國立交通大學
生物科技研究所
碩士論文
奈 米 鑽 石 刀 獵 殺 癌 症 細 胞 之 分 子 機 制
Molecular mechanism study of growth
hormone conjugated nanodiamonds in cancer
cell hunting and eliminating
研 究 生 ： 周 靖 淳
指 導 教 授 ： 張 家 靖 教 授
奈米鑽石刀獵殺癌症細胞之分子機制
Molecular mechanism study of growth hormone conjugated
nanodiamonds in cancer cell hunting and eliminating
研究生：周靖淳 Student：Ching-Chung Chou
指導教授：張家靖 Advisor：Chia-Ching Chang
國立交通大學
生物科技研究所
碩士論文
A ThesisSubmitted to Department of Biological Science and Technology National Chiao Tung University
in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of
Master in
Department of Biological Science and Technology July 2009
Hsinchu, Taiwan, Republic of China
奈 米 鑽 石 刀 獵 殺 癌 症 細 胞 之 分 子 機 制
學 生:周 靖 淳 指 導 教 授 :張 家 靖 教 授 國 立 交 通 大 學 生 物 科 技 研 究 所 碩 士 班摘 要
現 今 奈 米 生 物 科 技 是 個 很 熱 門 的 研 究 領 域 ， 主 要 是 因 為 當 某 材 料 的 空 間 中 尺 寸 達 到 100 nm 以 下 時 ， 其 物 理 及 化 學 特 性 相 較 於 一 般 塊 材 會 有 所 改 變 ， 而 奈 米 鑽 石 也 不 例 外 。 早 期 的 奈 米 鑽 石 多 用 於 機 械 上 的 工 業 加 工 或 是 表 面 處 理 ， 但 有 近 來 之 研 究 發 現 奈 米 鑽 石 具 有 螢 光 特 性 ， 可 當 作 生 物 分 子 的 追 蹤 器(bio-tracer)； 並 有 其 他 文 獻 指 出 奈 米 鑽 石 不 具 有 細 胞 毒 性 且 能 進 行 表 面 官 能 基 的 修 飾 ， 因 此 奈 米 鑽 石 更 具 有 跨 足 生 醫 領 域 的 潛 能 。 而 奈 米 鑽 石 在 吸 收 奈 秒 脈 衝 雷 射 能 量 後，其 內 部 的 官 能 基 會 由-C-N=O 裂 解 成 -C ﹢N≣ O， 更 近 一 步 來 說，也 就 是 奈 米 鑽 石 吸 收 了 能 量 產 生 了 熱 聲 子 效 應 ， 使 得 鑽 石 間 的 軌 域 由 鑽 石 的 核 心 結 構 sp3轉 變 成 石 墨 的 結 構sp2就 由 如 爆 炸 一 般 。 因 此 利 用 奈 米 鑽 石 吸 收 能 量 具 有 爆 炸 的 特 性 ， 且 結 合 一 生 長 激 素 蛋 白，使 具 有 大 量 表 現 生 長 激 素 受 體 的 癌 症 細 胞 與 奈 米 鑽 石 -生 長 激 素 附 合 體 結 合 ， 再 搭 配 雷 射 能 量 系 統 使 得 奈 米 鑽 石 爆 炸 ， 並 隨 後 引 發 一 連 串 的 細 胞 凋 亡 反 應 。 而 本 實 驗 利 用 聲 子 所 引 起 的 奈 米 級 爆 炸 ， 猶 如 奈 米 刀 般 應 用 在 奈 米 級 生 物 醫 學 治 療 上 。Molecular Mechanism Study of Growth hormone Conjugated
Nanodiamonds in Cancer Cell Hunting and Eliminating
Advisee: Ching-Chung Chou Adviser: Dr. Chia-Ching Chang
Department of Biological Science and Technology National Chiao Tung University
Abstract
Nano biotechnology is a cutting edge reseach, recently. ”Nano” is definited the length under 100 nm and the physical and chemical properties are quite different than its bulk material. Nanodiamond (ND) surrounds with layers of graphite on its surface. This unique structure feature creates unusual fluorescence spectra which can be used as an indicator to monitor its surface modification. Meanwhile, it contains nitrosol (-C-N=O) inside the ND and this impurity can absorb nanosecond laser radiation to cleavage the -C-N=O chemical functional group into -C ﹢ N≣ O. Moreover, the NO gas molecules are heated by hot phonon of ND and generate huge pressure inside the diamond core to facilitate the sp3 diamond core transforming into sp2 graphite structure
as a nano-blast. Therefore, the growth hormone receptor (GHR) of cell surface can be destroyed by growth hormone conjugated-ND (NDGH) and then be triggered the process of cell apoptosis. This photo-trigger nanoblast can be used as nano-knifes in nano-medicine application.
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誌 謝
在 研 究 所 這 兩 年 的 時 間 裡 ， 讓 我 成 長 很 多 ， 要 感 謝 的 人 也 很 多 ， 謝 謝 你 們 不 論 是 在 精 神 上 的 支 持 亦 或 是 實 驗 上 的 幫 助 ， 真 的 由 衷 的 感 謝 你 們! 首 先 要 感 謝 家 人 的 支 持 ， 讓 我 在 念 研 究 所 的 時 候 ， 給 予 我 很 大 的 鼓 勵 與 力 量；再 者 感 謝 我 的 指 導 老 師 -張 家 靖 博 士，讓 我 從 這 研 究 題 目 中 學 習 多 向 性 以 及 跨 領 域 的 研 究 及 合 作 ， 結 合 生 物 與 物 理 領 域 ， 是 個 非 常 有 挑 戰 性 的 研 究 。 謝 謝 鄭 財 木 博 士 、 曾 信 華 博 士 從 旁 的 指 導 協 助 ； 朱 學 亮 學 長 的 兩 年 來 的 幫 忙 讓 我 能 順 利 完 成 論 文 ； 葉 奕 辰 學 長 在 生 活 上 給 我 很 多 歡 樂 ， 讓 研 究 生 活 裡 多 了 很 多 色 彩 ； 瑤 真 、 芳 馨 、 子 正 一 路 的 扶 持 ， 你 們 的 ＂ 指 導 ＂ 我 往 後 進 入 社 會 也 會 銘 記 在 心 !也 感 謝 以 前 社 團 的 夥 伴 們 陪 伴 我 度 過 低 潮 !以 及 感 謝 實 驗 室 的 大 家 ， 名 字 雖 不 一 一 列 出 ， 但 你 們 的 幫 忙 我 都 記 在 心 裡 ! 感 謝 在 實 驗 上 幫 助 的 各 位 : 儀 科 陳 至 信 博 士 、 蘇 健 穎 與 朱 念 南 ， 羅 韻 晴 工 程 師 … … 等 ， 真 的 謝 謝 各 位 !一 切 的 感 謝 ， 盡 在 不 言 中 。目 錄
摘 要 ... I Abstract ... II 誌 謝 ... III 目 錄 ... IV 表 目 錄... VI 圖 目 錄... VI 第 一 章 緒 論 ... 1 1-1 奈 米 材 料 在 生 物 上 的 應 用 ... 1 1-2 奈 米 醫 學 影 像 追 蹤 的 應 用 ... 3 1-3 生 物 標 靶 性 治 療 介 紹 ... 4 1-4 奈 米 鑽 石 對 癌 症 標 靶 性 的 開 發 ... 5 1-5 細 胞 凋 亡 (apoptosis)與 壞 死 (necrosis)的 介 紹 ... 5 第 二 章 研 究 動 機 ... 7 第 三 章 實 驗 架 構 ... 8 3-1 魚 類 和 哺 乳 類 動 物 生 長 激 素 的 胺 基 酸 序 列 與 親 緣 關 係 與 演 化 分 析 8 3-2 青 石 斑 魚 生 長 激 素 是 人 類 生 長 激 素 的 相 似 物 ... 8 3-3 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 的 取 得 與 表 現 ... 10 3-4 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 和 蛋 白 質 的 鍵 結 ... 12 3-5 奈 米 鑽 石 和 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 在 生 物 特 性 與 毒 性 的 檢 測 ... 12 3-6 青 石 斑 魚 的 重 組 生 長 激 素 (rEaGH)和 重 組 基 因 魚 類 生 長 激 素 -羧 酸 化 奈 米 鑽 石 複 合 體(cND-rEaGH complex)的 生 物 特 性 檢 測 ... 13 3-7 選 定 何 種 癌 症 細 胞 為 奈 米 鑽 石 -生 長 激 素 複 合 體 的 標 靶 細 胞 ... 13 3-8 熱 聲 子 (hot phonon)效 應 對 5 nm 奈 米 鑽 石 的 影 響 ... 14 3-9 奈 秒 脈 衝 雷 射 對 奈 米 鑽 石 -生 長 激 素 複 合 體 的 應 用 ... 14 第 四 章 實 驗 原 理 ... 16 4-1 大 量 獲 得 青 石 斑 魚 的 重 組 生 長 激 素 ... 16 4-2 5 nm 奈 米 鑽 石 表 面 羧 酸 化 ... 16 4-3 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 螢 光 光 譜 測 定 ... 16 4-4 動 態 光 散 色 儀 測 定 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 粒 徑 ... 16 4-5 共 價 鍵 結 合 的 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 -蛋 白 質 複 合 體 ... 17 4-6 細 胞 的 培 養 ... 184-7 奈 秒 雷 射 能 量 對 cND-rEaGH 在 細 胞 上 的 影 響 ... 18
4-8 檢 測 cND-rEaGH 在 細 胞 上 經 熱 聲 子 效 應 後 的 分 析 ... 18
4-8-1 細 胞 型 態 學 (Morphology) ... 18
4-8-2 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (Scanning Electron Microscope, SEM) . 19 4-8-3 免 疫 細 胞 化 學 染 色 (Immunocytochemistry, ICC) ... 19
