感謝董瑞安教授給予我化學分 析方面的知識和指引，讓我的研究有更多資訊可以參考。 也要感謝實驗室的學姊詔棻、欣妤、百珊，學長介華，給我的指導和 幫助，讓我可以在實驗室順利地學習實驗手法和研究。也謝謝我的同學心 渝和聖然，在研究所學習的日子總是常常一貣討論一貣思考，也一貣解決 問題。以及謝謝學妹萱芳，學弟家祥、思宏，在我做實驗時給我很多協助， 也度過很多愉快的時間。 當然還要感謝我的家人，包括爸爸、媽媽、奶奶、弟弟、所有兄弟姐 妹，幫助我解決的很多困難，作為我的支柱和活力的泉源。 還有在研究 所期間常常一貣上課和聊天的育安學姊，伶秀學姊，以及給予我非常多化 學分析方面幫助的姿吟學姐和小雞學姊，文彬學長、可韻、宛珊、俞如， 都十分感謝! 這段求學的期間雖然有辛苦但也有很多收穫，不但學習到很多東西， 也培養我有獨立思考和自我規劃的能力，我心中很感激有這樣的機會。目錄
中文摘要 ... i 英文摘要 ... iii 誌謝 ... iv 目錄 ... v 表目錄 ... vii 圖目錄 ... viii 第一章 前言 ... 1 1.1 研究緣貣 ... 1 1.2 研究目的 ... 2 1.3 研究內容 ... 2 第二章 文獻回顧 ... 4 2.1 細菌性生物毒性試驗 ... 4 2.2 Microtox 毒性試驗概論 ... 5 2.3 Microtox 螢光反應 ... 5 2.4 有機物毒性作用機制 ... 6 2.5 混合毒性 ... 9 2.5.1 非交互作用(Non-interactive)及交互作用(Interactive) ... 9 2.5.2 混合毒性研究之重要性 ... 12 2.5.3 混合毒性研究之模式 ... 12 2.6 毒性物質—苯胺類的介紹 ... 14 2.6.1 苯胺類化合物的基本特性 ... 14 2.6.2 苯胺類化合物的毒性與危害 ... 16 2.7 毒性物質—醛類的介紹 ... 17 2.8 毒性物質—腈類的介紹 ... 18 第三章 基本理論 ... 203.1 QSARs(Quantitive Structure Activity Relationship)毒性作用分類 : 20 3.1.1 非反應性有機物毒性機制 ... 20 3.1.2 反應性有機物毒性機制 ... 21 3.2 毒性物質劑量-反應模式及常用的單一毒性模式 ... 21 3.3 混合毒性理論 ... 23 3.3.1 混合毒性試驗指標 ... 23 3.3.2 非交互作用混合毒性模式 ... 24 3.3.3 交互作用混合毒性模式 ... 24 3.3.4 混合毒性效應參數 ρ 和 λ 值 ... 25 3.3.5 Isobologram ... 27 第四章 實驗設備與方法 ... 28 4.1 基本實驗設備 ... 28 4.2 Microtox 毒性試驗 ... 28
4.2.1 基本原理 ... 28 4.2.2 儀器構造 ... 29 4.2.3 基本配備 ... 30 4.2.4 標準分析程序: ... 30 4.2.5 Microtox 毒性試驗環境因子 ... 31 4.3 試驗毒物 ... 32 4.3.1 有機藥品配製 ... 33 4.4 實驗數據處理 ... 34 4.5 藥品混合方式 ... 34 4.6 高效率液相層析儀(HPLC)分析 ... 35 4.6.1 HPLC 原理 ... 35 4.6.2 儀器型號以及設定 ... 36 4.6.2 操作步驟 ... 36 4.7 質譜儀(MS)分析 ... 37 4.7.1 MS 原理 ... 37 4.7.2 基本分析程序 ... 37 4.7.3 儀器型號以及設定 ... 37 第五章 結果與討論 ... 38 5.1 Microtox 單一毒性實驗 ... 38 5.2 混合毒性試驗結果 ... 48 5.3 初步化學分析及探討 ... 53 5.3.1 苯胺類與醛類相關反應 ... 54 5.3.2 HPLC 分析 ... 56 5.4 Isobologram 分析 ... 64 5.5 質譜儀分析 ... 68 第六章 結論與建議 ... 72 6.1 結論 ... 72 6.2 建議 ... 73 參考文獻 ... 74 附錄一 單一毒性原始數據 ... 81 附錄二 混合毒性原始數據 ... 91 附錄三 HPLC 分析之檢量線 ... 99
表目錄
表 2.6. 1 苯胺類化合物之物化特性 ... 15 表 2.6. 2 苯胺類化合物之來源和用途 ... 16 表 3.3.4. 1 四種基本混合效應………..…………26 表 4.3. 1 反應性有機化學物質基本資料………...32 表 4.3. 2 麻醉性有機化學物質基本資料 ... 33 表 4.5. 1 混合毒性 1:1 濃度配製……….35 表 5.1. 1 試驗毒物之 Microtox 毒性試驗數據………..39 表 5.2. 1 Formaldehyde 及 Glutaraldehyde 和苯胺類之混合毒性結果 (TU=1:1) 之 1………49 表 5.2. 2 Formaldehyde 及 Glutaraldehyde 和苯胺類之混合毒性結果 (TU=1:1) 之 2 ... 50 表 5.2. 3 Propionaldehyde 及 Butyraldehyde 和苯胺類之混合毒性結果 (TU=1:1) ... 51表 5.2. 4 Acetonitrile 及 Malononitrile 和苯胺類之混合毒性結果(TU=1:1) ... 52
圖目錄
圖 2.4. 1 有機毒物的分類 ... 7 圖 4.2.2. 1 Microtox 螢光快速分析儀的 32 個槽其相關位置圖………..29 圖 5.1. 1 Formaldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線……….41 圖 5.1. 2 Propionaldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 41 圖 5.1. 3 Butyraldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 42 圖 5.1. 4 Glutaraldehyde 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 42 圖 5.1. 5 Acetonitrile 之 Microtox 劑量反應曲線... 43 圖 5.1. 6 Malononitrile 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 43 圖 5.1. 7 3-Chloroaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 44 圖 5.1. 8 4-Chloroaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 44 圖 5.1. 9 2,4-Dichloroaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 45 圖 5.1. 10 2,5-Dichloroaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 45 圖 5.1. 11 2,6-Dichloroaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 46 圖 5.1. 12 3,4-Dichloroaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 46 圖 5.1. 13 3,5-Dichloroaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 47 圖 5.1. 14 2-Bromoaniline 之 Microtox 劑量反應曲線 ... 47 圖 5.3.1. 1 亞胺生成反應結構圖……….55 圖 5.3.2. 1 去離子水之 HPLC 分析圖………61 圖 5.3.2. 2 戊二醛之 HPLC 分析圖 ... 61 圖 5.3.2. 3 MOAS 之 HPLC 分析圖(DT=1.652) ... 62 圖 5.3.2. 4 4-chloroaniline 之 HPLC 分析圖(DT=4.102) ... 62 圖 5.3.2. 5 4-chloroaniline(含 MOAS)之 HPLC 分析圖(DT=4.111) ... 63 圖 5.3.2. 6 4-chloroaniline 混合戊二醛之 HPLC 分析圖(DT=4.153)... 63 圖 5.3.2. 7 4-chloroaniline 混合戊二醛(含 MOAS)之 HPLC 分析圖 (DT=4.214) ... 64 圖 5.4. 1 3-chloroaniline +甲醛之 isobologram 分析圖 65 圖 5.4. 2 4-chloroaniline +甲醛之 isobologram 分析圖 ... 65 圖 5.4. 3 3-chloroaniline +戊二醛之 isobologram 分析圖 ... 66 圖 5.4. 4 4-chloroaniline +戊二醛之 isobologram 分析圖 ... 66 圖 5.4. 5 3,4-dichloroaniline +戊二醛之 isobologram 分析圖 ... 67 圖 5.5. 1 3-chloroaniline +甲醛(F) 之 MS 分析圖………68 圖 5.5. 2 4-chloroaniline +甲醛(F) 之 MS 分析圖 ... ..69 圖 5.5. 3 3-chloroaniline +戊二醛(G) 之 MS 分析圖 ... 69 圖 5.5. 4 4-chloroaniline +戊二醛(G) 之 MS 分析圖 ... 70 圖 5.5. 5 3,4-dichloroaniline +戊二醛(G) 之 MS 分析圖 ... 70第一章 前言
