Microtox 毒性試驗

4.2.1 基本原理

Microtox 生物毒性試驗之原理為利用海洋發光菌 (費氏弧菌) ( Vibrio fisheri; 學名為 Photobacterium phosphorium) ， 以其自發性的螢光反應來 反映生物毒性。當 Photobacterium phosphorium 暴露在毒性物質之中，其 受到毒性物質的作用，其螢光的發光強度將會受到抑制。因此此 Microtox 生物毒性試驗即是由 Photobacterium phosphorium 螢光的發光抑制來作為 毒性物質毒性強弱的指標。

4.2.2 儀器構造

Microtox 的實驗儀器設備主要由培養槽(incubator) 、控溫設備及螢光偵 測裝置所組成。

(1)培養槽及控溫設備: 培養槽位於儀器右上方，共有 32 個(如圖 4.2.2.1) ， 用以儲放試驗用小試管，左側 30 個培養槽用於分析樣品時使用，右側標 示 Reagent 的培養槽則供儲放螢光菌液，下方標示 Read 的培養槽則為讀取 螢光訊號時使用。控溫設備位於整個培養槽下方，左側 30 個培養槽的溫 度皆維持 15℃以保持實驗時維持一定溫度狀態，右側標示 Reagent 的培養 槽的溫度則維持 4℃以保持螢光菌在實驗期間有最佳活性。

(2)螢光偵測裝置: 螢光偵測裝置位於標示 Read 槽之下方，偵測時按 Read 鍵，即可自動將上方小試管拉下以偵測螢光訊號。

圖 4.2.2. 1 Microtox 螢光快速分析儀的 32 個槽其相關位置圖

4.2.3 基本配備

Microtox 基本配備共計下面數種:

(1)稀釋液( Diluent solution ): 主要成分為含 2%濃度之 NaCl 無毒溶液，用 於稀釋樣品，由實驗室自行配置。主要配製程序是取實驗室純水製造設 備製造之純水，配成 NaCl 濃度為 2%之溶液後，再經 0.2μm 濾紙過濾 處理。

(2)活化液(Reconstitution solution): 活化液為經過實驗室純水製造設備以及 0.2μm 濾紙過濾處理的無毒無菌蒸餾水，用於活化冷凍乾燥狀態下的螢 光菌。

(3)滲透壓調節液(Microtox Osmosis Adjustment Solution ; MOAS): 其成分 為含 22%NaCl 濃度之無毒無菌溶液，配置程序是取實驗室純水製造設 備製造之純水，配成 NaCl 濃度為 22%之溶液後，再經 0.2μm 濾紙過濾 處理。滲透壓調節液之功能在於調整試驗小試管內樣品的 NaCl 濃度達 到 2%左右，以與螢光菌的滲透壓相等，用量多寡和取用樣品體積成下 列關係:

X 毫升的樣品*0.1=所需的滲透壓調節液體積

(4)小試管(Cuvette): 購買自典試科技公司的小試管經特殊處理以維持無毒 性狀態，形狀為圓形以符合培養槽的形狀，主要功能為盛裝樣品及螢光 菌。由玻璃所製成，使用後拋棄不重覆使用，以避免實驗誤差。

(5)螢光菌: 螢光菌 Photobacterium phosphorium 生長於海底，經過處理成 冷凍乾燥狀態，在零下 20℃的環境可維持一年。

(6)Micropipette: 作為實驗進行中移動螢光菌液、solution、及樣品用。

4.2.4 標準分析程序:

(1) 加 1000μl 的活化液至小試管，放置在 reagent 培養槽，等待 10 分鐘，

使之與培養槽溫度達平衡。接著自冷凍庫中取出粉狀的螢光菌並加入 reagent 槽中的活化液，等待 5 分鐘使螢光菌活化。

(2) 將小試管放入 A1-A5、B1-B5，以及 E4、E5，F4、F5 的培養槽，隨即 加 500μl 稀釋液到 B1-B5 和 F4、F5 培養槽，並加 1000μl 稀釋液到 A1-A4 和 E4、E5 培養槽。

(3) 以 Micropipette 抽取 10μl 的螢光菌分別加入 B1-B5 和 F4、F5 培養槽，

並以 Micropipette 將之混合均勻。等待 15 分鐘使螢光菌發光達穩定狀 態。

(4) 加 250μl 滲透壓調節液及 2500μl 樣品至 A5。以連續 2 倍稀釋方式，由 A5 抽 1000μl 至 A4、A4 抽 1000μl 至 A3、 A3 抽 1000μl 至 A2。自 A2 抽取 1000μl 至 E5、E5 抽取 1000μl 至 E4、E4 抽取 1000μl 拋棄。

(5) 由螢光菌分別加入 B1-B5 和 F4、F5 時，計時 15 分鐘之後，將 B1-B5 和 F4、F5 依序放入 read 槽中讀取其儀器顯示的螢光值，此時即為 0 分鐘之螢光值(I₀) ，隨即以 Micropipette 將 A1-A5 和 E4、E5 中各抽 取 500μl 加入 B1-B5 和 F4、F5，等待 5 分鐘以及 15 分鐘後，分別記 錄其螢光值(I₅、 I₁₅)。

4.2.5 Microtox 毒性試驗環境因子 (1) 毒性試驗時間

螢光菌在取出冷凍庫活化後，由於生物本身的衰減，發光值減低，故 每次的試驗時間需控制在三小時以內，若試驗時間超過兩個小時，就必須 以標準毒物 phenol 做校正(reference control) 。每次的實驗約進行 12 組的 毒性物質，需時兩小時至三小時，此時螢光菌將近用完，此為確保生物質 試劑品質所做的時間控制。

(2) 吸光光譜干擾

由於 Microtox 活體螢光發光光譜最大波長值約 494nm，如果毒性物 質在此波長附近能吸收此光譜，則螢光讀值會較實際螢光發光值低，此時 必須進行色度校正。將研究的有機物質以 450 至 500 nm 光譜掃描結果，

並無吸光現象，故無須作色度校正。