4-8-4 雷 射 共 軛 焦 螢 光 顯 微 鏡 (Confocal Microscope) ... 19
4-8-5 細 胞 存 活 率 分 析 (statistics of cell viability) ... 20
4-8-6 發 炎 反 應 蛋 白 (Inter-Cellular Adhesion Molecule, ICAM) . 20 分 析 ... 20 4-9 cND-rEaGH 在 癌 症 治 療 上 的 應 用 ... 21 第 五 章 結 果 ... 22 5-1 生 長 激 素 與 生 長 激 素 受 體 的 偵 測 ... 22 5-1-1 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 的 取 得 與 表 現 ... 22 5-1-2 確 認 肺 腺 癌 細 胞 具 有 生 長 激 素 的 受 體 ... 23 5-2 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 理 化 特 性 分 析 ... 25 5-2-1 確 認 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 粒 徑 大 小 ... 25 5-2-2 檢 測 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 螢 光 光 譜 ... 26 5-3 奈 秒 雷 射 能 量 測 定 與 選 定 ... 27 5-4 確 認 在 細 胞 上 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 與 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 的 結 合 28 5-5 經 雷 射 處 理 後 細 胞 巨 觀 觀 察 ... 30 5-5-1 經 cND、 rEaGH、 cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 前 後 的 細 胞 形 態 ... 30 5-5-2 經 cND、 rEaGH、 cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 前 後 的 存 活 細 胞 數 目 ... 33 5-6 經 奈 秒 雷 射 處 理 後 細 胞 致 死 機 制 分 析 與 觀 測 ... 35 5-6-1 觀 察 經 cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 前 後 的 細 胞 凋 亡 誘 導 因 子(Apoptosis-inducing factor, AIF) ... 36
5-6-2 觀 察 經 cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 前 後 的 細 胞 凋 亡 小 體 39 (apoptotic body) ... 39
5-6-3 經 cND、 rEaGH、 cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 前 後 的 ... 42
發 炎 反 應 蛋 白(ICAM)分 析 ... 42
6-1 奈 米 鑽 石 的 生 物 物 理 特 性 ... 44 6-2 5 nm cND-rEaGH 的 特 性 與 應 用 ... 44 6-3 奈 米 鑽 石 與 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 的 結 合 方 法 探 討 ... 44 6-4 不 同 雷 射 能 量 使 奈 米 鑽 石 爆 炸 並 對 細 胞 的 影 響 ... 45 6-5 奈 米 鑽 石 經 雷 射 轟 炸 後 的 應 用 ... 46 6-6 細 胞 經 cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 後 的 死 亡 表 現 與 可 能 反 應 路 徑... 47 6-7 了 解 細 胞 的 表 面 受 體 能 有 助 於 標 靶 治 療 的 發 展 ... 48 6-8 奈 米 鑽 石 的 發 展 潛 力 ... 50 第 七 章 參 考 文 獻 ... 51
表 目 錄
表 1 細 胞 自 然 凋 亡 與 壞 死 介 紹 ... 6 表 2 正 常 細 胞 與 惡 性 腫 瘤 細 胞 所 具 有 的 受 體 種 類 ... 48圖 目 錄
圖 3-1-1 魚 類 和 哺 乳 類 動 物 的 親 源 演 化 樹 ... 8 圖 3-9-1 奈 秒 脈 衝 雷 射 對 奈 米 鑽 石 -生 長 激 素 複 合 體 在 癌 症 細 胞 上 的 應 用 示... 15 圖 4-5-1 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 與 青 斑 魚 重 組 生 長 激 素 結 合 示 意 圖 ... 18 圖 5-1-1 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 (rEaGH)的 表 現 電 泳 分 析 圖 ... 22 圖 5-1-2 確 認 肺 腺 癌 細 胞 (A549)具 有 生 長 激 素 受 體 ... 24 圖 5-2-1 利 用 動 態 光 散 射 儀 所 測 量 5 nm 奈 米 鑽 石 的 實 際 粒 徑 大 小... 25 圖 5-2-2 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 三 維 螢 光 光 譜 ... 26 圖 5-3-1 奈 秒 雷 射 能 量 的 選 定 ... 27 圖 5-4-1 利 用 雷 射 共 軛 焦 顯 微 鏡 檢 視 肺 腺 癌 細 胞 上 的 cND 是 否 與 rEaGH 接 合 ... 29 圖 5-5-1 以 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 觀 察 A549 的 細 胞 型 態 ... 31 圖 5-5-2 以 倒 立 式 光 學 顯 微 鏡 觀 察 A549 分 別 加 入 rEaGH、 5 nm cND、 5 nm ND-rEaGH， 有 與 無 奈 秒 雷 射 轟 炸 處 理 並 培 養 0 以 及 20 小 時 的 細 胞 型 態 ... 32圖 5-5-3 經 cND、rEaGH、cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 前 後 的 存 活 細 胞 數 目... 34 圖 5-6-1 利 用 西 方 轉 漬 法 偵 測 caspase 3 在 細 胞 分 子 層 次 上 的 表 現... 35 圖 5-6-2 caspase 以 及 caspase-independent 路 徑 示 意 圖 ... 36 圖 5-6-3 利 用 共 軛 焦 顯 微 鏡 觀 察 A549 細 胞 分 別 經 rEaGH、cND、 cND-rEaGH 處 理 和 有 無 雷 射 轟 炸 後 ， 細 胞 凋 亡 誘 導 因 子 AIF 的 分 布 情 況... 39 圖 5-6-4 肺 腺 癌 細 胞 加 入 5 nm cND-rEaGH 有 與 無 雷 射 處 理 的 細 胞 核 型 態 ... 41 圖 5-6-5 經 cND、 rEaGH、 cND-rEaGH 處 理 和 雷 射 轟 炸 前 後 的 發 炎 反 應 蛋 白 ... 43 圖 6-4-1 利 用 倒 立 式 顯 微 鏡 觀 察 使 用 過 高 能 量 雷 射 處 理 細 胞 後 的 外 觀... 46 圖 6-6-1 細 胞 經 cND-rEaGH 處 理 及 雷 射 照 射 後 的 細 胞 凋 亡 可 能 反 應 路 徑 ... 47
第 一 章 緒 論
1- 1 奈 米 材 料 在 生 物 上 的 應 用 一 般 來 說，定 義「 奈 米 」的 大 小 為 在 三 維 空 間 中 一 物 質 的 尺 寸 約 為 1~100 nm 則 稱 之 為 奈 米 顆 粒 [1]； 當 物 質 以 「 奈 米 」 等 級 存 在 時 ， 其 導 電 性 、 磁 性 、 光 學 、 物 理 和 化 學 性 質 會 有 很 大 改 變[2]， 因 此 具 有 很 多 特 殊 現 象 及 特 性 可 供 利 用 ， 所 以 在 近 幾 十 年 內 大 量 應 用 在 各 個 領 域 如 化 妝 品 工 業 、 紡 織 業 、 電 腦 工 業 、 半 導 體 等 等 中 ， 更 是 應 用 在 生 醫 領 域 的 一 大 新 契 機 。 因 為 在 生 物 體 微 觀 的 世 界 裡 皆 是 由 奈 米 尺 度 的 分 子 所 組 成 ， 像 是 生 命 分 子 DNA、 蛋 白 質 、 脂 質 ...等 等 ， 且 生 命 現 象 的 運 作 也 是 由 細 胞 中 奈 米 等 級 的 胞 器 協 助 完 成 的 ， 因 此 利 用 奈 米 材 料 在 生 醫 上 可 以 有 效 的 達 到 分 子 層 次 上 的 治 療 而 直 達 病 灶[3,4]； 現 今 在 生 物 醫 學 領 域 裡 奈 米 技 術 的 研 發 大 致 可 囊 括 藥 物 傳 遞 與 釋 放[5,6]、醫 療 診 斷 上 生 物 晶 片 [7,8]、基 因 治 療 [9,10]、 智 慧 藥 物[11]、 生 物 醫 學 奈 米 機 械 以 及 仿 生 材 料 [12,13]等 應 用 。 以 下 將 簡 述 一 些 奈 米 材 料 的 特 性 並 在 生 物 醫 學 上 的 應 用 。 (1.) 量 子 點 (Quantum dot): 量 子 點 具 有 獨 特 的 光 譜 吸 收 特 性 能 取 代 現 有 的 化 學 螢 光 染 劑[14]。 由 於 傳 統 的 化 學 染 劑 其 激 發 波 峰 (excitation peak) 和 放 射 波 峰(emission peak)常 有 部 分 的 光 譜 重 疊 (cross talk)，所 以 化 學 染 劑 經 由 激 發 後 所 放 射 出 的 螢 光 訊 號 易 受 到 激 發 光 源 的 干 擾 ， 又 螢 光 消 失 (photo-bleaching)的 速 度 極 快，不 同 的 化 學 染 劑 甚 至 須 要 不 同 波 長 的 光 源 來 激 發[15]， 相 較 之 下 量 子 點 具 有 許 多 化 學 螢 光 染 劑 所 沒 有 的 優 點 。 不 同 粒 徑 大 小 的 量 子 點 可 激 發 出 不 同 顏 色 的 螢 光 ， 而 且 它 們 只 需 由 單 一 波 長 的 光 源 來 激 發[16]， 其 螢 光 的 半 衰 期 長 且 有 較 高 的 quantum yield， 綜 合 以 上 幾 個 優 點 ， 可 以 運 用 不 同 粒 徑 大 小 的 量 子 點 同 時 並 長 時 間 觀 察 追 蹤 多 種 標 定 蛋 白 質 在 細 胞 內 的 動 向 ， 是 不 錯 的 生 物 影 像 追 蹤 器[17]。 雖 說 量 子 點 螢 光 特 性 是 優 於 傳 統 化 學 染 劑 ， 但 量 子 點 的 核 心 是 由 半 導 體 材 料 如 硒 化 鎘 或 硒 化 鉛 等 有 毒 物 質 所 組 成[18]， 長 期 接 觸 這 些 有 毒 物 質 會 對 細 胞 甚 至 是 基 因 層 次 造 成 傷 害[19]， 因 此 量 子 點 對 活 生 物 體 來 說 是 具 有 毒 性 的 [20]。 (2.) 奈 米 金 (Nanogold): 奈 米 金 顆 粒 的 光 學 性 質 會 因 為 粒 徑 的 改 變 而有 所 變 化 ； 隨 著 粒 徑 的 逐 漸 縮 小 ， 吸 收 光 譜 變 化 會 往 長 波 長 方 向 移 動 [21,22]； 如 市 售 的 的 驗 孕 棒 即 是 利 用 此 特 性 ， 將 帶 有 人 類 絨 毛 膜 促 性 腺 激 素(human chorionic gonadotropin)抗 體 的 奈 米 金 粒 子 製 成 檢 驗 試 劑，當 懷 孕 3~4 周 的 婦 女 將 尿 液 滴 入 驗 孕 棒 中 ， 就 會 呈 現 鮮 紅 直 線 ， 即 是 抗 原 抗 體 的 結 合[23]。 