1.1 研究緣貣
近數十年來，越來越多毒性物質混合後之毒性效應研究一直在進行 中，這也反映出，來自工業廢水、家庭污水中不同來源且含有複雜非單一 有機毒性物質的廢污水，對水資源環境的影響及污染應被重視。這些複雜 的毒性物質，所呈現在水資源環境以及生物體中的毒性效應是綜合性的， 是多種毒性物質的綜合體，也因此當生物暴露於其中，所遭受到的是毒性 物質危害也是綜合性的。而對於這些放流污水的污染管制，國內現行只針 對單一毒性物質的放流濃度作為污染管制標準，但複雜成分的污水中潛在 的混合毒性效應，可能導致共同放流時的毒性濃度增強。假設水中之生物 對兩種符合法規濃度的毒性化學物質分別存在於水體時，並無受到毒害作 用，表示這兩種單一毒化物的濃度在水體生物的容忍範圍中，但當這兩種 毒化物在水體共存時，可能會發生毒性變化(相加、協同、拮抗)。如此一 來，並不能確定兩種毒化物共存於水體的情況不會對水體生物造成毒害。 因此對於這種非單一性化學物質釋放至環境中所牽涉的污染管制標準，應 需考慮其適用性是否足夠，而不同的毒性物質混合後的效應也須加以研究 及確認。 由於毒化物種類繁多，彼此的分類機制也大不相同，其中牽涉的生化 反應也相當複雜，因此要了解混合毒性效應，必須做大量的混合毒性分 析，累積毒性資料，花費大量的時間與財力才可得知。為了減少大量資源 投入毒性試驗中，環境毒物學在預測混合毒性變化方面有了許多研究產 生，大多選用 Concentration addition(CA)及 Independent action(IA)兩種模式 作用預測混合毒性的工具，本研究中也將利用此模式作為混合毒物的預估 模式，來和實際實驗結果做比較以及討論。而由於毒性化學物間有可能產 生交互作用，或是化學物與生物間產生複雜的作用，針對無法符合預測模 式的混合毒性物質，也將進行其反應機制或是交互作用的分析以及探討。在過去關於混合毒性的研究當中，大部分皆以探討非極性麻醉性毒化物之 交互作用為主，對於反應性物質與極性麻醉性物質之交互作用鮮少討論， 因此本研究選定了此兩類不同機制的有機物進行二元混合毒性實驗，並探 討不同毒性作用機制類別的有機毒化物在 Microtox 混合毒性試驗中呈現 的毒性作用變化，以及混合毒性作用對環境的衝擊變化。本研究選定的反 應性的毒化物，包括具強烈親電性的醛類(reactive electrophilic aldehyde)， 以及含有氰基的腈類(reactive cyanogenic nitrile);而極性麻醉性毒化物則選
定工業中常使用合成染料、農藥以及藥物的化學藥劑—極性麻醉性含鹵素
取代基苯胺(polar narcosis, chloroaniline / bromoaniline)。
1.2 研究目的
本研究主要之研究目的為: 取得反應性醛類及腈類混合急性麻醉性苯 胺類對 Microtox 之單一以及混合毒性試驗數據，以提供混合毒性結果予毒 性資料庫作為參考數據，並可作為毒性風險評估之參考資料。1.3 研究內容
本論文利用 Microtox 來進行單一及混合毒性試驗之研究，希望藉由實 驗結果和混合毒性理論的預測結果來做進一步的比較和探討，以作為環境 毒化物污染規範的參考，主要內容如以下所示: (1) 承續本實驗室對不同毒性作用機制之有機物的混合毒性試驗研究，本 研究選用兩類不同機制的毒物，反應性(reactive )，以及極性麻醉性 (polar narcosis) 作其混合試驗 ，以探討混合後毒性的變化情形，並了 解此類化學混合物對於水體環境之衝擊變化。 (2) 根據 Christensen ＆Chen (1989) 所發展的毒性預測模式，可藉由單一 毒性物質的 probit 分析結果來預測兩種毒性物質混合後的毒性變化情 形。本研究將利用模式預測的結果與實際 Microtox 混合毒性實驗之結果相比較，探討其預測之能力。
(3) 實驗結果與毒性預測模式預測的結果不符合之處，進一步藉由使用高 效率液相層析儀器、isobologram，以及質譜儀來分析其毒化物混合之 後是否產生化學反應及其他化學物質，並從實驗毒性化學物相關的文 獻來探討。
第二章 文獻回顧
2.1 細菌性生物毒性試驗
在眾多的標準生物毒性試驗物種當中，植物性浮游生物、動物性浮游 生物、珊瑚、甲殼類、無脊椎動物、水體昆蟲及軟體動物等，都是常見的 試驗物種。但是在時間的耗費上，細菌性的生物毒性試驗和上述的試驗物 種相比，不但較為迅速，並且操作較為簡便。舉例來說，Farre & Barcelo (2003) 文獻中提到魚類的毒性試驗常以 fathead minnow 或 rainbow trout 作為試驗物種，實驗需時 96 小時，並且需要有較大較特定的流水式實驗 裝置，毒性以半致死濃度(LC50)表示；而甲殼類常選用 Daphnia magna 或 Ceriodaphnia dubia 來作靜水式的生物毒性試驗，需時 24-48 小時，毒性以 半致死濃度(LC50)表示。而 Parvez et al. (2006) 文獻中也提到雖然魚類和甲 殼類作為生物毒性試驗的物種具有相當高的代表性和敏感性，但太耗費實 驗暴露時間，實驗裝置和人力的需求也較為龐大。因此細菌性的生物試驗 憑藉著暴露時間的大幅縮短，被選為許多毒化物和放流水毒性試驗中的試 驗物種。 細菌性的生物毒性試驗方法利用細菌的生命現象作為毒性試驗指標，
包括酵素活性、攝氧量、基質分解效率、ATP 含量等。Dalzell et al. (2002) 文獻中對毒性化學物和工業廢水放流水進行了五種快速的細菌性毒性試 驗來比較其相對的敏感性，包括了有硝化作用的抑制、呼吸作用的測定、 ATP 的發光測定、酵素的抑制、螢光菌的發光抑制。實驗結果中發現，以 螢光菌的發光抑制作為毒性試驗指標的敏感性為最高，並且在實驗的進行 時間方面，螢光菌的發光抑制試驗是最為迅速便利的。在很多的環境汙染 事件當中，時效性及經濟成本上的考量是最主要的因素，而細菌性的毒性 測試多具快速便利，培養容易，分布普及，成本較低的優點。
2.2 Microtox 毒性試驗概論
Patoczka & Johnson (1995) 文獻中提到，Microtox 為一種生物毒性試 驗的方法，其是以螢光菌的發光抑制作為毒性試驗終點的測試方法，毒性 暴露時間為 5-15 分鐘。此試驗方法發展於 70 年代後期，並在 80 年代早期 開始商業化販售作為毒性的篩選試驗方式之ㄧ。 細菌類對毒性物質的容忍度較高，故其毒性試驗普遍有敏感度低的缺 點。而 Microtox 使用的螢光菌是一種具高敏感物之物種，具有細菌試驗的 優點，且具有較佳的敏感性，除此之外，在 90 年代，Microtox 與其他生 物呼吸抑制的毒性試驗數據的相關性也被論證，更擴大了其運用於各種廢 水及污染物質的毒性依據 (Patoczka & Johnson, 1995)。螢光菌的運用由文 獻中可瞭解到其在環境的毒性試驗上具有重要性，和其他的毒性試驗比較 貣來，具操作迅速簡單方便、敏感度佳及再現性良好的優點，因此 Microtox 被廣泛地應用在廢水毒性監測及學術研究上 (Parvez et al., 2006)。除上述 特性，充足的學術研究文獻及研究成果實用的潛力，亦為本研究採用 Microtox 毒性試驗方法的重要參考。
2.3 Microtox 螢光反應
Microtox 主要的原理即是利用螢光菌的發光反應機制作為毒性試驗指 標，而藉由了解螢光的發光反應途徑，可了解其他生物發光的相似處。從 McElroy & Green (1955) 的研究中發現，發光反應進行時，有一長鏈醛與FMNH2參與;Cormier et al. (1956) 文獻中則指出此發光反應有一酵素的參
與; McElroy & Green (1956) 文獻中更進一步分別指出發光反應的進行組 成是被還原的 FMN、一長鏈醛、氧分子以及細菌發光酶。其反應式如下:
NAD(P)H + FMN + H+ → NAD(P)+ + FMNH2
上式中的 FMNH2 為還原態的 flavin mononucleotide，RCHO 則為醛