且 表 面 也 可 以 修 飾 成 很 多 官 能 基 ， 與 生 物 分 子 做 鍵 結 ， 以 電 化 學 做 為 基 礎 做 生 物 樣 品 如 DNA 等 等 檢 測 也 具 有 發 展 性 [24,25]。 (3.) 奈 米 碳 管 (Nanotube): 奈 米 碳 管 具 有 良 好 的 導 電 及 彎 曲 扭 轉 特 性 [26]，在 工 業 發 展 方 面 是 具 有 潛 力 的 奈 米 物 質，而 在 生 物 醫 學 應 用 上 來 說 ， 在 過 去 傳 統 的 組 織 工 程 技 術 已 經 成 功 培 養 出 一 些 新 生 的 組 織 ， 例 如 皮 膚 與 軟 骨[27]等 ， 但 是 無 法 培 養 出 功 能 完 備 的 器 官 ； 因 此 利 用 奈 米 碳 管 來 導 引 人 工 器 官 的 細 胞 生 長 及 支 架 使 形 成 許 多 細 微 的 管 道[28,29]， 建 構 出 有 如 人 體 中 的 循 環 系 統 的 類 網 絡 系 統 ， 更 進 一 步 發 展 出 細 密 的 血 管 網 ， 即 可 以 提 供 氧 氣 和 營 養 物 給 實 驗 室 中 培 養 的 肝 臟 與 腎 臟 。 但 有 文 獻 指 出 奈 米 碳 管 對 於 細 胞 是 有 傷 害 性 的 ， 其 傷 害 性 不 在 於 如 量 子 點 般 具 有 有 毒 物 質 毒 害 細 胞，而 是 在 於 奈 米 碳 管 的 結 構 有 如 針 尖 般 刺 穿 細 胞 膜，使 得 細 胞 死 亡[30]。 因 此 奈 米 碳 管 若 應 用 到 生 物 體 內 如 藥 物 傳 遞 等 ， 此 物 質 的 結 構 是 需 要 考 量 的 重 點 。
(4.) 奈 米 鐵 氧 粒 子 (Iro n oxide nanoparticle): 此 類 奈 米 材 料 有 很 多
種 ， 如α-Fe2O3、γ-Fe2O3、Fe3O4等 等 的 磁 性 粒 子[31,32]， 而 此 類 物 質 會 隨 著 粒 徑 大 小 的 改 變，一 些 磁 性 特 性 也 會 發 生 變 化，如 由 抗 磁 性(diamagnetic) 轉 變 為 順 磁 性(paramagnetic)[33]， 因 此 可 以 利 用 此 磁 力 變 化 特 性 應 用 在 生 物 醫 學 方 面。像 是 磁 泳 技 術(magnetophoresis)[34]可 以 使 生 物 分 子 分 離 或 更 進 一 步 用 在 診 斷 治 療 的 基 礎 上 。 而 在 治 療 腫 瘤 細 胞 方 面 的 主 要 應 用 ， 是 將 此 磁 性 材 料 作 為 靶 向 藥 物 運 輸 的 磁 性 載 體 ， 以 及 利 用 外 加 交 變 磁 場 的 作 用 產 生 高 熱 效 應(magnetic fluid hyperthermia)， 以 達 到 殺 死 腫 瘤 的 目 的
[35,36]， 但 是 外 加 交 變 磁 場 的 作 用 對 正 常 細 胞 是 否 有 影 響 ， 還 待 加 研 究 。
(5.) 奈 米 鑽 石 (nanodiamond): 奈 米 鑽 石 粉 末 有 些 是 由 爆 炸 的 炸 藥 直 接
轉 換 而 成 ， 是 利 用 炸 藥 (TNT / RDX)爆 炸 時 ， 於 負 氧 平 衡 反 應 中 未 氧 化 的 碳 原 子 重 新 聚 集 、 排 列 形 成 奈 米 鑽 石 ； 製 備 過 程 係 是 將 混 合 炸 藥 在 充 以 保
護 性 氣 體(惰 氣 、 氮 氣 或 二 氧 化 碳 等 )的 密 閉 容 器 中 爆 炸 ， 主 要 是 目 的 是 防 止 剛 生 成 的 類 鑽 石 物 質 被 氧 化 並 減 弱 其 石 墨 化 ， 因 此 所 形 成 的 奈 米 鑽 石 是 雜 有 氮 、 氧 、 氫 原 子 的 奈 米 材 料 原 料[37]。
由 於 奈 米 鑽 石 是 利 用 在 高 溫 及 高 壓 爆 炸 過 程 產 生 的 ， 因 此 其 晶 格 內 部 含 有 大 量 的 缺 陷 存 在 ， 稱 做 氮 空 缺 中 心(nitrogen-vacancy defect centers, N-V 中 心 )[38]。這 晶 格 的 缺 陷 使 得 奈 米 鑽 石 具 有 螢 光 的 特 性，此 外 更 有 學 者 直 接 利 用 高 能 量 的 質 子 光 束 照 射 奈 米 鑽 石 ， 增 加 晶 格 缺 陷 的 數 目 ， 達 到 強 化 奈 米 鑽 石 發 光 的 效 能[39]。而 與 N-V 中 心 不 同 的 是 5 nm 的 奈 米 鑽 石 吸 收 螢 光 光 譜 是 連 續 的 ， 具 有 作 為 生 物 探 針(bio-probe)的 潛 能 [40]， 而 奈 米 鑽 石 可 跨 足 生 物 醫 學 領 域 ， 除 了 具 有 產 生 螢 光 特 性 可 當 作 生 物 標 定[41]外 更 是 因 其 大 多 是 由 碳 原 子 所 組 成 的 ， 具 有 高 度 的 生 物 相 容 性 及 對 細 胞 無 毒 性[42]，並 且 奈 米 鑽 石 吸 收 奈 秒 脈 衝 雷 射 的 能 量 後 [43]，經 熱 聲 子 效 應 的 關 係 ， 其 結 構 會 由 原 先 的 sp3 轉 變 成 sp2， 而 這 爆 炸 效 應 使 分 子 軌 域 產 生 的 變 化 將 應 用 在 本 實 驗 中 ， 並 加 以 探 討 奈 米 鑽 石 結 合 生 物 分 子 的 複 合 體 吸 收 奈 秒 脈 衝 雷 射 能 量 後 對 癌 症 細 胞 的 影 響[44]。 1- 2 奈 米 醫 學 影 像 追 蹤 的 應 用 藉 由 醫 學 影 像 的 發 展 ， 可 以 藉 此 來 了 解 人 體 中 組 織 器 官 的 型 態 與 功 能 變 化 。 而 醫 學 影 像 的 技 術 通 常 是 藉 由 外 場 的 能 量 束 ， 如 磁 場 等 等 作 用 於 生 命 體 ， 再 收 集 信 號 變 化 來 反 應 生 命 體 的 結 構 以 及 其 他 資 訊 。 又 因 為 不 同 組 織 ， 如 骨 頭 、 脂 肪 、 肌 肉 等 吸 收 外 在 能 量 也 會 有 所 不 同 ， 因 此 為 了 增 強 這 信 號 的 差 異 會 在 人 體 內 注 入 醫 學 對 比 劑 以 增 加 組 織 間 、 組 織 與 病 變 之 間 的 對 比 度 ， 以 取 得 更 好 的 影 像[45]。
(1.) 磁 振 造 影 ( magnetic resonance i maging, MRI)， 是 利 用 生 物 體 內 不
同 組 織 在 外 加 磁 場 下 產 生 不 同 的 磁 共 振 信 號 來 成 像 ， 而 信 號 的 強 弱 決 定 於 組 織 內 水 分 子 的 質 子 鬆 弛 時 間(relaxation time)[46]。 因 此 需 要 奈 米 等 級 的 磁 振 造 影 對 比 試 劑 以 增 強 鬆 弛 時 間 的 差 別 使 組 織 影 像 對 比 度 增 加 ， 此 奈 米 等 級 材 料 有 超 順 磁 氧 化 鐵(superparamagnetic iron oxide, SPIO)[47]、超 小 超 順 磁 性 氧 化 鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIOs)[48]、 釓 (Gd3 +)[49]基 影 像 劑 、 富 勒 烯 (fullerene)[50,51]等 ， 由 於 這 些 奈 米 材 料 在 生 命 體 內 具 有 循 環 時 間 長 與 靶 向 給 藥 等 功 能 ， 可 應 用 在 腫 瘤 影 像 偵 測 領 域 中
[52]。
(2.) 三 倍 頻 (Third-har monic-generation, THG) 近 年 來 在 生 物 影 像 中 提
供 一 個 非 侵 入 性 的 偵 測 方 式 ， 具 有 非 線 性 光 學 特 性 可 以 有 內 部 光 學 切 片 的 能 力 ， 及 因 有 虛 擬 過 度 態(virtual transition state)而 無 能 量 散 失 等 優 點 ， 因 此 基 本 上 是 利 用 物 質 同 時 和 三 個 相 同 能 量 的 光 子 來 作 用 ， 物 質 受 到 這 三 個 光 子 的 激 發 後 以 放 光 的 形 式 回 到 基 態 ， 所 放 出 來 的 光 就 叫 三 倍 頻 訊 號 。 因 此 必 須 在 同 一 位 置 、 時 間 上 有 很 高 的 光 子 密 度 ， 才 能 達 到 同 時 吸 收 三 個 光 子 的 效 果[53]。 更 有 學 者 加 入 銀 奈 米 粒 子 的 對 比 試 劑 ， 是 利 用 銀 奈 米 粒 子 表 面 電 漿 共 振 效 應(Surface Plasmon Resonance) 來 增 強 物 體 表 面 電 場 以 提
高 非 線 性 光 學 的 訊 號，此 技 術 可 提 供 很 高 的 三 維 解 析 能 力，適 合 用 來 做 3D 成 像[54]。 (3.) 光 聲 技 術 (optoacoustic technique) 是 讓 生 物 體 吸 收 電 磁 能 量 ( 例 如 雷 射 光、微 波)之 後，產 生 聲 波，然 後 偵 測 此 聲 波，利 用 超 音 波 的 成 像 原 理 ， 組 合 出 生 物 體 內 部 構 造 的 影 像[55]。 光 聲 影 像 之 信 號 具 有 光 學 之 高 對 比 與 聲 學 之 低 散 射 性 質 ， 可 運 用 於 生 醫 影 像 之 研 究 ， 像 是 乳 癌 造 影[56]、 腦 部 功 能 性 與 結 構 性 造 影[57,58]、即 時 血 氧 監 測 [59]、血 紅 素 濃 度 量 測 [60]、腫 瘤 之 血 管 新 生 等[61]。 在 偵 測 時 可 利 用 奈 米 金 接 上 抗 體 ， 以 抗 體 辨 認 抗 原 的 原 理 將 奈 米 金 帶 到 欲 想 檢 測 的 部 位 ， 再 應 用 光 聲 技 術 以 產 生 高 對 比 、 高 訊 號 強 度 的 影 像[62]。 1- 3 生 物 標 靶 性 治 療 介 紹 近 幾 十 年 來 衛 生 署 所 公 布 的 國 人 十 大 死 因 ， 癌 症 仍 居 榜 首 ， 因 此 如 何 發 展 治 療 方 式 及 開 發 癌 症 治 療 藥 物 有 效 治 療 癌 症 以 降 低 死 亡 率 則 是 全 球 需 要 共 同 努 力 的 課 題 。 而 近 年 來 分 子 生 物 學 的 研 究 突 飛 猛 進 ， 對 於 腫 瘤 生 物 學 的 了 解 也 漸 漸 成 熟 ， 因 此 有 關 腫 瘤 的 特 殊 抗 原 、 腫 瘤 血 管 新 生 相 關 因 子 、 特 殊 生 長 因 子 受 體 、 癌 細 胞 特 殊 訊 息 傳 遞 路 徑 中 的 各 類 分 子 ， 及 癌 細 胞 內 細 胞 週 期 和 細 胞 凋 亡 之 調 控 分 子 ， 都 有 已 有 深 入 的 探 討 。 從 這 些 分 子 生 物 學 上 的 基 礎 ， 從 中 尋 找 抗 癌 藥 物 可 直 接 作 用 於 腫 瘤 位 置 ， 進 而 抑 制 其 存 活 、 增 生 、 侵 犯 及 轉 移[63]。 目 前 許 多 治 療 癌 症 的 藥 物 ， 就 是 針 對 這 些 重 要 的 標 靶 因 子 ，
設 計 出 有 如 導 彈 般 直 接 命 中 腫 瘤 細 胞 的 靶 向 性 藥 物 ， 而 且 不 會 傷 害 到 正 常 細 胞 ， 也 就 不 會 引 起 其 他 的 副 作 用 ， 這 也 就 是 標 靶 治 療 （target therapy） 的 概 念[64-66]。 一 個 理 想 的 標 靶 分 子 設 計 需 要 有 下 列 幾 個 特 點 ：(1)大 多 數 癌 細 胞 具 有 此 標 靶 能 與 正 常 細 胞 區 別，(2)其 作 用 對 正 常 細 胞 要 較 少 或 無 異 常 影 響，(3) 與 癌 細 胞 的 生 存 功 能 有 關 ，(4)此 標 靶 分 子 在 腫 瘤 中 要 少 變 異 性 或 低 突 變 率 ，(5)不 易 由 細 胞 表 面 脫 落 或 分 泌 [67]。 因 此 本 實 驗 的 設 計 是 用 上 述 幾 點 特 點 作 出 一 標 靶 治 療 的 平 台 ， 並 加 以 探 討 癌 症 細 胞 死 亡 的 機 制 。 1- 4 奈 米 鑽 石 對 癌 症 標 靶 性 的 開 發 現 今 具 高 療 效 率 治 療 癌 症 即 是 標 靶 藥 物 的 開 發 ， 但 即 使 是 現 有 的 抗 癌 藥 物 、 標 靶 藥 物 除 有 抗 藥 性 的 問 題 存 在 外 ， 還 有 藥 物 不 易 達 到 腫 瘤 細 胞 以 致 被 癌 細 胞 吸 收 率 過 低 問 題 ， 還 有 研 究 指 出 標 靶 藥 物 必 須 使 用 在 適 合 的 病 患 身 上 才 能 發 揮 最 大 的 藥 效，如 目 前 肺 癌 治 療 上 相 當 熱 門 的 標 靶 藥 物 -艾 瑞 莎(Iressa)， 病 患 需 要 有 上 皮 生 長 因 子 基 因 突 變 才 會 具 有 較 高 的 療 效 [65,68]； 用 於 治 療 大 腸 癌 之 爾 必 得 舒 (Erbitux)、 用 於 治 療 乳 癌 之 賀 癌 平 (Herceptin)也 都 要 有 一 定 的 病 理 檢 查 ， 才 能 讓 這 些 標 靶 藥 物 發 揮 最 高 治 療 效 果[69]。 而 且 這 些 標 靶 藥 物 的 價 錢 非 常 昂 貴 ， 一 年 下 來 的 醫 藥 費 藥 動 輒 需 要 一 、 兩 百 萬 ， 對 一 個 家 庭 來 說 是 不 小 的 經 濟 負 擔 。 相 較 於 昂 貴 的 標 靶 藥 物 ， 本 實 驗 利 用 在 生 醫 領 域 中 新 興 的 奈 米 材 料 且 價 錢 平 易 近 人 中 之-奈 米 鑽 石 作 為 開 發 標 靶 癌 症 治 療 的 基 材。奈 米 鑽 石 不 僅 對 細 胞 無 毒 性 、 還 具 有 連 續 螢 光 光 譜 特 性 ， 可 以 應 用 在 醫 學 影 像 領 域 裡 [40]， 更 令 人 興 奮 的 是 ， 奈 米 鑽 石 經 由 奈 秒 脈 衝 雷 射 (nanosecond pulse LASER)處 理 後 ， 因 熱 聲 子 [70]效 應 使 奈 米 鑽 石 如 爆 炸 般 ， 使 其 鑽 石 的 分 子 結 構 由 sp3轉 變 成 sp2， 因 此 體 積 增 大 了 十 幾 倍 之 多[44]。 本 實 驗 利 用 表 面 羧 酸 化 的 奈 米 鑽 石 ， 結 合 一 個 具 有 標 靶 性 的 蛋 白 質 形 成 一 複 合 體，此 羧 酸 化 奈 米 鑽 石-標 靶 性 蛋 白 質 複 合 體 會 與 癌 症 細 胞 結 合 ， 再 利 用 脈 衝 雷 射 ， 藉 著 熱 聲 子 效 應 使 得 奈 米 鑽 石 產 生 物 理 性 的 爆 炸 ， 於 癌 細 胞 表 面 產 生 許 多 孔 洞 ， 受 傷 嚴 重 的 癌 細 胞 將 走 入 死 亡 的 途 徑 。 1- 5 細 胞 凋 亡 (apoptosis) 與 壞 死 ( ne c r os i s ) 的 介 紹 細 胞 死 亡 可 分 為 兩 部 分 ， 細 胞 凋 亡(apoptosis)以 及 細 胞 壞 死
(necrosis)， 因 此 兩 種 死 亡 路 徑 對 細 胞 的 型 態 、 分 子 層 次 間 ， 如 生 理 學 都 不 一 樣[71]。 下 表 為 分 類 兩 種 死 亡 途 徑 的 差 異 。 本 實 驗 是 針 對 非 小 細 胞 肺 腺 癌 細 胞(non small lung cancer cell, A549)給 予 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 結 合 一 標 靶 蛋 白 質 分 子 複 合 體 經 脈 衝 雷 射 照 射(irradiation)後 死 亡 ， 並 以 結 果 去 探 討 證 實 非 小 細 胞 肺 腺 癌 細 胞 是 經 由 凋 亡 路 徑 而 死 亡 的 。 表 1 細 胞 自 然 凋 亡 與 壞 死 介 紹 細 胞 凋 亡 (apoptosis) 細 胞 壞 死 (necrosis) 細 胞 型 態 學[72,73] 活 組 織 內 只 單 顆 細 胞 受 影 響 組 織 結 構 被 破 壞 、 成 片 的 細 胞 死 亡 細 胞 膜 皺 縮 細 胞 腫 脹 後 溶 胞 細 胞 膜 完 整 ， 但 有 出 泡 現 象 質 膜 完 全 破 壞 胞 器 均 保 持 完 整 胞 器 腫 脹 、 破 壞 細 胞 核 固 縮 、 核 酸 會 有 序 的 斷 裂 核 酸 隨 機 的 斷 裂 會 形 成 凋 亡 小 體 完 全 溶 胞 ， 不 會 形 成 凋 亡 小 體 生 物 化 學 特 徵[74] 需 要 能 量(ATP)、 主 動 發 生 不 需 要 能 量 、 被 動 發 生 開 始 核 酸 就 斷 裂 溶 胞 後 核 酸 才 斷 裂 有 離 子 調 節 其 平 衡 無 離 子 調 節 平 衡 跑 電 泳 時 ，DNA 呈 梯 狀 電 泳 DNA 呈 現 條 帶 狀 生 理 學 特 徵[75,76] 生 理 性(如 細 胞 老 化 )刺 激 誘 發 不 會 出 現 於 正 常 生 理 條 件 由 鄰 近 或 巨 噬 細 胞 吞 噬 由 巨 噬 細 胞 吞 噬 無 發 炎 反 應 產 生 有 急 性 發 炎 產 生
第 二 章 研 究 動 機
標 靶 治 療 是 目 前 醫 療 發 展 的 趨 勢 ， 是 為 了 達 到 有 效 殺 死 腫 瘤 細 胞 而 對 正 常 細 胞 不 會 造 成 傷 害 ， 更 不 讓 病 人 因 化 療 而 造 成 身 體 不 適 及 副 作 用 ， 故 本 實 驗 室 將 結 合 現 今 蓬 勃 發 展 的 奈 米 科 技 與 具 有 標 把 追 蹤 性 的 生 物 分 子 ， 開 發 出 此 一 複 合 物 的 標 靶 治 療 系 統 。 奈 米 材 料 由 工 業 應 用 跨 足 到 醫 學 及 生 物 科 技 領 域 ， 是 奈 米 科 學 發 展 的 重 要 研 究 方 向 ； 現 今 奈 米 等 級 的 材 料 在 生 物 醫 學 領 域 上 之 應 用 ， 需 考 量 如 生 物 相 容 性 、 生 物 穩 定 性 、 對 細 胞 是 否 具 毒 性 等 層 面 的 問 題 ， 因 此 本 實 驗 中 所 選 用 的 奈 米 鑽 石 ， 具 有 高 度 生 物 相 容 性 、 無 毒 性[42,77]、 並 由 於 其 由 碳 原 子 組 成 反 應 活 性 不 高 ， 不 易 造 成 非 預 期 的 生 理 反 應 。 其 中 奈 米 鑽 石 最 令 人 驚 豔 的 特 點 是 具 有 連 續 的 螢 光 光 譜 ， 可 利 用 此 一 特 性 協 助 追 蹤 奈 米 鑽 石 在 生 物 體 中 的 位 置 做 為 生 物 標 定(bio-maker)， 以 及 吸 收 脈 衝 能 量 後 ， 會 使 奈 米 鑽 石 的 分 子 結 構 由sp3轉 變 成sp2， 體 積 也 隨 之 變 大 十 幾 倍 ， 稱 之 為 奈 米 爆 炸 效 應 。本 實 驗 將 研 究 與 探 討 針 對 非 小 細 胞 肺 腺 癌 細 胞(non small lung cancer cell, A549)， 給 予 上 述 特 性 的 奈 米 鑽 石 結 合 一 標 靶 蛋 白 質 分 子 複 合 體 ， 經 脈 衝 雷 射 照 射(irradiation)後 其 癌 症 細 胞 的 死 亡 機 制 與 此 複 合 體 的 靶 向 性 ， 發 展 出 一 套 可 消 滅 癌 細 胞 的 標 靶 治 療 的 平 台 。
第 三 章 實 驗 架 構
3- 1 魚 類 和 哺 乳 類 動 物 生 長 激 素 的 胺 基 酸 序 列 與 親 緣 關 係 與 演 化 分 析 已 知 魚 類 和 哺 乳 類 動 物 的 生 長 激 素 都 可 經 由 活 化 生 長 激 素 受 體 而 誘 發 一 連 串 的 訊 號 傳 遞[78,79]， 因 此 在 功 能 上 具 有 顯 著 的 相 似 性 ， 然 而 隨 著 演 化 時 間 的 增 加 ， 不 同 物 種 間 的 歧 異 度 會 逐 漸 加 深 ， 因 此 比 對 魚 類 及 哺 乳 類 生 長 激 素 的 胺 基 酸 序 列 將 使 我 們 了 解 物 種 在 演 化 過 程 中 的 序 列 保 留 度 和 其 差 異 性[80]。 瞭 解 這 些 差 異 性 可 使 我 們 對 得 知 魚 類 和 人 類 在 親 源 演 化 上 的 歧 異 度 。 並 利 用 這 些 親 緣 關 係 圖 以 便 找 出 能 與 奈 米 鑽 石 作 結 合 且 不 影 響 細 胞 增 長 活 性 的 標 靶 蛋 白 。 圖 3-1-1 魚 類 和 哺 乳 類 動 物 的 親 源 演 化 樹 是 以 15 個 物 種 間 的 生 長 激 素 的 胺 基 酸 序 列 的 保 留 性 來 推 算 其 演 化 距 離 。 圖 中 鱸 形 目 (Percifor me s) 包 含 了 青 石 斑 (Yello w g roup )、 真 鯛 (Red sea bream) 、 黃 鰭 鯛 (Yellow tail) 和 吳 郭 魚(Tilapia)， 鮭 形 目 (Salmo nifo rmes)包 含 虹 鱒 (Rainbow trou t)、 鮭 (Chu m salmon) 和 香 魚(Ayu)， 斑 馬 魚 (Zebrafish) 和 鯉 魚 (Carp)屬 於 鲤 形 目 (Cyp riniformes)， 鰻 魚 (Eel) 是 鰻 鱺 目(Anguilliformes)，而 中 國 倉 鼠 (Hamster)、老 鼠 (Mouse)、大 老 鼠 (Rat)、牛 (Bov in e ) 和 人 類(Human)則 是 哺 乳 綱 (Ma mma lia)。3- 2 青 石 斑 魚 生 長 激 素 是 人 類 生 長 激 素 的 相 似 物
人 類 屬 於 高 等 脊 椎 動 物 ， 而 魚 類 卻 是 低 等 脊 椎 動 物 ， 但 其 生 長 激 素 有 相 似 的 功 能 。 圖 3-2-1 是 利 用 NCBI 比 對 此 兩 物 種 間 的 胺 基 酸 序 列 ， 得 知
青 石 斑 魚 的 生 長 激 素 和 人 類 生 長 激 素 在 演 化 上 的 歧 異 度 大 ， 但 在 胺 基 酸 序 列 上 仍 保 有 32.4 %的 一 致 性 ， 青 石 斑 魚 和 斑 馬 魚 則 保 有 54 %的 序 列 一 致 性，斑 馬 魚 和 人 類 則 有 40 %的 序 列 一 致 性，先 前 也 證 實 了 10pM 的 人 類 生 長 激 素 仍 可 使 斑 馬 魚 的 肝 臟 細 胞 有 10 %的 增 生 效 果 [81]， 故 使 用 斑 馬 魚 生 長 激 素 刺 激 人 類 細 胞 仍 有 誘 使 人 類 細 胞 增 生 的 可 能 性 ， 因 此 們 選 用 親 源 演 化 距 離 更 遠 的 青 石 斑 魚 生 長 激 素 作 為 功 能 性 結 合 奈 米 鑽 石 的 生 物 分 子 ， 使 奈 米 鑽 石 複 合 體 具 有 標 靶 性 但 卻 不 因 蛋 白 質 的 功 能 而 引 發 生 物 細 胞 內 部 的 高 度 訊 號 傳 遞 ， 產 生 無 法 預 期 的 副 作 用 。 由 圖 3-2-2 序 列 比 對 下 可 得 知 青 石 斑 魚 的 生 長 激 素 與 人 類 生 長 激 素，兩 者 間 具 有 32.4 %的 相 同 度 和 50.2 % 的 相 似 性 ， 因 此 可 以 將 青 石 斑 魚 的 生 長 激 素 視 為 人 類 生 長 激 素 的 相 似 物 。 圖 3-2-1 人 類 和 青 石 斑 魚 的 生 長 激 素 的 胺 基 酸 序 列 比 對 上 排 序 列 為 人 類 生 長 激 素 ， 下 排 為 青 石 斑 魚 的 生 長 激 素 。