類物質，故許多研究藉由長鏈醛類的加入以增加螢光的反應，FMN 為氧 化態的 flavin mononucleotide，RCOOH 為低分子有機酸，luciferase 即為螢 光反應所需的酵素。由 Nealson et al. (1977) 之文獻得知，Luciferase 具備 一特殊的合成調節方法，稱為自動誘導機制(autoinduction)，螢光菌會產生 一個特殊物質-autoinducer，在生長時累積在培養液中，當 autoinducer 的量 達到一個 critical level，則 luciferase 的誘導即開始。有關於 Vibrio fischeri 的 autoinducer 則被鑑定為 N-β-Ketocaproylhomeserine lactone。
2.4 有機物毒性作用機制
在水體毒理學中針對現在的有機物性質分類出多種機制， 而大多數 的分類法是將化學物質分成可逆非特定型(reversible non-specific or general)
和不可逆特定型(irreversible specific) 兩類型。可逆非特定型之化學物質所 造成的毒性又可分為非極性麻醉型(nonpolar narcotic)和極性麻醉型(polar narcotic)，這類物質會以非特定的型式造成細胞膜出現孔洞，導致毒性物 質 可 以 進 入 細 胞 膜 內 產 生 毒 性 反 應 ； 而 特 定 型 毒 性 是 由 反 應 性 物 質 (reactive compound) 所 造 成 ， 追 究 其 致 毒 性 的 原 因 為 細 胞 的 受 體 位 置 (receptor site)遭受毒物攻擊，該位置的官能因為化學物質的作用而崩潰 (Gunatilleka & Poole, 1999; Akers et al., 1999)。Dawson et al. (2006) 以 Microtox 對 10 種軟親電性化學物質做混合毒性試驗，對可逆以及不可逆 的毒性作用反應做了整理探討，此文獻中也指出在 Microtox 的試驗中，可 逆反應為毒化物進入到細胞模雙脂層中，螢光菌細胞並未死亡，只是導致 細胞功能出現障礙，引貣了螢光反應的削減，而不可逆反應的毒性則為毒 化物導致螢光菌細胞的死亡而造成。 圖 2.4.1 是最常見的有機物分類方 式，由辛醇-水係數來進行歸類：
非極性麻醉型 (nonpolar narcotic) 非 反 應 性 有 機 物 (Non-reactive) 極性麻醉型 （polar narcotic) 親電型 （electrophilic nonelectrolytes) 前親電型（proelectrophilic nonelectrolytes) 反 應 性 有 機 物 (Reactive) 具氰基型（cyanogenic nonelectrolytes) 多機制型（multiple mechanisms) 圖 2.4. 1 有機毒物的分類 1. 非反應有機物(Nonreactive)毒性機制 一般又可稱為麻醉效應毒性（Narcosis Effect），本機制符合辛醇-水係 數模式，即與親脂性有關。親脂性屬物理作用，其描述生物暴露於某一程 度的劑量內，當毒性物質移去，生物原有抑制反應因此消失，毒性呈現可
逆反應，在 Veith et al. (1983) 的 fathead minnow 針對屬非極性麻醉型工業
化學物質的急毒性試驗中，就觀察到這類可逆型的效應，該效應產生通常 與非共價鍵交互作用（non-covalent interactions）有關，即細胞膜內的脂質、 蛋白質或兩者間的凡得瓦爾力的交互作用（van der Waals interactions）瓦 解有關。
現 今 工 業 中 所 使 用 的 有 機 化 學 物 質 大 多 是 屬 於 麻 醉 型 式 (narcotic mode)毒性物質，且又以非極性麻醉型有機物占的量又最多，下列針對麻 醉型有機物進行分類探討：
非極性麻醉型 (Nonpolar narcotic or Narcosis I)
物質所觀測到的毒性會與 QSAR 模式之辛醇-水係數所預測到的毒性 有良好的相關性，其毒性與辛醇與水分佈係數成正比，顯示毒性作用 主要來自親脂性，藉由覆蓋於細胞膜上造成生化通徑阻塞，或造成細 胞膜的「非極化」而形成毒性，因此稱這類型有機物為「非極性麻醉」 型。此外因為這類型毒物的毒性與辛醇-水係數迴歸有較佳相關性的毒 性，且毒性較與其它類型毒物還要低，便將其定義成基線毒性（baseline toxicity），而常見的化學物質有烷類、醇類、醚類、苯類或帶有鹵素 取代基等製藥業、農藥和染料等工業常用的物質 (Schultz et al., 1998)。Cronin (1997) 由其弧菌實驗中，發現此類物質不發生生物性
的反應，它們的毒性強弱和在作用位置（site of actionor reaction site）
的濃度有關。
極性麻醉型（Polar narcotic or Narcosis II)
Ren & Frymier (2002) 研究中認為這類型的化學物質毒性會較非 極性麻醉性毒物的毒性要高一些，而常見的毒物包含了氯酚類、硝基 苯類及本研究選用的苯胺類。由於這類毒物毒性較基線毒性高，原因 推測可能與其取代基的不同或是取代基的數目有關，Lin et al. (2004) 針對這類毒化物的取代基種類和取代機數目對毒性反應的影響也研
究發展出相關的模式。Jawecki & Sawicki(2002) 則指出這類型毒物主
要是含有可強烈釋放電子的氨基或氫氧根的芳香族，其表現的毒性約 為非極性麻醉性毒化物之毒性的 2 倍以上，Liao et al. (1996) 認為其 稍高的毒性可能和電荷有關。 2. 反應有機物(Reactive)毒性機制 這類型有機物除了具有非反應有機物毒性機制外，其官能基和生物體 內所產生之化學變化為主要之毒性來源，通常此類有機物質的毒性超過基 線毒性，比非反應有機物的毒性還要來的劇烈。Verhaar et al. (1992) 研究 中發現 reactive compounds 的毒性會大於 baseline toxicity 有數個 order 以
上。 反應性有機物其官能基具有強烈的親電性（Electrophile）能與生物體 內之酵素、反應位址之氨基及硫基產生鍵結、取代、錯合等之化學變化， 促使養分吸收、物質傳遞等新陳代謝循環之生化路徑因而受到破壞，造成 生命功能損壞。由於有機物質及生物體內之反應位址皆已產生化學變化， 反應鍵結能更大，無法像非反應有機物具有可逆性的效應，因此反應性有 機物質是屬於「不可逆毒性」。 Lipnick (1991) 將反應性有機物分為四類， 分別為反應性親電型毒性 （Electrophilic toxicity）、反應性前親電型毒性 （Pro-electrophilie toxicity）、反應性具氰基型毒性（Cyanogenic toxicity） 和反應性多機制型毒性（Multiple toxicity），而這四類代表生化作用如下:
(1) Electrophilic toxicity：主要由於有機物擁有的親電基(Electrophilic group) 和生物體內大型分子上的硫氧基等親核部分(Nucleophilic moiety )，產 生取代或相加反應而造成毒性。 (2) Pro-electrophilie toxicity：由於該類有機物經由一連串生化作用，將原來 物質轉變為 Electrophilie toxicity 的物質。 (3) Cyanogenic toxicity：由於毒物由水解或酵素活化放出氰酸離子而造成 毒性。 (4) Multiple toxicity：這類物質的毒性作用機制較為複推，複合各類官能基 的有機物，毒性作用機制可能是必須經過數階段或多重作用而形成毒 性的。
2.5 混合毒性
2.5.1 非交互作用(Non-interactive)及交互作用(Interactive)
混合毒性的研究早期由 Bliss (1939) 首先提出辨別混合毒性作用的量 化方法，針對單一毒性物質配合 probit 模式(常態分布函數)得到劑量-反應 曲線，依照曲線的平行與否來判定化學物質的混合毒性，並將毒性作用分成二種:
(1) 簡單相似作用(Simple similar action, simple joint action or concentration/ dose addition)：用來描述混合過程中化學物質間不會交互影響，且各化學 物質各會提供等比例的毒性單位，可用於了解同分異構物(isomer)和結構相 似物(analogue)。
(2) 簡單非相似作用(Simple dissimilar action, simple independent action or response addition)：指化學物質間不會影響彼此的在生物反應位置(reaction site)產生的反應，活體動物所受的毒性是各混合物的總和，而反應相加 (response addition)指生物產生的毒性反應必須等到毒物的劑量大於生物容 忍度才會顯現出來。