圖
3-2-2 人 類 和 青 石 斑 魚 的 生 長 激 素 結 合 位 的 胺 基 酸 序 列 比 對 。
圖 中 紅 色 、 綠 色 、 藍 色 和 粉 紅 色 分 別 為 正 電 、 負 電 、 極 性 和 非 極 性 的 胺 基 酸 ； 灰 色 區 域 為 訊 號 序 列(signal peptid e)； 置 底 黑 線 表 螺 旋 區 域 ； 框 住 的 區 域 為 生 長 激 素 對 應 生 長 激 素 受 體 的 特 定 結 合 位 置 1 (ep itop e)； 粗 體 字 為 生 長 激 素 的 特 定 結 合 位 置 2。
3- 3 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 的 取 得 與 表 現 青 石 斑 魚 的 蛋 白 質 序 號 為 AAL36937， 為 本 實 驗 室 先 前 將 其 基 因 重 組 蛋 白 rEaGH 表 現 出 來 的 [82]， 由 NCBI 網 站 取 得 青 石 斑 魚 的 基 因 序 列 後 並 設 計 出 新 的 重 組 蛋 白 基 因 ， 並 將 重 組 基 因 送 入 大 腸 桿 菌 中 表 現 此 重 組 蛋 白 質 。 圖 3-3-1 (a)為 青 石 斑 魚 生 長 激 素 EaGH 的 胺 基 酸 序 列 ， 紅 色 部 份 為 訊 號 序 列 ， 在 重 組 生 長 激 素 中 是 不 具 此 紅 色 區 域 中 的 序 列 ； 圖 3-3-1 (b)為 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素(recombinant EaGH, rEaGH) 的 胺 基 酸 序 列，藍 色 部 份 為 人 工 合 成 並 加 入 的 區 域；圖 3-3-1 (c)為 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 DNA 序 列 重 組 生 長 激 素 是 經 由 去 除 訊 號 序 列(紅 色 區 域 )並 加 上 人 工 合 成 (藍 色 區 域 )的 序 列 所 構 成 。 當 大 腸 桿 菌 開 始 成 長 時 ， 細 胞 中 就 含 有 許 多 不 同 種 類 的 可 溶 性 蛋 白 質，一 旦 加 入 IPTG 誘 導 rEaGH 蛋 白 質 表 現 時，細 菌 中 的 蛋 白 質 組 成 比 例 將 有 所 改 變 。 收 集 大 腸 桿 菌 並 經 由 細 胞 破 碎 機 的 壓 迫 將 所 有 的 蛋 白 質 萃 取
出 ， 藉 由 離 心 分 離 將 蛋 白 質 分 為 可 溶 性 及 不 可 溶 的 兩 大 類 蛋 白 質 ， 不 可 溶 的 蛋 白 質 大 多 是 由 rEaGH 所 組 成 ， 因 rEaGH 在 大 腸 桿 菌 中 被 視 為 不 具 價 值 的 物 質，經 由 IPTG 的 誘 導 及 長 時 間 的 培 養，大 量 的 rEaGH 以 錯 誤 的 摺 疊 形 式 囤 積 在 內 含 體(incusion body )中 ， 因 此 在 培 養 16 小 時 的 全 細 胞 溶 液(total cell lysate)中 有 許 多 rEaGH 的 存 在 。 其 分 子 量 為 22.3kDa。
(a) EaGH amino acid sequence
1 MDRVVLLLSVVSLGVSSQPITDGQRLFSIAVSRVQHLHLLAQRLFSDFESSLQTEEQRQL 61 NKIFLQDFCNSDYIISPIDKHETQRSSVLKLLSISYRLVESWEFPSRSLSGGSAPRNQIF 121 PKLSELKTGILLLIRANQDGAELFPDSSALQLAPYGNYYQSLGADESLRRTYELLACFKK 181 DMHKVETYLTVAKCRLSPEANCTL
(b) rEaGH amino acid sequence
1 MITDGQRLFSIAVSRVQHLHLLAQRLFSDFESSLQTEEQRQLNKIFLQDFCNSDYIISPI 61 DKHETQRSSVLKLLSISYRLVESWEFPSRSLSGGSAPRNQIFPKLSELKTGILLLIRANQ 121 DGAELFPDSSALQLAPYGNYYQSLGADESLRRTYELLACFKKDMHKVETYLTVAKCRLSP 181 EANCTLLEHHHHHH
(c) rEaGH DNA sequence
1 ATGATCACAG ACGGCCAGCG ACTGTTCTCC ATCGCTGTCA GCAGAGTTCA 51 ACATCTCCAC CTGCTTGCTC AGAGACTCTT CTCCGACTTT GAGAGCAGTC 101 TGCAGACAGA GGAGCAGCGA CAGCTCAACA AGATCTTCCT GCAGGACTTT 151 TGTAACTCTG ATTACATCAT CAGCCCCATT GACAAGCATG AGACGCAGCG 201 CAGCTCCGTG TTGAAGCTGT TGTCGATCTC CTATCGGTTG GTGGAGTCCT 251 GGGAGTTCCC CAGTCGGTCC CTGTCCGGAG GTTCTGCTCC CAGAAACCAG 301 ATTTTTCCCA AACTGTCTGA ATTGAAAACT GGGATCCTGC TGCTGATCAG 351 GGCCAATCAG GACGGAGCGG AGCTCTTTCC TGACAGCTCC GCCCTCCAGT 401 TGGCTCCTTA TGGGAACTAT TATCAGAGTC TGGGCGCAGA CGAGTCGCTG 451 CGACGAACGT ACGAACTGCT GGCGTGTTTC AAGAAAGACA TGCACAAGGT 501 GGAGACCTAC CTGACGGTGG CTAAATGTCG ACTCTCTCCT GAGGCCAACT 551 GTACCCTGCT CGAGCACCAC CACCACCACC ACTGA
圖 3-3-1 (a)、(b)、 (c) 青 石 斑 魚 生 長 激 素 的 胺 基 酸 序 列 及 其 重 組 生 長 激 素 的 DNA 及 胺 基 酸 序 列 。(a)為 青 石 斑 魚 生 長 激 素 EaGH 的 胺 基 酸 序 列 ， 紅 色 部 份 為 訊 號 序 列 (b) 為 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素(reco mbinant EaGH, rEaGH) 的 胺 基 酸 序 列 ， 藍 色 部 份 為 人 工 合 成 並 加 入 的 區 域 ； (c)為 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 DNA 序 列 重 組 生 長 激 素 是 經 由 去 除 訊 號 序 列(紅 色 區 域 )並 加 上 人 工 合 成 (藍 色 區 域 )的 序 列 所 構 成 。 3- 4 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 和 蛋 白 質 的 鍵 結 為 了 產 生 具 有 生 物 標 靶 性 的 奈 米 鑽 石 ， 利 用 物 理 吸 附 或 是 化 學 鍵 結 合 方 式 將 生 物 分 子 與 奈 米 鑽 石 結 合 是 必 需 的 。 雖 然 物 理 吸 附 也 可 得 到 奈 米 鑽 石-生 物 分 子 複 合 體 [83]， 且 其 反 應 方 式 也 較 為 簡 便 ， 但 利 用 物 理 吸 附 於 奈 米 鑽 石 表 面 的 生 物 分 子 往 往 也 會 因 週 遭 環 境 的 改 變 如 溫 度 或 pH 質 而 改 變 其 電 性 等 物 理 特 性 ， 使 生 物 分 子 脫 附[84]。 因 此 物 理 吸 附 雖 可 得 到 奈 米 鑽 石-生 物 分 子 複 合 體 的 產 物，但 產 物 較 難 長 期 穩 定 性 的 存 在，且 具 有 環 境 變 異 性 的 奈 米 鑽 石-生 物 分 子 複 合 體 不 適 用 於 高 風 險 的 醫 學 治 療，因 此 化 學 鍵 結 合 是 較 為 恰 當 的 方 式 。 生 物 分 子 是 由 碳 、 氫 、 氧 、 氮 等 多 種 元 素 構 成 ， 故 在 一 般 的 生 物 分 子 上 多 具 有 氫 氧 基(-OH)、 硫 醇 基 (-SH)、 羧 酸 基 (-COOH)、 羰 基 (-C=O)、 胺 基(-NH2)等 各 式 的 官 能 基 ， 可 作 為 化 學 表 面 修 飾 結 合 的 選 擇 依 據 ， 又 經 強 酸 氧 化 的 奈 米 鑽 石 也 具 有 特 殊 官 能 基 ， 故 化 學 鍵 結 合 將 考 量 奈 米 鑽 石 和 生 物 分 子 的 官 能 基 種 類 及 數 量 ， 選 擇 出 具 有 最 高 合 成 效 率 的 化 學 反 應 作 為 開 發 具 標 靶 性、穩 定 性 的 生 物 分 子-奈 米 鑽 石 複 合 體 的 依 據。而 本 實 驗 室 先 前 實 驗 已 利 用 基 質 輔 助 雷 射 脫 附 游 離 時 序 飛 行 式 質 譜 儀(MALDI-TOF)證 明 此 實 驗 所 用 的 生 物 標 靶 分 子(rEaGH)與 奈 米 鑽 石 所 形 成 的 複 合 體 是 藉 由 化 學 反 應 生 成 共 價 鍵 的 方 式 互 相 結 合 ， 並 以 rEaGH:cND = 2:1 的 個 數 比 作 為 鍵 結 。 3- 5 奈 米 鑽 石 和 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 在 生 物 特 性 與 毒 性 的 檢 測 將 奈 米 鑽 石 和 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 投 入 到 癌 症 細 胞 作 其 標 靶 藥 物 前 ， 所 要 考 慮 的 就 是 其 生 物 相 容 性 及 是 否 細 胞 造 成 毒 性 傷 害 。 而 在 本 實 驗 室 與 合 作 夥 伴 們 先 前 研 究 中 證 實 沒 有 經 過 表 面 修 飾 的 奈 米 鑽 石 對 細 胞 不 會 造 成 毒 害 且 具 有 生 物 相 容 性 的[42]； 而 羧 酸 化 過 的 奈 米 鑽 石 在 先 前 實 驗 中 也 證 實 羧 酸 化 的 奈 米 鑽 石 對 A549 細 胞 生 長 也 無 影 響 [85]，因 此 奈 米 鑽 石 與 經 由 表 面