Plackett & Hewltt (1952) 提出擴充 Bliss 的理論，討論混合毒性作用的 相似性(similarity)和獨立性(independence)與毒性作用的關係，並使用二維 的常態分布函數計算，明確地定義出四種反應作用的型式: (1) 以兩化學 品首要 反應的作用 位置和 型式的相同 和不同 可分為相似 (similar)和不相似(dissimilar) (2) 在兩化學品前提下，其中一個化學品是否會或者不會去干擾另一化學 品 所 引 發 的 生 化 反 應 ， 而 可 分 為 交 互 作 用 (interactive) 和 非 交 互 作 用 (Non-interactive)
而基本上 Plackett & Hewltt (1952) 提出的混合毒性理論即是以非交互作用 形式的混合理論 (Non-interactive multiple toxicity theory) 為主，此理論表 示只討論化學物質與生理系統間的作用，而不討論化學物質間的作用，當 只討論兩種化學物質共同導致反應的發生，稱此特殊的反應為共同效應 (joint effect)。
Christensen & Chen (1985) 年再擴充 Plackett & Hewltt (1952) 的理 論，使其可應用於多維的混合毒性效應，並假設基本條件為皆為非交互作 用(Non-interactive)，遵循非交互作用理論 (Non-interactive multiple toxicity theory)。
但在近年來，有許多文獻也從化學反應和生化反應方面去研究混合毒 性 的 效 應 ， 即 表 示 有 些 毒 性 研 究 發 現 化 學 物 間 有 可 能 產 生 交 互 作 用 (interactive)，也就是在兩化學物間會互相干擾，進行反應產生新物質而對 毒性造成其他影響。Chen & Yeh (1996) 研究結果發現 malononitrile 與反應 性醛混合時，會產生明顯的協同情形；Lin et al. (2003) 將 Chen & Yeh (1996) 之研究結果作進一步分析，並利用高效率液相層析儀 HPLC 作為偵測儀
器，發現當 malononitrile 與長鏈醛同時存在時，醛易被 O2 氧化形成
carboxylic acids，此反應的生成物 pH 值極低，造成 Microtox 螢光菌的發光 抑制率上升，使得混合結果為毒性協同的現象。而 Lin et al. (2004) 對混合 毒性的研究中也提到，phenol 和 aniline 的二元混合中，可能也由於酸鹼中 和的化學反應而使實驗的毒性結果比預測的毒性來的低。以及在 Chen et al. (2010) 利用枯草芽孢桿菌所進行的三種苯二酚毒性化學物的混合毒性試 驗中，也提到了鄰苯二酚和對苯二酚混合時，會產生一種強親電性、強反 應性、會和蛋白質硫醇基反應的醌類物質，使得混合毒性呈現協同效應， 但與間苯二酚一貣混合的組別卻不會發生此種反應，而作者也把會產生醌 類物質的反應歸納為鄰苯二酚和對苯二酚產生了交互作用，如此一來，並 不符合混合毒性研究中非交互作用的假設。並且在 aniline 類的毒化物方 面，有部份也有降解的情況發生，在 Gosetti et al. (2010) 對 4-chloroaniline 的陽光降解毒性研究當中，有提到 4-chloroaniline 經由陽光照射後，會降 解產生複雜的聚合物，使得含有 4-chloroaniline 的廢污水排放更加複雜， 原物質和降解物混合之後的毒性也難以掌握。而在 Neuwoehner et al. (2010) 對農藥 diuron 所進行的降解毒性研究中，也提到了 diuron 會降解成 aniline 類的物質，並且降解物和原物質對藻類和水蚤所表現的毒性機制不同，顯 現出更複雜的混合毒性效應。因此，化學物在混合毒性研究中的複雜表現 使得預測混合毒性所要考慮以及研究的層面更多更廣。
2.5.2 混合毒性研究之重要性
在真實水體環境中，通常承受著非單一的毒性物質，呈現的是一種複 合性的汙染，即代表著水體中的多種毒性物質可能產生交互作用，引貣毒 性在混合後的變化。但許多環境法規對於水質標準的規範，只根據單一毒 性物質對於水中生物做毒性試驗後而訂定，如此的單一毒性規範對現今實 際環境評估的需求已無法滿足，加上近年來有些文獻，如 Neuwoehner et al. (2010) 對農藥 diuron 所進行的毒性研究中提到，毒性風險的計算方法應該 把毒性物質降解物的毒性也一併納入計算，顯現出在環境風險評估方面需 要考量更多不同放流物質的複雜混合毒性，或是原物質和降解物的混合毒 性。因此有必要針對毒性物質混合後，其毒性的變化作一深入研究，以制 定更完善的水體水質標準，確實達到保護水中生物之目的。2.5.3 混合毒性研究之模式
水體混合毒性目前採用的混合毒性理論源自於藥理學，此兩個基礎理 論為 Concentration addition (CA) 以及 Independent action (IA)。CA 表示混 合的毒物機制相同，毒性物質在生物體上作用位置相同，CA 的觀念可用 數學式子表示： 1 1
n i xi i EC c 。而 IA 則表示相互混合的毒物機制不同且毒 性物質在生物體上之作用位置不同，其若以數學式子表示則為： Emix=1-Π [1-E (cι)]。 (Hermens et al., 1984; Altenburger et al., 1996)在預測有機物的混合毒性這領域上，許多學者認為 Concentration addition(CA)模式擁有較高的預測能力，至於 IA model 則往往會低估混合 毒性 (Greco et al., 1995)。Broderius et al. (2005) 文獻中以 fathead minnow 作為有機物混合毒性試驗物種，以混合毒性結果比較 CA 與 IA model 的預 測能力。結果發現相同機制的毒性物質混合時，適用於 CA model，並且當 反應物質與其他作用機制毒物混合時，CA 預測出的毒性結果大部分較符 合實際實驗的結果，此結論與其他文獻結果ㄧ致，皆認為 CA 是個較恰當 的預測模式。Backhaus et al. (2004) 對殺蟲劑和抗菌劑進行的 Microtox 混
合毒性試驗，以及 Olmstead & LeBlanc (2005) 利用 Daphnia magna 對多環 芳香族的混合毒性試驗皆發現 CA model 對混合毒性的預測有高估的現 象，Arrhenius et al. (2006) 也發現 CA model 有高估毒性的現象，而認為 CA model 較適合用於環境風險的評估上。
但是在 Cedergreen et al. (2006) 用四種試驗物種對殺蟲劑和抗真菌劑 的混合毒性結果，評估 CA 及 IA model 的預測能力。Cedergreen 多考慮了 相似係數(λ)，其比較結果發現，當毒物的劑量-反應關係曲線(sigmoid log-logisitic dose-response curve)斜率落在 1.25 時 IA 與 CA 的預測能力幾乎 相同；若斜率小於 1.25，IA 預測力較佳，反之，CA 則為較適當的預測模 式。
在 Lin et al. (2004) 對 14 種非反應性有機毒化物做二元混合的毒性試 驗結果中發現，這些非反應性的毒性物質混合後多呈現相加性(additive)的
毒性反應。而在不同機制毒物間的混合試驗，Chen & Chiou(1995) 對非反
應性及反應性有機物，以 Microtox 做混合毒性研究。其結果發現，非反應 性有機物彼此的混合，若此兩種有機物具有近似平行的劑量-反應曲線，則 發生毒性減弱的機率最大;而非反應性和反應性有機物混合時，由於有機物 間兩種機制毒性反應位置差別大，故其實驗結果大致上為毒性消減作用 (antagonism)。Chen & Yeh (1996) 針對反應性有機物的混合情形做研究， 將反應性有機物依 Lipnick (1991) 的毒性作用機制分類將反應性有機物再 細分為四類(反應性親電型毒性、反應性前親電型毒性、反應性具氰基型毒 性和反應性多機制型毒性)。研究結果發現，機制相同之反應性有機物混合 時，以發生毒性相加及毒性減弱為主;不同機制且兩種反應有機物的劑量-反應曲線斜率甚小時，則出現毒性加強(synergism)的機率很高。而當此兩 種反應有機物中一者其劑量-反應曲線斜率為高時，易呈現毒性減弱的效 應。 本研究選取反應性毒化物與極性麻醉性毒化物做 Microtox 混合毒性 試驗，和上述文獻中的混合毒性結結果做比較，探討毒性物質的劑量-反應
曲線斜率和混合毒性效應間的關係是否和上述文獻中的結果一致。反應性 物質選用醛類及腈類作研究，極性麻醉性物質則選擇重要的化工原料-含鹵 素取代基之苯胺類。
2.6 毒性物質—苯胺類的介紹
2.6.1 苯胺類化合物的基本特性
苯胺類化合物為接有芳香基團的胺類，屬於極性化合物，具有低鹼度 和親核性性質，分子量大，且分子量越大者越難溶於水，揮發性高。苯胺 纇的 NH2官能基上具有孤對電子，易產生電子轉移的現象。本研究選用的 苯胺類為接氯取代基以及接溴取代基的苯胺，其中含氯的苯胺類選用了不 同取代基數目和取代基位置的七種氯苯胺，加上一種溴苯胺。 表 2.6.1 為 苯胺類化合物的基本物化特性，表 2.6.2 為苯胺類化合物的來源資料和主 要用途:表 2.6. 1 苯胺類化合物之物化特性 毒性物質 結構圖 分子量 (g/mole) 溶解度 (mg/l) 純度 特性 3-Chloroaniline Cl NH2 127.57 5400 99 % 無色至淺琥珀 色液體，遇光或 久貯則顏色變 深 4-Chloroaniline Cl H2N 127.57 3900 98 % 白色、淺褐色針 狀晶體 2,4-Dichloroaniline NH2 Cl Cl 162.02 620 99 % 白色結晶體 2,5-Dichloroaniline Cl NH2 Cl 162.02 300.3 99 % 白色針狀晶體 2,6-Dichloroaniline Cl NH2 Cl 162.02 294.5 98 % 無色晶體，易潮 解 3,4-Dichloroaniline Cl Cl H2N 162.02 92 98 % 褐色針狀晶 體， 3,5-Dichloroaniline Cl Cl NH2 162.02 784 98 % 白色至淺黃色 針狀結晶體 2-Bromoaniline Br NH2 172.03 949.1 98 % 黃色至紅棕色 液體
表 2.6. 2 苯胺類化合物之來源和用途 毒性物質 廠牌 供應商 主要用途 3-Chloroaniline Aldrich 友和 用於有機合成，染料、農藥、醫藥的 中間物 4-Chloroaniline Aldrich 友和 染料、農藥、醫藥的中間物，還可用 於生產彩色電影膠片的成色劑 2,4-Dichloroaniline Aldrich 友和 用於染料、農藥、醫藥的中間物 2,5-Dichloroaniline Aldrich 友和 用於顯色劑和有機顏料中間物，以及 製造氮肥增效劑 2,6-Dichloroaniline Aldrich 友和 用於染料、農藥、醫藥的中間物 3,4-Dichloroaniline Aldrich 友和 可作農藥和染料的中間物，也用作生 物活性組成的中間物 3,5-Dichloroaniline Aldrich 友和 用作農藥、醫藥中間物 2-Bromoaniline Aldrich 友和 有機合成中間物 苯胺類化合物在合成農藥、醫藥、染料的化工廠中是很常見的化學物 質，尤其是本研究所選用的苯胺類都是合成常用的除草劑以及殺蟲劑會用 到的原料。環境中的苯胺類化合物污染主要來自於化工廠，尤其是農藥製 造廠、製藥廠和印染工廠的放流水。如此普遍且大量的工業放流水中都有 苯胺類的毒化物存在，這樣的情況將環境造成超過自淨能力負荷的傷害。 (Argese et al., 2002)
2.6.2 苯胺類化合物的毒性與危害
苯胺類化合物是屬於極性麻醉性的毒性物質，其毒性主要來自於親脂 性，主要藉由覆蓋於生物細胞膜上，造成生化通徑阻塞，或造成細胞膜的 非極化而形成毒性。因此，用於描述疏水性的參數-辛醇與水分配係數 Log P，常用於此類親脂性毒性的極性麻醉性物質的毒性預測和相關性的探 討。(Chen & Lee, 2007)類進行單一和混合的生物毒性試驗，結果發現上述兩類極性麻醉性毒化物 的 Log P 值越大，毒性也越強。另外 Chen & Lee (2007) 利用了
Pseudokirchneriella subcapitata (月芽藻) 對含氯和溴取代基的苯胺類進行
了單一毒性的生物試驗，並比較了不同試驗物種對於苯胺類化合物的毒性 以及敏感性，結果顯示 Log P 和毒性間有良好的相關性。而 Chen & Lee (2007) 也提到取代基的數目越多，氯苯胺的毒性大部份有毒性增強的趨 勢，而在一氯苯胺的部份，對位比間位的氯苯胺毒性要來的強，因此也表 示取代基的位置關係也會對苯胺類的毒性造成影響。 苯胺類化合物對人體的毒性高，僅少量就能引貣中毒。主要是通過皮 膚、呼吸道和消化道進入人體，從而破壞血液造成溶血性貧血，損害肝臟 引貣中毒性肝炎，甚至導致各種癌症 (Pauluhn, 2004)。苯胺急性中毒的患 者口唇、指端、耳廓會產生青紫，有頭痛、頭暈、噁心、嘔吐、手指發麻、 精神恍惚等狀快；重度中毒時，皮膚、粘膜嚴重青紫，呼吸困難，抽搐， 甚至昏迷，休克。 出現溶血性黃疸、中毒性肝炎及腎損害，化學性膀胱 炎， 眼接觸引貣結膜角膜炎。而慢性中毒患者有神經衰弱的表現，伴有 輕度青紫、貧血和肝、脾腫大。
2.7 毒性物質—醛類的介紹
醛類化合物為含有-OH 官能基的碳氫化合物，本研究中選取甲醛、丙 醛、丁醛及戊二醛作混合毒性試驗。醛類具毒性、易揮發、不利長久貯存 等化學特性且具有高反應性的有機毒物，易聚合氧化，也容易與含氮化合 物產生反應。醛類的使用十分地廣泛，在化學製品方面，常被用作人造樹 脂的原料;也可用在殺蟲劑、除草劑、除臭劑及滅菌劑，在木材工業方面 常以醛類化合物做黏著劑，部分醛類也被運用在照片顯影劑當中，除此之 外，在橡膠合成廠也有醛類化合物的蹤影。除了工業用途外，醛類也運用 在醫療院所病理組織切片固定及保存、醫院解剖大體的保存等。在醛類大 量的使用下，若流入水體生態將會對環境造成嚴重的傷害。(O’Brien et al.,2005) 在毒性資料方面，進入人體的醛能和蛋白質的氨基結合，使蛋白質變 性，擾亂人體細胞的代謝，對細胞具有極大的破壞作用。同樣的，醛對人 體的危害也可分為急性及慢性兩部份，在急性部份，皮膚接觸醛類化合物 會刺痛、變色及產生過敏反應，眼睛碰觸時則會發痛、流淚。而長期暴露 在含有醛的空氣下則會造成慢性氣管炎，並且部分醛類會傷害生物體的 DNA。(Marnett, 1998)
2.8 毒性物質—腈類的介紹
腈類化合物為氰酸和含碳基結合的氰化物，有機腈類則當做溶劑或除 膠用，腈類本身毒性低，但吸收進人體經代謝後會產生氰根（CN-）造成 中毒，而且症狀是延遲產生的 (洪東榮, 氰化物中毒的診斷與救治)。本研 究選用劑量-反應關係曲線(sigmoid log-logisitic dose-response curve)斜率大 的乙腈(acetonitrile)以及斜率小的丙二腈(malononitrile) 作為混合毒性試驗 的反應性毒化物，希望能就不同斜率的反應性毒性物質和苯胺類混合後的 毒性效應做探討。 乙腈(acetonitrile)為無色透明液體，極易揮發，適合作為許多有機、無 機和氣體物質的溶劑。乙腈能發生典型的腈類反應，並被用於製備許多典 型含氮化合物，是一個重要的有機中間體。 乙腈可用於合成維生素 A，碳 胺類藥物及其中間體的溶劑，還用於製造維生素 B1 和氨基酸的活性介質 溶劑。 可代替氯化溶劑。 用於乙烯基塗料，也用作脂肪酸的萃取液 ， 酒精變性劑，在織物染色，照明工業，香料製造和感光材料製造中也有許 多用途。乙腈的中毒作用，主要由體內釋放 CN-所致，但不能排除乙腈本 身及其代謝產物硫氰酸鹽的作用，後者在慢性作用中更為重要。急性氰化 物中毒主要造成細胞或組織的缺氧，臨床表現就以缺氧及細胞因缺氧而產 生的酸中毒為主。而因為職業性或環境上的慢性暴露，可能會有呼吸困 難、頭痛、頭昏、噁心、嘔吐、聲音沙啞、口腔有杏仁味、眼結膜發炎、心悸、胸痛、體重減輕、無力感、睡眠障礙及心智變化等。(洪東榮, 氰化 物中毒的診斷與救治) 丙二腈(malononitrile)為無色結晶體，易潮解，主要用途為醫藥、農藥、 染料方面的有機合成原料。malononitrile 侵入人體的途徑為吸入、食入、 經皮膚吸收，其毒性類似氰化物。而氰化物的毒性作用為抑制細胞呼吸， 造成組織缺氧。
Chen & Huang (1996) 研究中，利用 Microtox 對含氰基的有機物做混 合毒性試驗，在結果中發現和 malononitrile 一貣混合的毒性效應主要呈現 強烈的毒性協同作用，而和 acetonitrile 一貣混合的毒性結果卻都呈現毒性 減弱的情況。而 acetonitrile 是屬於劑量-反應關係曲線斜率相當大的毒化 物，由於此斜率過大，在與其他有機物混合時，發生了 complex joint action， 此種新一類的毒性混合協力作用在 Chen & Chiou (1995) 的文獻中被提 到，此種狀況主要發生在兩個毒性物質的劑量-反應關係曲線斜率相差極大 時，兩者混合後會有毒性減弱的情況。因此，本研究選用此兩種腈類來作 毒性混合試驗，欲探討在其及苯胺類的混合效應結果是否也有相同的情況 發生。
第三章 基本理論
3.1 QSARs(Quantitive Structure Activity Relationship)毒性作用
分類 :
QSAR 主要的意義在於，以化學物質的物理或化學性質，推測或描述 其生化活性大小，即對生物體生化活動造成干擾的程度，而在物化特性與 生化活性間，找出一定的關係。QSAR 最早是應用在藥物學和醫學領域， 是用來預測藥物對生物體的反應，以研究更有效，副作用小、不同進入人 體途徑的方式。之後 QSAR 便發展推廣至環境毒物學的應用上，用以推估 毒化物進入環境中時，對環境可能造成的影響程度。而 QSAR 在毒性物質 的影響大小(如毒性數據)與毒物的物化特性(如分子鍵結與分子形態)之 間，建立ㄧ定的關係，如此在具有相似物化特性的毒物間，即可去預測其 對生物的生化活性反應如何。利用 QSAR 模式來分類毒性機制，可將有機 物分成兩大類，一為反應性(reactive)有機物，另一則為非反應性 (non-reactive)有機物。3.1.1 非反應性有機物毒性機制