羧 酸 化 過 後 的 奈 米 鑽 石 都 是 具 有 生 物 相 容 性 的 ， 是 可 以 應 用 在 生 物 醫 學 領 域 。 3- 6 青 石 斑 魚 的 重 組 生 長 激 素 (rEaGH ) 和 重 組 基 因 魚 類 生 長 激 素 - 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 複 合 體 (cND-rEaGH complex)的 生 物 特 性 檢 測 在 3-5 節 中 已 說 明 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 是 具 有 生 物 相 容 性 對 細 胞 不 具 有 毒 性 ， 且 在 3-2 節 中 的 序 列 比 對 下 得 知 青 石 斑 魚 生 長 激 素 是 為 人 類 生 長 激 素 的 相 似 物，但 是 需 要 釐 清 青 石 斑 魚 的 重 組 生 長 激 素(rEaGH)和 重 組 基 因 魚 類 生 長 激 素-羧 酸 化 奈 米 鑽 石 複 合 體 (cND-rEaGH complex)是 否 可 以 被 生 物 體 接 受 而 不 會 造 成 毒 性 ； 而 由 本 實 驗 室 先 前 實 驗 的 結 果 顯 示 對 A549 細 胞 加 入 青 石 斑 魚 的 重 組 激 素(rEaGH)和 重 組 基 因 魚 類 生 長 激 素 -羧 酸 化 奈 米 鑽 石 複 合 體(cND- rEaGH complex)對 其 細 胞 生 長 數 目 都 不 會 造 成 顯 著 影 響 。 因 此 重 組 基 因 魚 類 生 長 激 素-羧 酸 化 奈 米 鑽 石 複 合 體 (cND-rEaGH complex)可 是 為 無 毒 性 的 標 靶 性 藥 物 。 3- 7 選 定 何 種 癌 症 細 胞 為 奈 米 鑽 石 - 生 長 激 素 複 合 體 的 標 靶 細 胞 由 上 述 可 得 知 rEaGH 是 人 類 生 長 激 素 的 相 似 物，因 此 認 為 cND-rEaGH 對 具 有 生 長 激 素 受 體 的 細 胞 會 有 靶 向 性 ， 所 以 須 找 出 何 種 細 胞 具 有 生 長 激 素 受 體 。 因 此 利 用 西 方 墨 點 法 來 分 析 肺 腺 癌 細 胞(A549)、 中 國 倉 鼠 卵 巢 癌 細 胞(CHO-K1)、 肝 癌 細 胞 (Hep G2)此 三 細 胞 株 何 種 帶 有 生 長 激 素 的 受 體 。 而 從 本 實 驗 室 先 前 實 驗 所 做 出 的 結 果 顯 示(圖 3-7-1)生 長 激 素 受 體 存 在 於 A549 和 Hep G2， 而 CHO-K1 並 不 具 有 生 長 激 素 受 體 ， 且 A549 的 生 長 激 素 受 體 表 現 量 又 多 於 Hep G2， 因 此 本 實 驗 選 用 A549 作 為 cND-rEaGH 的 靶 向 細 胞[86]。
以 西 方 墨 點 法 檢 測 生 長 激 素 受 體 的 免 疫 染 色 過 程 中 ， 是 利 用 抗 人 類 生 長 激 素 受 體 的 多 株 抗 體 做 為 一 抗 ， 偵 測 人 類 生 長 激 素 受 體 是 否 存 在 ， 且 利 用 抗 人 類 肌 動 蛋 白(actin)的 單 株 抗 體 ， 偵 測β−actin 作 為 樣 本 間 的 對 照 組 (internal control)。
圖 3-7-1 利 用 西 方 墨 點 法 免 疫 呈 色 法 偵 測 不 同 細 胞 之 人 類 生 長 激 素 受 體 (GHR)的 表 現 差 異 。 下 圖 以β-actin 作 為 本 實 驗 的 對 照 組 。 3- 8 熱 聲 子 (hot phonon) 效 應 對 5 nm 奈 米 鑽 石 的 影 響 在 物 理 角 度 來 說，聲 子(phonon)是 指 在 堅 硬 的 結 晶 晶 格 中 發 生 震 動 的 量 子 化 模 式 。 而 在 生 物 領 域 中 ， 聲 子 的 振 動 模 式 理 論 被 應 用 在 原 子 間 擾 動 或 斷 鍵 的 基 礎 模 式 ， 其 原 因 是 由 於 聲 子 會 形 成 一 頻 率 與 波 動 可 以 使 原 子 間 造 成 移 位 ， 這 樣 的 轉 換 可 以 使 原 子 間 進 行 斷 鍵 與 新 的 鍵 結 形 成[87]。 本 實 驗 為 了 產 生 熱 聲 子(hot phonon)效 應 [70,88]， 利 用 奈 秒 脈 衝 雷 射 使 5 nm 奈 米 鑽 石 從 原 本 內 部 具 有 nitrosol(-C-N=O)官 能 基 ， 瞬 間 轉 換 變 成 了 -C 和 N≡O。 此 熱 聲 子 效 應 使 得 在 奈 米 鑽 石 核 心 中 的 一 氧 化 氮 (NO)氣 體 被 釋 放 出 來 ， 整 體 分 子 結 構 由 sp3轉 變 成 sp2 ， 瞬 間 體 積 膨 脹 幾 十 倍 之 多 ， 就 猶 如 爆 炸 效 應 一 般 。 因 此 此 實 驗 利 用 熱 聲 子 效 應 使 奈 米 鑽 石 結 構 的 劇 烈 改 變 ， 應 用 在 生 醫 領 域 上 ， 並 加 以 詳 細 探 討[44,89]。 3- 9 奈 秒 脈 衝 雷 射 對 奈 米 鑽 石 - 生 長 激 素 複 合 體 的 應 用 奈 米 鑽 石 經 由 奈 秒 脈 衝 雷 射 照 射 後 ， 因 熱 聲 子 效 應 使 奈 米 鑽 石 讓 其 分 子 結 構 由 sp3轉 變 成 sp2，此 時 就 像 爆 炸 一 樣，體 積 膨 脹 了 十 幾 倍 之 多[44]； 因 此 與 腫 瘤 細 胞 結 合 的 奈 米 鑽 石-生 長 激 素 複 合 體 經 體 外 雷 射 的 照 射 變 形 而 破 壞 腫 瘤 細 胞 ， 達 到 不 侵 入 活 體 ， 而 能 移 除 腫 瘤 的 目 的 。 如 圖 3-9-1 所 示 。
GHR
( 7 2 k D )β-actin
(43 kD)圖 3-9-1 奈 秒 脈 衝 雷 射 對 奈 米 鑽 石 -生 長 激 素 複 合 體 在 癌 症 細 胞 上 的 應 用 示
Pulse
LASER
第 四 章 實 驗 原 理
4- 1 大 量 獲 得 青 石 斑 魚 的 重 組 生 長 激 素
將 已 轉 殖 之 青 石 斑 魚 重 組 基 因 的 大 腸 桿 菌 於 在 開 始 快 速(O.D.約 0.3~ 0.6)成 長 時，配 合 IPTG 的 誘 導 14~ 16 小 時 的 長 時 間 培 養 產 生 大 量 青 石 斑 魚 的 重 組 生 長 激 素(rEaGH)， 其 產 量 為 每 一 公 升 的 菌 液 經 由 可 產 生 約 250 mg 的 內 含 體 (inclusion body)蛋 白 質 ， 但 此 時 的 rEaGH 蛋 白 質 卻 無 法 直 接 使 用 ， 因 為 其 錯 誤 摺 疊 形 式 不 具 有 任 何 生 物 功 能 性 ， 為 了 使 所 培 養 出 來 的 蛋 白 質 具 有 正 常 的 活 性 ， 因 此 必 須 使 蛋 白 質 重 新 摺 疊 回 到 正 確 的 摺 疊 型 式 ， 而 摺 疊 的 第 一 步 就 是 對 維 持 蛋 白 質 一 級 結 構 的 胜 肽 鍵(peptide bond)之 外 的 所 有 鍵 結 加 以 破 壞 ， 如 雙 硫 鍵 ， 並 利 用 本 實 驗 室 已 發 展 成 熟 的 蛋 白 質 摺 疊 技 術[90]重 新 摺 疊 內 含 體 中 錯 誤 的 青 石 斑 魚 重 組 蛋 白 質 [82,91]。 4-2 5 nm 奈 米 鑽 石 表 面 羧 酸 化 為 了 讓 奈 米 鑽 石 與 蛋 白 質(青 石 斑 魚 的 重 組 生 組 激 素 )以 化 學 鍵 的 型 式 鍵 結 ， 不 至 於 像 物 理 吸 附(如 電 性 吸 附 )般 容 易 受 溶 液 環 境 影 響 而 脫 落 ； 且 又 因 蛋 白 質 有 很 多 的 羧 酸 基(-COOH)和 胺 基 (-NH2)，因 此 將 5 nm 的 奈 米 鑽 石 的 表 面 羧 酸 化 ， 使 其 表 面 帶 有(-COOH)的 官 能 基 ， 可 以 與 蛋 白 質 用 分 子 連 結 劑(crosslinker)作 化 學 鍵 的 鍵 結， 形 成 5 nm 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 複 合 體 。 4-3 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 螢 光 光 譜 測 定 在 先 前 的 文 獻 中 已 說 明 過[39]，因 為 奈 米 鑽 石 的 晶 格 缺 限 因 此 有 螢 光 產 生 ， 為 了 需 要 更 加 了 解 5 nm 羧 酸 化 後 的 奈 米 鑽 石 的 螢 光 光 譜 以 利 之 後 激 發 波 段 的 選 用 。 本 實 驗 使 用 Hitachi F-7000 機 型 去 分 析 羧 酸 化 的 奈 米 鑽 石 的 三 維(3D)螢 光 光 譜 ； 在 一 個 未 知 其 螢 光 光 譜 的 物 質 ， 三 維 螢 光 光 譜 提 供 了 一 個 了 解 其 全 波 段 螢 光 的 分 析 方 法 ； 因 此 將 羧 酸 化 的 奈 米 鑽 石 溶 於 去 離 子 水 後 ， 放 入 樣 品 分 析 槽 中 後 ， 設 定 掃 描 三 維 全 螢 光 光 譜 ， 進 行 分 析 。 4- 4 動 態 光 散 色 儀 測 定 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 粒 徑
動 態 光 散 射 儀 （dynamic light scattering ,DLS） ： DLS 又 稱 為 光 子 關 聯 光 譜 法 （photon correlation spectroscopy, PCS） [92]， 其 利 用 雷 射 光 射 入 含
有 粒 子 的 溶 液 中 ， 當 雷 射 光 撞 擊 到 粒 子 後 會 產 生 散 射 光 ， 而 散 射 光 強 度 會 隨 時 間 產 生 變 化 ， 因 此 量 測 散 射 光 而 計 算 出 粒 子 之 粒 徑 分 佈 。 主 要 是 由 於 粒 子 處 於 溶 液 中 ， 本 身 具 有 動 能 而 產 生 不 規 則 的 布 朗 運 動 （Brownian motion） ， 粒 子 的 大 小 可 影 響 粒 子 之 擴 散 速 度 與 布 朗 運 動 ， 且 在 雷 射 光 照 射 的 區 域 粒 子 數 量 和 位 置 不 同 ， 使 得 訊 號 到 達 偵 測 器 時 會 產 生 強 度 差 異 ， 產 生 光 線 強 度 ， 且 粒 子 位 置 會 隨 時 間 改 變 ， 因 此 散 射 光 強 度 亦 會 隨 時 間 改 變，利 用 時 序 上 的 自 我 關 聯 的 函 數 來 求 得 其 擴 散 係 數，帶 入 Stokes-Einstein function 中 ， 即 可 求 得 蛋 白 質 粒 子 水 合 半 徑 的 分 布 [93,94]。 Stokes-Einstein 方 程 式: (1) D 是 擴 散 係 數，k 是 波 茲 曼 常 數，T 是 絕 對 溫 度，η 為 溶 液 之 黏 滯 係 數， RH
為 水 合 半 徑 。 本 實 驗 所 使 用 的 為 Brookhaven Instruments Corporation (Long Island, NY, USA ) 型 號 BI-200SM 的 DLS。 透 過 DLS 的 分 析 可 以 幫 助 瞭 解 奈 米 鑽 石 粒 徑 大 小 分 布 狀 況 。 4- 5 共 價 鍵 結 合 的 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 - 蛋 白 質 複 合 體 為 了 將 羧 酸 化 的 奈 米 鑽 石 與 蛋 白 質 以 化 學 鍵 結 的 方 式 結 合 在 一 起 ， 因 此 本 實 驗 選 用 零 鍵 結 長 度 的 分 子 連 結 劑(cross-linker) 1-乙 基 -3-（ 3-二 甲 胺 丙 基 ） 碳 二 醯 胺 鹽 酸((1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride)，EDC)[95]做 為 連 結 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 羧 酸 基 (-COO-)和 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 蛋 白 質 的 胺 基(NH3+)的 工 具。其 中 一 開 始 EDC 須 在 酸 性 環 境 中 將 帶 有 羧 酸 基 的 分 子 活 化 ， 形 成 活 化 的 氧 乙 醯 化 異 尿 素 酯
(O-acylisourea reactive ester)中 間 產 物，才 能 加 入 胺 基 分 子， 以 形 成 穩 定 存 在 的 胜 肽 鍵 (peptide bond)， 而 最 終 的 反 應 產 物 是 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 蛋 白 質 的 複 合 體(5 nm cND-rEaGH complex)。 使 用 EDC 作 為 分 子 連 結 劑 有 許 多 的 優 點 ： (1) EDC 是 作 用 於 兩 個 不 同 官 能 基 間 的 分 子 連 結 劑 ， 故 具 有 特 定 的 活 化 順 序 ；(2) EDC 僅 協 助 兩 個 分 子 間 進 行 鍵 結 ， 作 用 完 後 並 不 會 有 任 何 部 分 被 併 入 產 物 中 ， 也 就 是 不 會 對 產 物 進 行 任 何 不 必 要 修 飾，因 此 EDC 將 完 全 由 產 物 中 被 移 除。進 行 鍵 結 時 需 注 意 溶 液 中 不 能 含 有 任 何 胺 基 ， 像 是 一 般 常 用 的 三 羥 甲 基 氫 基 甲 烷 緩 衝 H