非反應性有機分子進入生物體內後，並不直接參與生物體的生化反 應，此類有機物的分子會覆蓋在細胞膜上而造成生化路徑的阻塞，使得細 胞無法正常的代謝，而形成生化反應的抑制。而其覆蓋在細胞膜的行為主 要來自非反應性有機物的親脂性(lipophilicity)，即是此類有機物毒性表現 的來源。有機物的親脂性促使有機分子此種毒性反應類似吸附的行為，故 為可逆的毒性，並不直接和生物體反應。屬於這類的有機物通常為一些簡 單的非電解質有機物，而這類的毒性作用由於其反應的類型又稱為「麻醉 效應」(narcosis toxicity mechanism) ，一些簡單無複雜官能基的醇類、酯 類、酮類及醚類皆屬之。屬於麻醉性的毒性物質其毒性在毒性作用達穩定 的狀態下，與描述化學物質疏水性的參數-辛醇與水分配係數(Log P)成正比。麻醉作用機制又可分為極性(Polar)以及非極性(Non-Polar) ，本研究實 驗中選用的苯胺類皆屬於 Polar Narcosis。Verhaar et al. (1992) 認為極性與 非極性麻醉毒性效應的差異在於氫鍵鍵結提供酸性的強弱不同，極性麻醉 化合物通常比非極性麻醉物質劇烈，因此導致麻醉性物質的毒性比非麻醉 性物質來的高。
3.1.2 反應性有機物毒性機制
對於許多有機物，當其以辛醇與水分配係數去描述時，由於常呈現出 比所預估的毒性反應更激烈，此種有機物為模式的”outlier ”部分，其具有 超額毒性(exceed toxicity) ，此類具有超額毒性的有機物將之歸納為反應性 有機物。反應性有機物其毒性機制為化學物質直接參與生物體內之生化反 應，奪取其他物質反應的位置，藉由阻絕生化作用來造成毒性。由於生物 體內反應位址均已產生化學變化，故其毒性反應為不可逆。醛類和腈類屬 反應性有機物。3.2 毒性物質劑量-反應模式及常用的單一毒性模式
在毒性試驗中，當毒性物質對受體生物發生作用時，受體生物所受影 響或死亡的百分率，隨著毒性物質濃度而有所影響。通常毒性物質劑量對 於受體生物反應劑量會呈現成 S 曲線關係，稱之為劑量-反應曲線圖。若已 知毒物進入生物體內的量，則可稱為劑量反應關係，其中 x 軸為有機物濃 度，而 y 軸為反應百分比。在毒性試驗過程中，受測生物受毒性影響造成 50%抑制或死亡，則稱為 EC50 ( Effect Concentration 50%) 或 LC50 ( Lethal Concentration 50%)，不同的生物體對於不同的毒性物質有不同的斜率大小 的劑量反應關係。由於利用 S 型曲線求取 EC50（半致死濃度）並不容易，因此必需藉
由數學關係式將 S 型轉為直線型以便求取。不同的模式根據不同的理論發 展而成，其中最常見的毒性物質劑量-反應模式有 Probit、Weibull 及 Logit
三種，Christensen 曾經對這三種不同的模式做比較。這三種模式根據的是 不同的假設: Probit 模式假設受體生物對毒性物質的容忍度為常態分布，具 有統計上的意義，Weibull 模式是假設毒性物質與受體生物間產生化學鍵 結，至於 Logit 模式則為假設毒性反應形式如同某種酵素反應。下列為常 用模式之解釋: (1) Probit 模式：為最常用的劑量-反應模式，主要是由實驗所得，假設生物 對毒性物質的容忍度分布為常態分布(Log-normal distribution)，其主要以毒 性物質濃度之 log 值與反應率之 NED(Normal equivalent deviation)具有線性 關係為基礎，其中反應率即測試生物對毒性物質之反應比率（如死亡率
等）。此模式將劑量-反應模式之 S 型曲線，轉換成 NED 尺度上的一直線，
原來之劑量-反應曲線 50%反應率之處對應到 NED scale 上為零。84.1%反 應率之處對應為 1，而 NED scale 之座標值加 5 即為 Probit 的座標，Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下： Y ＝ NED ＋ 5 Y ＝ a ＋ b log（Z） P ＝ 0.5 [ 1 ＋ erf
2 5 Y ]其中，Y 為 Probit 的概率單位；a,b 為反應曲線之截距與斜率；Z 為毒 性物質所加之劑量；P 為生物體之抑制反應率，在本研究中以抑制 50 ﹪為主；erf 為數學上之 Error Function。
(2) Weibull：為機率-反應機制基礎（Mechanistic-Probability basis）模式， 發展根據毒性物質分子與受測試生物之受體分子間化學鍵關係所推演而 來，logit 模式相同皆假設毒性物質會在生物體內受體產生化反應。
(3) Logit： 由人口成長研究所發展而出的另一種模式，描述毒性反應中的 某種酵素反應( Enzyme Reaction），適用於自催化( autocatalysis ) 之化學反 應。
從 Chen and Chiou (1995) 所做的 Microtox 毒性試驗分析發現，Probit
及 Logit 模式較適合螢光菌的毒性分析，而 Weibull 模式的假設不能符合無 特定反應位址的麻醉性有機物。
3.3 混合毒性理論
3.3.1 混合毒性試驗指標
混合毒性研究常用的混合毒性效應指標有混合毒性單位（toxic unit， TU ）、 加 成 指 標 （ additive index, AI ）、 混 合 毒 性 指 標 (mixture toxicity index,MTI)。而本研究選用混合毒性單位，其說明如下： 1 1 50 Z M EC + 2 2 50 Z EC 其中 M : sum of toxic units 相加係數
Z1 : 毒性物質 1 的濃度 Z2 : 毒性物質 2 的濃度 Z1+Z2 : 造成 50% 的抑制 EC501 : 毒性物質 1 的 EC50 毒性容忍度 EC502 : 毒性物質 2 的 EC50 毒性容忍度 本實驗利用 TU 作為混合的毒性單位，至於判別混合的結果則以 95% 信賴區間為依據。相加係數 M 的意義如下:
M<1：毒性協同作用(greater than addictive,毒性增強)。 M=1：(95%信賴區間包含 1)毒性相加作用(addictive) 。
3.3.2 非交互作用混合毒性模式
Hewlett ＆ Plackett 於 1959 年提出非交互作用混合毒性，此為二維模 式，假設生物反應為 quantal(生或死)，且毒性物質間不能有交互作用，後 經多位學者研究，Christensen & Chen 於 1985 年擴充此理論，發展出可選 用 Probit、Logit 、Weibull 三種劑量-反應模式來分析並可考慮多種毒性、 營養物質交互作用之多維數學模式及預測混合毒性之應用程式(Multox) 。 毒性實驗中的存活率 Q(non-response fraction)其關係式如下所示(以二 維為例): 1 1 1 2 Pr( 1) Q 其中 Q: 生物不反應率(non-response fraction,即為存活率)。Q 值決定於機 率分布函數內積分區間的大小。 Pr: 機率分布函數，其函數值由括弧內積分區間定義式 1 1 1 2 ≦1 決定。
λ:相似係數(similarity parameter for the action of two toxicants on two
biological systems) 。用來描述兩化學物質作用位置的相似程度，且 0＜λ＜1，λ 越接近 1，表示毒性作用位置越相似。 Zi Zi i Zi：毒性物質 i 的濃度。 Zi：單一生物體對毒性物質 i 的毒性容忍濃度。
3.3.3 交互作用混合毒性模式
而 Hewlett 的交互作用理論擴充非交互作用理論，提出交互作用混合 毒性模式，因在某些情形下，不同毒性物質間的會產生交互作用造成毒性 增強。 Hewlett 認為相關係數 λ 可為 0 到無限大，λ 介於零到一之間為毒性減弱作用，λ 等於一為毒性相加作用，λ 大於一則為毒性增強作用，值 的大小即為這些混合毒性效應強弱的度量。交互作用混合毒性模式積分區 間定義式為: 1 1 1 2 ≦1 ，λ>1
3.3.4 混合毒性效應參數ρ和 λ 值
本實驗混合毒性效應的指標為相關係數（correlation coefficient ,ρ） 和相似係數（similarity coefficient , λ），以下為ρ和 λ 兩參數的介紹:(1) Correlation Coefficient: 此係數最早由 Hewlett & Plackett (1959)提出，其 假設兩毒性物質的機率分佈函數為二維常態分佈，而其毒性容忍相關係數 為ρ，即描述單一生物體對毒性物質 1（EC50,1）和毒性物質 2（EC50,2） 毒性容忍濃度的相關性; ρ值範圍介於-1 至 1 之間，ρ= 1 表示兩毒性物質 容忍分布為正相關，ρ= -1 表示兩毒性物質之容忍分布為負相關，ρ= 0 則表示兩毒性物質之容忍分布為不相關。 (2) Similarity Coefficient : 此參數描述兩毒性物質作用在生物體的位置或 生化系統(biological system)相似程度的度量指標，範圍為 0＜λ＜1，當 λ 越接近 1，表示毒性物質的作用位置越相近，在 λ 為 1 時，代表兩種毒性 物質共同作用在同一個生化系統，在此情形的反應下可通稱為相似型式的