溶 液(tris[hydroxymethyl]aminomethane buffer， Tris buffer)就 含 有 胺 基 ， 會 和 我 們 所 加 入 的 胺 基 分 子 共 同 競 爭 羧 酸 基 的 鍵 結 反 應 ， 應 注 意 避 免 使 用 。
圖 4-5-1 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 與 青 斑 魚 重 組 生 長 激 素 結 合 示 意 圖 。 利 用 1 -乙 基 -3-（ 3-二 甲 胺 丙 基 ） 碳 二 醯 胺 鹽 酸 將 羧 基 分 子 與 胺 基 分 子 進 行 共 價 鍵 的 結 合 。
4- 6 細 胞 的 培 養
本 實 驗 所 選 用 的 細 胞 是 非 小 細 胞 肺 腺 癌 細 胞(non small cell lung cancer, A549)[96]，此 細 胞 來 源 為 ATCC；其 原 始 來 源 是 從 一 58 歲 白 種 男 性 的 肺 癌 組 織 所 取 得 的。此 細 胞 是 用 Ham-F12 培 養 液 並 加 入 10% 胎 牛 血 清 (FBS)及 100 unit/ ml 盤 尼 西 林 (penicillin)、 100 μg/ ml 鏈 黴 素 (streptomycin)抗 生 素 等 所 培 養 的 ， 並 在 具 有 5%二 氧 化 碳 、 95%濕 度 及 溫 度 維 持 在 37℃的 培 養 箱 中 生 長 。 4- 7 奈 秒 雷 射 能 量 對 cND-rEaGH 在 細 胞 上 的 影 響 在 雷 射 能 量 的 選 用 上 是 須 考 慮 以 下 兩 點: (1)在 無 加 入 奈 米 鑽 石 複 合 體 的 肺 腺 癌 細 胞 A549 情 況 下 ， 在 雷 射 處 理 下 ， 細 胞 能 藉 由 熱 傳 導 的 方 式 將 能 量 傳 走 ， 對 細 胞 本 身 不 會 有 傷 害 性 的 ；(2)對 加 入 奈 米 鑽 石 複 合 體 的 肺 腺 癌 細 胞 A549，會 因 細 胞 上 的 奈 米 鑽 石 吸 收 雷 射 能 量 而 產 生 熱 聲 子 效 應，使 其 爆 炸 ， 讓 細 胞 受 到 傷 害 ； 因 此 在 能 量 選 擇 上 ， 是 需 要 讓 有 與 無 加 入 奈 米 鑽 石，並 經 奈 秒 雷 射 處 後 的 肺 腺 癌 細 胞 A549 所 造 成 的 影 響 是 有 差 異 性 的。 4- 8 檢 測 cND-rEaGH 在 細 胞 上 經 熱 聲 子 效 應 後 的 分 析 4-8-1 細 胞 型 態 學 (Morphology) 細 胞 在 經 過 外 界 環 境 所 給 予 的 ㄧ 些 壓 力、藥 物 等 等，因 為 細 胞 已 受 到 傷 害 ， 所 以 從 外 觀 就 可 觀 察 到 其 型 態 已 發 生 改 變 ， 如 拉 長 或 無 法 附 著 在 培 養 皿 上 ； 因 此 本 實 驗 藉 由 倒 立 式 螢 光 顯 微 鏡 觀 察 分 別 加 入 青 石
斑 石 重 組 生 長 激 素(rEaGH)、 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 (cND)、 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 石 重 組 生 長 激 素 複 合 體(cND-rEaGH)以 及 對 照 組 (control)， 再 分 別 有 奈 米 雷 射 照 射 與 無 奈 秒 雷 射 照 射 ， 前 後 20 小 時 ， 共 16 組 ， 觀 察 細 胞 型 態 的 改 變 。 4-8-2 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 ( Sc an n i ng E l e c t ro n M i c ro s c o pe , SE M ) 在 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 中 ， 被 電 磁 透 鏡 聚 集 的 電 子 束 經 由 兩 組 掃 描 線 圈(scanning coils)使 之 規 則 的 在 樣 品 上 來 回 移 動，即 是 所 謂 的 掃 描 ， 其 掃 描 的 範 圍 與 速 度 是 可 以 控 制 的 。 當 電 子 束 撞 擊 在 樣 品 上 特 定 的 位 置 時 ， 所 產 生 的 二 次 電 子 或 背 向 散 射 電 子 被 偵 測 器 接 收 後 經 轉 換 放 大 傳 送 至 螢 光 幕 即 可 顯 像[97]。 本 實 驗 利 用 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 來 觀 察 前 後 加 入 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 石 重 組 生 長 激 素 複 合 體(cNDrEaGH)以 及 加 入 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 石 重 組 生 長 激 素 複 合 體(cND-rEaGH)並 經 奈 秒 雷 射 照 射 後 的 肺 腺 癌 細 胞(A549)型 態 。
4-8-3 免 疫 細 胞 化 學 染 色 (Immunocytochemi stry, ICC)
此 分 析 方 法 是 指 在 抗 體 上 結 合 螢 光 或 可 呈 色 的 化 學 物 質 ， 利 用 免 疫 學 原 理 中 抗 原 和 抗 體 間 專 一 性 的 結 合 反 應 ， 檢 測 細 胞 或 組 織 中 是 否 有 目 標 抗 原 的 存 在 ， 此 方 式 不 只 可 以 用 來 測 知 抗 原 的 表 現 量 也 可 觀 察 抗 原 所 表 現 的 位 置 。 只 要 是 能 夠 讓 抗 體 結 合 的 物 質 ， 也 就 是 具 有 抗 原 性 的 物 質 包 括 蛋 白 質 、 核 酸 、 多 醣 、 病 原 體 等 都 可 偵 測 。 免 疫 組 織 化 學 的 優 勢 在 於 專 一 性 、 靈 敏 度 、 簡 便 快 速 以 及 成 本 低 廉 ， 所 以 此 法 對 基 礎 研 究 及 診 療 上 都 是 相 當 重 要 的 一 個 方 法 。 本 實 驗 利 用 此 方 法 來 驗 證 ， 人 類 肺 腺 癌 細 胞(A549)具 有 生 長 激 素 的 受 體 ， 可 與 先 前 實 驗 室 利 用 西 方 轉 漬 法 所 得 出 來 的 結 果 互 相 呼 應 。 4-8-4 雷 射 共 軛 焦 螢 光 顯 微 鏡 (Confocal Microscope) 由 於 傳 統 的 光 學 顯 微 鏡 受 到 光 波 繞 射 的 限 制，以 至 於 無 法 提 供 無 限 放 大 的 可 能 性 且 其 成 像 方 式 依 舊 是 停 留 在 平 面 成 像。並 且 由 於 景 深 的 關 係 使 得 螢 光 顯 微 鏡 無 法 僅 觀 測 某 ㄧ 斷 層，以 至 所 拍 出 的 螢 光 影 像 常 是 一 團 模 糊，無 法 分 辨 染 色 的 部 位 是 位 於 何 處，如 細 胞 膜 上 或 是 內 部；如 此
利 用 冷 凍 切 片 製 作 技 術 來 解 決 這 問 題，但 缺 點 是 切 片 完 後 無 法 觀 測 活 體 樣 品 並 難 將 樣 品 恢 復 成 原 狀。此 時 發 明 了 共 軛 焦 顯 微 鏡 以 解 決 上 述 的 難 題 。 而 雷 射 共 軛 焦 顯 微 鏡 是 利 用 針 孔 遮 罩(pinhole aperture)排 除 離 焦 面 所 產 生 的 雜 訊。掃 描 取 像 結 構 是 利 用 雷 射 光 源 及 掃 瞄 器 內 掃 瞄 鏡 控 制 機 構 及 光 電 倍 增 管 取 得 單 點 螢 光 強 度 訊 號，以 構 成 XY 平 面 共 軛 焦 影 像 ， 並 利 用 顯 微 鏡 中 的 XYZ 軸 控 制 ， 即 可 取 得 ㄧ 組 高 解 析 度 的 標 本 光 學 切 片，可 提 供 三 維 空 間 重 組 之 用。它 的 優 點 是 可 使 影 像 品 質 提 高、高 對 比、 高 解 析 度、厚 標 本 沒 有 離 焦 的 影 像 問 題、好 的 螢 光 亮 度 平 衡 以 及 較 少 的 cross talk 現 象 產 生 。 本 實 驗 利 用 具 有 上 述 優 點 的 雷 射 共 軛 焦 顯 微 鏡 來 觀 察 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 石 重 組 生 長 激 素 複 合 體 (cND-rEaGH)在 人 類 肺 腺 癌 細 胞 (A549)的 位 置 。
4-8-5 細 胞 存 活 率 分 析 (statistics of cell viability)
本 實 驗 室 利 用 此 技 術 去 算 分 別 加 入 青 石 斑 石 重 組 生 長 激 素 (rEaGH)、 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 (cND)、 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 石 重 組 生 長 激 素 複 合 體 (cND-rEaGH)以 及 對 照 組 (control)，且 分 別 有 奈 米 雷 射 激 光 與 無 奈 秒 雷 射 照 射 處 理，共 8 組，再 培 養 20 小 時 後，之 後 細 胞 的 存 活 率 (MTT 技 術 )及 個 數 (數 細 胞 技 術 )。 4-8-6 發 炎 反 應 蛋 白 (I n ter- C el l u l a r A d h e si o n M ol ec u l e , I C A M) 分 析 細 胞 死 亡 主 要 可 分 為 兩 路 徑 ， 自 然 凋 亡(apoptosis)與 細 胞 壞 死 (necrosis)而 在 這 兩 條 死 亡 路 徑 在 細 胞 型 態 學 、 生 物 化 學 、 生 理 學 中 所 表 現 是 有 差 異 的 ， 在 表 1 中 有 加 以 詳 細 說 明 ； 其 中 在 生 理 學 特 徵 中 若 是 細 胞 走 自 然 凋 亡 路 徑 死 亡 是 無 發 炎 現 象 產 生 ， 反 之 ， 走 細 胞 壞 死 途 徑 死 亡 則 因 為 細 胞 間 質 流 出 是 有 發 炎 現 象 產 生 的 。 而 發 炎 反 應 發 生 時 則 會 有 Inter-Cellular Adhesion Molecule, ICAM 3 1蛋 白 質 產 生 ， 因 此 可 以 藉 由 偵 測 此 蛋 白 以 檢 測 細 胞 的 死 亡 途 徑 。
本 實 驗 因 肺 腺 癌 細 胞 加 入 羧 酸 化 奈 米 鑽 石-青 石 斑 石 重 組 生 長 激 素 複 合 體(cND-rEaGH)且 經 由 奈 米 雷 射 照 射 處 理 後，觀 察 到 存 活 細 胞 數 目