共同作用（similar joint action）。當λ 為 0 時，則代表兩種毒性物質作用在
不同的生化系統上，在此情形的反應下可通稱為獨立型式的共同作用 （independent joint action），在混合效應鑑別方面，當 λ 介於 0 到 1 之間，
為毒性拮抗（Antagonism），λ 等於 1 為毒性相加作用（additivity）。
(3) Combineρwith λ
將相似係數λ 與相關係數ρ相對配對下，混合效應模式的 action mode
表 3.3.4. 1 四種基本混合效應 action mode ρ λ 意義 Response Effect CA 1 1 兩種毒物反應完全相 關，機制完全相同，反 應位置一樣稱為濃度相 加（Concentration Addition） Additive NA 1 0 兩種毒物的反應完全相 關，但毒性機制完全不 同，稱為非相加（No Addition ) max (P1,P2) Antagonistic RM 0 0 兩種毒性物質的反應完 全無關，毒性機制也完 全不同時，稱為多重反 應（Response Multipication） 1-(1-P1)(1-P2) RA -1 0 兩種毒物反應為負相 關，且毒性機制完全不 同，稱為反應相加 （Response Addition ） min (1, P1+P2) 其中較特殊的情形為當相關係數ρ＝-1（負相關）時，由理論的數學 推導發現其劑量-反應曲線之斜率同樣很小，會有毒性加強之協同效應產 生。在本研究當中，由於試驗毒化物是屬於不同機制的化學物質(作用位置 不同，λ = 0 )，而 pure culture 的ρ值常為 1 或-1，為了達到較保險的預估
效果，我們採用了ρ= -1 的情況，因此在預測混合毒性的模式分析上，選 擇 Response Addition 模式。
3.3.5 Isobologram
Isobologram 是以圖形描述兩種毒性物質混合後，毒性變化的表示 法，其混合效應的圖形中有向內凹（ strike）和向外凹（bolw）的情形發 生。Isobologram 主要的繪製原理為，在混合毒性試驗中之兩種毒性物質取 不同毒性單位比例加以混合，在一個固定的抑制率或死亡率下（如 EC50 或 LC50），按不同的混合比例畫出一個等抑制率或死亡率曲線，兩軸代表 的是兩混合毒物個別貢獻的毒性單位。Isobologram (如圖 3.3.1) 圖中所有 曲線均以 50% 抑制率為基準線，若畫出之曲線為通過（1,0）及（0,1）的 直線，及無論任何毒性單位比例相混合其毒性單位均為 1，則判定混合毒 性效應為毒性相加(Addition) ; 若為凹向原點之曲線，則判定為毒性加強 (synergistic) ; 若曲線偏離原點，則為毒性減弱(antagonistic)。實驗中繪製 isobologram 所選用的毒性單位為 3:1、1:1、1:3。 Z2/EC50,2 Antagonism Antagonism 1.0 0.0 Z1/EC50,1 1.0 NA Synergism NA 0.5 0.5 0.0 CA 圖 3.3.5. 1 isobologram 示意圖第四章 實驗設備與方法
4.1 基本實驗設備
1. 純水製造設備 實驗中清洗容器及藥品配置用水皆為自來水依次經過過濾、逆滲透、離 子交換、蒸餾然後再經超過濾( Milli-Qplus ) 處理之水。 2. 微毒測試儀毒性試驗設備為 Microtox Model 500，Micobics 製(圖 4.1.1)。 3. 冰箱 乾燥菌種貯存於-20℃之冰箱，MOAS、稀釋水及活化液則存放於 Whirpool ET250DM 之冰箱(4℃) 。 4. TOC 毒性物質濃度的定量分析使用廠牌為 Jena 的總有機碳分析儀(TOC)。
4.2 Microtox 毒性試驗
4.2.1 基本原理
Microtox 生物毒性試驗之原理為利用海洋發光菌 (費氏弧菌) ( Vibriofisheri; 學名為 Photobacterium phosphorium) ， 以其自發性的螢光反應來
反映生物毒性。當 Photobacterium phosphorium 暴露在毒性物質之中，其 受到毒性物質的作用，其螢光的發光強度將會受到抑制。因此此 Microtox 生物毒性試驗即是由 Photobacterium phosphorium 螢光的發光抑制來作為 毒性物質毒性強弱的指標。
4.2.2 儀器構造
Microtox 的實驗儀器設備主要由培養槽(incubator) 、控溫設備及螢光偵 測裝置所組成。 (1)培養槽及控溫設備: 培養槽位於儀器右上方，共有 32 個(如圖 4.2.2.1) ， 用以儲放試驗用小試管，左側 30 個培養槽用於分析樣品時使用，右側標 示 Reagent 的培養槽則供儲放螢光菌液，下方標示 Read 的培養槽則為讀取 螢光訊號時使用。控溫設備位於整個培養槽下方，左側 30 個培養槽的溫 度皆維持 15℃以保持實驗時維持一定溫度狀態，右側標示 Reagent 的培養 槽的溫度則維持 4℃以保持螢光菌在實驗期間有最佳活性。 (2)螢光偵測裝置: 螢光偵測裝置位於標示 Read 槽之下方，偵測時按 Read 鍵，即可自動將上方小試管拉下以偵測螢光訊號。 圖 4.2.2. 1 Microtox 螢光快速分析儀的 32 個槽其相關位置圖4.2.3 基本配備
Microtox 基本配備共計下面數種:
(1)稀釋液( Diluent solution ): 主要成分為含 2%濃度之 NaCl 無毒溶液，用 於稀釋樣品，由實驗室自行配置。主要配製程序是取實驗室純水製造設 備製造之純水，配成 NaCl 濃度為 2%之溶液後，再經 0.2μm 濾紙過濾 處理。 (2)活化液(Reconstitution solution): 活化液為經過實驗室純水製造設備以及 0.2μm 濾紙過濾處理的無毒無菌蒸餾水，用於活化冷凍乾燥狀態下的螢 光菌。
(3)滲透壓調節液(Microtox Osmosis Adjustment Solution ; MOAS): 其成分 為含 22%NaCl 濃度之無毒無菌溶液，配置程序是取實驗室純水製造設 備製造之純水，配成 NaCl 濃度為 22%之溶液後，再經 0.2μm 濾紙過濾 處理。滲透壓調節液之功能在於調整試驗小試管內樣品的 NaCl 濃度達 到 2%左右，以與螢光菌的滲透壓相等，用量多寡和取用樣品體積成下 列關係: X 毫升的樣品*0.1=所需的滲透壓調節液體積 (4)小試管(Cuvette): 購買自典試科技公司的小試管經特殊處理以維持無毒 性狀態，形狀為圓形以符合培養槽的形狀，主要功能為盛裝樣品及螢光 菌。由玻璃所製成，使用後拋棄不重覆使用，以避免實驗誤差。 (5)螢光菌: 螢光菌 Photobacterium phosphorium 生長於海底，經過處理成 冷凍乾燥狀態，在零下 20℃的環境可維持一年。 (6)Micropipette: 作為實驗進行中移動螢光菌液、solution、及樣品用。
4.2.4 標準分析程序:
(1) 加 1000μl 的活化液至小試管，放置在 reagent 培養槽，等待 10 分鐘，使之與培養槽溫度達平衡。接著自冷凍庫中取出粉狀的螢光菌並加入 reagent 槽中的活化液，等待 5 分鐘使螢光菌活化。 (2) 將小試管放入 A1-A5、B1-B5，以及 E4、E5，F4、F5 的培養槽，隨即 加 500μl 稀釋液到 B1-B5 和 F4、F5 培養槽，並加 1000μl 稀釋液到 A1-A4 和 E4、E5 培養槽。 (3) 以 Micropipette 抽取 10μl 的螢光菌分別加入 B1-B5 和 F4、F5 培養槽， 並以 Micropipette 將之混合均勻。等待 15 分鐘使螢光菌發光達穩定狀 態。 (4) 加 250μl 滲透壓調節液及 2500μl 樣品至 A5。以連續 2 倍稀釋方式，由 A5 抽 1000μl 至 A4、A4 抽 1000μl 至 A3、 A3 抽 1000μl 至 A2。自 A2 抽取 1000μl 至 E5、E5 抽取 1000μl 至 E4、E4 抽取 1000μl 拋棄。 (5) 由螢光菌分別加入 B1-B5 和 F4、F5 時，計時 15 分鐘之後，將 B1-B5
和 F4、F5 依序放入 read 槽中讀取其儀器顯示的螢光值，此時即為 0
分鐘之螢光值(I0) ，隨即以 Micropipette 將 A1-A5 和 E4、E5 中各抽
取 500μl 加入 B1-B5 和 F4、F5，等待 5 分鐘以及 15 分鐘後，分別記 錄其螢光值(I5、 I15)。