減 少 ， 故 用 此 ICAM 蛋 白 質 來 檢 測 細 胞 死 亡 是 經 由 自 然 凋 亡 或 細 胞 壞 死 路 徑 而 死 亡 的 。 4-9 cND-rEaGH 在 癌 症 治 療 上 的 應 用 本 實 驗 利 用 青 石 斑 魚 的 重 組 生 長 激 素 使 奈 米 鑽 石 成 為 具 有 標 靶 性 的 cND-rEaGH 複 合 體 後，且 證 實 了 奈 米 鑽 石 可 藉 由 熱 聲 子 效 應 產 生 型 態 上 的 劇 烈 爆 炸 ， 但 奈 米 鑽 石 的 爆 炸 是 否 可 用 於 治 療 癌 症 卻 是 尚 未 探 索 的 領 域 ， 於 是 選 用 具 有 生 長 激 素 受 體 的 肺 腺 癌 細 胞 A549 作 為 cND-rEaGH 標 靶 的 細 胞 ， 配 合 奈 秒 雷 射 照 射 對 奈 米 鑽 石 的 激 發 ， 探 討 並 期 望 cND-rEaGH 能 藉 由 奈 米 鑽 石 的 爆 炸 效 應 對 A549 細 胞 造 成 傷 害 ， 因 此 在 細 胞 的 巨 觀 跟 微 觀 層 次 上 分 別 來 評 估 cND-rEaGH 在 奈 秒 雷 射 激 發 系 統 的 配 合 下 是 否 具 有 達 到 殺 死 癌 細 胞 的 能 力 。 推 測 cND-rEaGH 經 由 奈 秒 雷 射 照 射 後，因 奈 米 鑽 石 的 體 積 膨 漲 效 應 使 奈 米 鑽 石 爆 炸 而 可 以 傷 害 癌 細 胞，如 離 子 通 道(ion channel)的 破 壞 等 等，使 得 癌 細 胞 走 向 死 亡 的 路 徑 ， 以 建 立 一 個 可 以 不 需 要 侵 入 活 體 就 可 以 殺 死 腫 瘤 細 胞 的 治 療 平 台 。
第 五 章 結 果
5- 1 生 長 激 素 與 生 長 激 素 受 體 的 偵 測 5-1-1 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 的 取 得 與 表 現 當 大 腸 桿 菌 開 始 成 長 時 ， 加 入 IPTG 誘 導 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素(rEaGH) 蛋 白 質 表 現 ， 並 培 養 16 小 時 菌 液 後 ， 收 集 大 腸 桿 菌 並 使 用 細 胞 破 碎 機 ， 將 所 有 的 蛋 白 質 可 藉 由 離 心 分 離 法 分 為 可 溶 性 (上 清 液 )及 不 可 溶 (沉 澱 物 )的 兩 大 類 蛋 白 質 ； 如 圖 5-1-1 所 示 ， 可 發 現 不 可 溶 的 蛋 白 質 多 是 由 分 子 量 為 22.3 kD 的 rEaGH 所 組 成 ， 因 rEaGH 在 大 腸 桿 菌 中 被 視 為 不 具 價 值 的 物 質 ， 經 由 IPTG 的 誘 導 及 長 時 間 的 培 養 ， 大 量 的 rEaGH 以 錯 誤 的 摺 疊 形 式 囤 積 在 內 含 體(incusion body )中 ， 因 此 利 用 實 驗 室 所 建 立 的 蛋 白 質 摺 疊 技 術 將 rEaGH 摺 回 到 正 確 的 型 態 [91]，而 從 內 含 體 中 所 取 出 的 rEaGH 量 比 上 清 液 多 ， 產 量 高 1L 菌 液 可 獲 得 約 470 mg 的 蛋 白 質 且 純 度 也 高 達 95%。 圖 5-1-1 青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 (rEaGH)的 表 現 電 泳 分 析 圖 。 圖 中 M:標 準 分 子 量 的 蛋 白 質 標 記(marker)； 1 :空 載 體 (PET 30 a) ； 2 :培 養 16 小 時 的 大 腸 桿 菌 細 胞 全 懸 浮 液 (total cell lysate)； 3 :破 菌 後 離 心 上 清 液 ； 4 :破 菌 後 離 心 沉 澱 物 ； 5 : 空 載 體 (PET 30a)； 6 : 培 養 16 小 時 的 大 腸 桿 菌 細 胞 全 懸 浮 液；7 : 破 菌 後 離 心 上 清 液；8 :破 菌 後 離 心 沉 澱 物 腸 桿 菌 全 懸 浮 液 經 離 心 後 所 得 的 沉 澱 部 分 。1 、 2、 3、 4 無 加 入 IPTG 誘 導 ， 5 、 6、 7、 8 有 加 入 IPTG 誘 導 。 箭 頭 標 示 為 2 2.3 kD 的 rEaGH。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 6 6 . 2 k D 4 5 k D 3 5 k D 2 5 k D 1 8 . 4 k D 1 4 . 4 k D5-1-2 確 認 肺 腺 癌 細 胞 具 有 生 長 激 素 的 受 體
在 實 驗 室 先 前 實 驗 中 ， 將 細 胞 全 部 打 碎 後 ， 以 西 方 點 墨 法 分 析 ， 並 以 生 長 激 素 受 體(growth hormone receptor, GHR)的 抗 體 去 辨 識 GHR 蛋 白 質 ， 證 明 A549 細 胞 較 其 他 兩 者 細 胞 (CHO-K1、 Hep-G2)具 有 較 多 生 長 激 素 受 體 的 表 現 (圖 3-7-1 )， 本 實 驗 則 以 免 疫 細 胞 化 學 染 色 法(Immunocytochemistry, ICC)， 再 次 證 明 ， A549 此 細 胞 株 是 具 有 生 長 激 素 受 體 的 表 現。將 培 養 24 小 時 的 肺 腺 癌 細 胞 A549， 利 用 4% 三 聚 甲 醛 (paraformaldehyde) 將 細 胞 固 定 並 隨 後 使 用 不 同 染 劑 標 定 細 胞 內 部 的 不 同 部 分 或 蛋 白 質 圖 5-1-2 A 為 利 用 Phase contrast 在 目 鏡 放 大 10 倍，物 鏡 放 大 60 倍，觀 察 細 胞 型 態 ； 在 圖 B 中 可 發 現 肺 腺 癌 細 胞 A549 是 有 生 長 激 素 受 體 的 表 現 。 由 於 此 圖 是 在 穿 透 式 顯 微 鏡 下 所 觀 察 到 的 ， 所 以 染 生 長 激 素 受 體(紅 色 )會 將 所 有 Z 軸 所 收 到 的 光 累 積 起 來 ， 而 不 會 有 像 在 共 軛 焦 顯 微 鏡 下 觀 察 ， 生 長 激 素 受 體 只 有 在 細 胞 的 周 圍 的 影 像 。 圖 5-1-3 為 將 染 生 長 激 素 受 體 (紅 色 )、 染 細 胞 核 (藍 色 )、 染 細 胞 骨 架 (綠 色 )此 三 張 圖 疊 在 一 起 的 影 像 。
圖 5-1-2 利 用 免 疫 螢 光 染 色 法 ， 確 認 肺 腺 癌 細 胞 (A549)具 有 生 長 激 素 受 體 。 圖 A 為 利 用 phase contrast 明 視 野 下 所 觀 察 的 細 胞 型 態、圖 B 為 標 定 染 生 長 激 素 受 體 (紅 色 )、 20 μm
A.
B.
C.
D.
E.
圖 C 染 細 胞 核 (藍 色 )、圖 D 染 細 胞 骨 架 (綠 色 )、圖 E 為 生 長 激 素 受 體 (紅 色 )、細 胞 核 (藍 色 ) 、 細 胞 骨 架 ( 綠 色 ) 疊 圖 結 果 ， 圖 A、 B、 C、 D、 E 皆 為 放 大 倍 率 為 六 百 倍 。 5- 2 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 理 化 特 性 分 析 5-2-1 確 認 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 粒 徑 大 小 利 用 動 態 光 散 射 儀(DLS)測 量 羧 酸 化 後 的 奈 米 鑽 石 實 際 粒 徑 大 小 。 圖 5-2-1 為 5 nm 羧 酸 化 後 奈 米 鑽 石 (cND)的 粒 徑 大 小 。 實 際 測 量 粒 徑 大 小 為 5.41 ± 0.21 nm，其 中 黑 線 代 表 累 加 百 分 比 的 數 值 ， 因 此 可 以 確 定 所 獲 得 的 奈 米 鑽 石 經 過 羧 酸 化 後 的 粒 徑 大 小 與 預 期 的 5 nm 是 相 近 的 。 圖 5-2-1 利 用 動 態 光 散 射 儀 所 測 量 5 n m 奈 米 鑽 石 的 實 際 粒 徑 大 小 ， 測 量 粒 徑 大 小 為 5 .41 ± 0.21 n m， 其 中 黑 線 代 表 累 加 百 分 比 的 數 值
4
6
8
10
0
20
40
60
80
100
5 nm cND
5.41 +/- 0.21 nm
Relativ
e Number
Diameter (nm)
5-2-2 檢 測 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 螢 光 光 譜
奈 米 鑽 石 具 有 特 殊 螢 光 特 性 ， 而 本 實 驗 利 用 三 維(3D)全 波 段 螢 光 光 譜 儀 檢 視 ， 經 過 羧 酸 化 後 的 5 nm 奈 米 鑽 石 是 否 依 然 具 有 螢 光 的 特 性 。 實 驗 結 果 如 圖 5-2-2 顯 示 ， 縱 軸 為 激 發 光 波 長 (excitation wavelength )， 橫 軸 為 放 射 波 長 (emission
wavelength)； 紅 色 虛 線 所 框 起 來 的 部 分 為 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 三 維 螢 光 圖 譜 ， 圖 譜 顯 示 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 具 有 連 續 性 的 光 譜 特 徵 ， 並 且 放 射 波 長 是 激 發 波 長 加 上 110 nm， 也 就 是 說 如 果 用 543 nm 的 波 長 激 發 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 ， 其 會 放 出 約 653 nm 的 放 射 光 ， 因 此 可 利 用 此 連 續 螢 光 光 譜 特 性 來 監 測 奈 米 鑽 石 的 位 置 ， 可 作 為 生 物 分 子 的 bio-tracer。 圖 5-2-2 5 nm 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 的 三 維 螢 光 光 譜 。 全 波 段 螢 光 掃 描 激 發 光 波 長 2 00 ~800 n m， 收 放 射 光 波 長 220 ~9 00 n m； 此 5 n m 羧 酸 化 奈 米 鑽 石 具 有 連 續 光 譜 的 特 性 。
5- 3 奈 秒 雷 射 能 量 測 定 與 選 定 選 用 一 雷 射 能 量 讓 奈 米 鑽 石 能 產 生 結 構 上 的 劇 烈 改 變 ， 但 對 細 胞 本 身 不 會 造 成 傷 害 ， 如 此 一 來 才 能 有 選 擇 性 的 殺 死 癌 細 胞 。 圖 5-3-1 顯 示 ， 在 使 用 奈 秒 雷 射 能 量 到 達 300 mJ 照 射 時，不 管 是 對 照 組 抑 或 是 只 加 入 奈 米 鑽 石 與 奈 米 鑽 石-青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 複 合 體，細 胞 存 活 率 都 大 量 下 降，使 得 此 三 組 無 區 別 性；而 在 使 用 奈 秒 雷 射 能 量 達 100 mJ 照 射 時，在 對 照 組 與 單 加 入 奈 米 鑽 石 組 裡 ， 發 現 細 胞 反 而 有 增 長 的 現 象 ， 此 現 象 會 在 第 六 章 裡 討 論 ； 加 入 奈 米 鑽 石-青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 複 合 體 組 ， 在 使 用 200 mJ 的 奈 秒 雷 射 此 條 件 下 ， 相 較 其 他 組 別 ， 細 胞 存 活 率 有 下 降 趨 勢 ， 因 此 本 實 驗 選 用 200 mJ 的 雷 射 能 量 做 為 奈 米 鑽 石 爆 炸 的 能 量 條 件 。 圖 5-3-1 奈 秒 雷 射 能 量 對 奈 米 鑽 石 -青 石 斑 魚 重 組 生 長 激 素 複 合 體 在 癌 細 胞 上 標 靶 治 療 的 測 定 與 選 定 。 其 中 選 用 200 mJ 的 雷 射 能 量 條 件 做 為 本 實 驗 使 奈 米 鑽 石 爆 炸 的 能 量 條 件 。 n 值 =3， *p < 0.05 。