4.2.5 Microtox 毒性試驗環境因子
(1) 毒性試驗時間 螢光菌在取出冷凍庫活化後，由於生物本身的衰減，發光值減低，故 每次的試驗時間需控制在三小時以內，若試驗時間超過兩個小時，就必須 以標準毒物 phenol 做校正(reference control) 。每次的實驗約進行 12 組的 毒性物質，需時兩小時至三小時，此時螢光菌將近用完，此為確保生物質 試劑品質所做的時間控制。(2) 吸光光譜干擾 由於 Microtox 活體螢光發光光譜最大波長值約 494nm，如果毒性物 質在此波長附近能吸收此光譜，則螢光讀值會較實際螢光發光值低，此時 必須進行色度校正。將研究的有機物質以 450 至 500 nm 光譜掃描結果， 並無吸光現象，故無須作色度校正。
4.3 試驗毒物
本試驗所選用的有機物包含反應性及麻醉性物質,均為環境水體中常 見的污染物質,其基本的資料分別如表 4.3.1 以及 4.3.2 所示。 表 4.3. 1 反應性有機化學物質基本資料 作用機制 化學物質 分子式 分子量 (g/mole) 廠牌 純度 % Electrophile nonelectrolytes Formaldehyde CH2O 30.03 Merck 37 % Propionaldehyde C3H6O 58.08 Fluka 100 %Butyraldehyde CH3(CH2)2CHO 72.1 ACROS 99 %
Glutaraldehyde OCH(CH2)3CHO 100.12 Fluka 25 %
Cyanogenic
nonelectrolytes
Acetonitrile CH3CN 41.05 J.T.Baker 99 %
表 4.3. 2 麻醉性有機化學物質基本資料 化學物質 分子式 分子量 (g/mole) 廠牌 純度 % 3-Chloroaniline C6H6ClN 127.57 Aldrich 99 % 4-Chloroaniline C6H6ClN 127.57 Aldrich 98 % 2,4-Dichloroaniline C6H5Cl2N 162.02 Aldrich 99 % 2,5-Dichloroaniline C6H5Cl2N 162.02 Aldrich 99 % 2,6-Dichloroaniline C6H5Cl2N 162.02 Aldrich 98 % 3,4-Dichloroaniline C6H5Cl2N 162.02 Aldrich 98 % 3,5-Dichloroaniline C6H5Cl2N 162.02 Aldrich 98 % 2-Bromoaniline C6H6BrN 172.03 Aldrich 98%
4.3.1 有機藥品配製
苯胺類藥品是分子量相當大的芳香族胺類，因此在水中的溶解度較低， 尤其是含氯量較多的苯胺類也會更難溶於水，因此所需要的藥品溶解時間 也會較長，必須注意藥品配製時的揮發問題。實驗中的濃度皆為名義濃度。 其中 2,5-Dichloroaniline、2,6-Dichloroaniline、3,4-Dichloroaniline、 3,5-Dichloroaniline，採用配置儲備溶液(stoke solution)的方法,保存時間長。 考慮到其易揮發的性質，以 300 ml 的 BOD 瓶裝入純水，並加入計算後之 適量有機化學物以及磁石，蓋上 BOD 瓶蓋且水封，以磁石攪拌器攪拌至 隔夜，以確保有機物完全溶解於水中並可減少藥品揮發。其餘藥品採用配 置測試溶液(test solution)的方法，其量少，濃度低，配置後馬上進行實驗。 此法使用 60 ml 之錐形瓶，裝入純水，再加入計算後之適量有機化學物以 及磁石，迅速蓋上瓶蓋封 緊，以磁石攪拌器攪拌使之混合均勻且溶解， 作為而後進行毒性試驗之毒性樣本。試驗毒物溶液配置後再以 TOC (總有 機碳分析儀)定量。4.4 實驗數據處理
將 Microtox 螢光菌的 Luminescence Test 所求得的存活率 Q (不反應分 率，non-response fraction) 以下式表示 : ItTt IoTo Q IcTt IcTo 上式中的符號表示如下 : ItTt : 實驗組在時間 t 時的螢光讀值 IoTo : 實驗組在時間 0 時的螢光讀值 IcTt : 控制組在時間 t 時的螢光讀值 IcTo : 控制組在時間 0 時的螢光讀值 螢光抑制的剩餘率以所得的 0 分鐘(I0)、15 分鐘(I15)帶入上式計算，求 得 Q 值後，再將濃度與反應的結果以 Probit model 計算，求得螢光抑制 50% 的 EC50 值。
4.5 藥品混合方式
為了求得共同加入系統導致 50％的受測生物體產生抑制反應的毒性 物質 1（Z1）和毒性物質 2 的濃度（Z2），之後代入 M 值中進行 joint effect 的判定，進行兩種有機物的交叉混合。 混合方式主要是根據混合毒性單 位比例而定，如下所示： TU1：TU2 ＝ 1 , 50 1 EC X ： 2 , 50 2 EC X Xi：混合試驗時，毒性物質 i 加入系統的的濃度 EC50,i：單一生物體對毒性物質 i 的毒性容忍濃度 本實驗中主要進行 1 : 1 的混合比例試驗，而在 isobologram 分析試驗 則使用 3:1、1:1、1:3 的毒性單位比例混合。利用在單一毒性試驗得到之EC50,i，分別配置毒性物質 1 及毒性物質 2 的 stock solution：4.44×EC501 以 及 4.44×EC502。取毒性物質 1、2 依照體積比混合，若為 1:1 則螢光菌承 受兩種毒性物質濃度比例為： 1 , 50 1 EC X ： 2 , 50 2 EC X = 1 1 50 45 . 0 50 44 . 4 EC EC 2 2 50 45 . 0 50 44 . 4 : EC EC = 2: 2 表 4.5. 1 混合毒性 1:1 濃度配製 STEP 1 2 3 4 5 6 M 4 2 1 0.5 0.25 0.125 TU1 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 TU2 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625
4.6 高效率液相層析儀(HPLC)分析
4.6.1 HPLC 原理
高效率液相層析儀器是利用樣品通過分離管柱(固定相)時，分析物質 在管柱中與移動相以及管柱(固定相)之間的親和作用力不同，在移動相的 沖提下，每種物質經過管柱的速度會有所不同，在此過程中樣品中的各種 物質會逐漸被分離。有的物質較易和移動相介面結合，其通過管柱(固定相) 時速度較其他物質快，因此由於此時間差，使其較先被偵測器偵測，隨後 其他的物質再被偵測；反之較容易和固定相介面結合的物質，則較慢出現 偵測訊號。當偵測器偵測到物質時，連結到電腦的觀測螢幕上會出現一個 波峰（Peak Shape），依照波峰出現的時間點和標準品比較則可以得知此物 質之種類，並可以計算波峰面積之大小以得之其濃度等數據。理想中的脈 衝為高斯曲線（Gaussian Curve）。4.6.2 儀器型號以及設定
偵測器：Waters 2996 Photodiode Array Detector 管柱：C18 - 4.6 × 150 mm 移動相：60％甲醇 / 40％去離子水 流速：1.0 ml/min 偵測波長：205 nm 樣品注射量：20 μl 滯留時間：10 ~ 15 min 樣品濃度：符合混合毒性試驗之 stock solution 濃度
4.6.2 操作步驟
(1) 裝上分析用 C18 管柱後，開機且進行系統診斷，並去除 pump 以及管 線中的氣泡，以免影響分析結果。 (2) 設定基本流洗條件，以 60％甲醇＋40％去離子水的移動相比例，0.2 ml/min 的流速，流洗儀器至少一小時，使儀器穩定以及沖洗管柱至無殘留 物的情況。 (3) 流洗結束後，設定分析樣品之條件，流速條件為 1.0 ml/min，停留時間 設定為 10 ~ 15 分鐘，移動相比例和流洗時相同。 (4) 按下 inject 鍵，以注射器吸取樣品，注射量為 20 μl，注射入 pump 中， 進行分析。 (5) 由連接 HPLC 之電腦螢幕觀察分析時的脈衝變化，可觀察到不同時間 點的脈衝曲線情況。 (6) 結束分析後，再以 0.2 ml/min 的流速，同比例的移動相，流洗至少 1 小時後方可以關機，最後再卸下管柱。4.7 質譜儀(MS)分析
4.7.1 MS 原理
質譜儀(mass spectrometry, MS)的原理是以熱電子撞擊氣體分子，使其 產生碎片及離子，再經磁場分離，依據質荷比之測量，來決定分子質量， 因此可以用於分子的鑑定或確認。4.7.2 基本分析程序
(1) 將不同型態的樣品(氣、液、固相)導入質譜儀之中。 (2) 樣品分子在離子源內游離 (ionization) 成氣相之離子形式。(3) 依質荷比 (m/z : mass to charge ratio) 的不同，分離各個樣品離子。 (4) 各樣品離子到達偵測器被偵測出來。 (5) 在資料處理系統中，離子偵測訊號被轉換成可讀或圖譜方式呈現。
