鬼臼毒素衍生物對於肺癌細胞生長、轉移抑制能力及其作用機制之探討

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 鬼臼毒素衍生物對於肺癌細胞生長、轉移抑制能力及其作用機制之探討 Inhibition of cancer cell growth and migration of podophyllotoxin derivative in lung cancer cells and its mechanistic study. 研究生：陳家揚 Jia-Yang Chen. 指導教授：王憶卿博士 Yi-Ching Wang. 中華民國九十六年七月.

(2) 謝. 誌. 二年的碩士班生活，所有的成果，所有的努力，全都濃縮在這本論文中，在本論文將近完工的同時，也代表了我的碩士生涯告一段落。兩年的生活有苦有樂，也要感謝很多幫助我的人們，其中最感謝的，莫過於我的指導教授王憶卿老師，兩年來給我的諄諄教誨，從第一次跟老師的面談，老師對研究的熱忱，便深深烙印在我腦中，二年來老師對我耐心的教導、在邏輯上的思考、表達能力的訓練，從一個懵懵懂懂的大學生，成長到今日可以完成論文的研究生，老師給我的許多支持、鼓勵與指教，都讓我銘感在心。也非常感謝中研院的李文山老師，除了大方提供非常多很棒的新穎藥物供我實驗之外，也常常給我很多批評、建議、以及指教，謝謝老師總是微笑的臉與溫暖的鼓勵。也感謝我的口試委員郭明良老師，在動物實驗以及癌症轉移方面多次給我的指教。另外也感謝孫英傑老師的參予，並於分子模擬方面給我許多的幫助，讓我的論文能更趨完整。也要感謝台北榮總許翰水醫師在動物實驗給我的大力幫忙。進入這個實驗室大家庭後，實驗室融洽的氣氛，學長姐們對後進學弟妹無論是實驗上以及生活上的照顧與幫助，真的很讓人感動和窩心，非常感謝若嘉學姊、秋逸學姊、若凱學姐、哲維學長、一泓學姊、芳宜學姐、千惠學姊、世華學長在我碩士班生活中給我的很多不同幫助，並.

(3) 給我許多生活上的意見與鼓勵，也特別感謝慶孝學長以及信銘學長在動物實驗中给我的許多意見與幫助，在拔山涉水前往榮總的路途上有你們真好，還要謝謝昆學學長在做蛋白質體實驗時每天陪我熬夜到凌晨五點，帶我入門還犧牲自己的時間給我幫助。謝謝我的好同學偉伶、素芬、一麟，在有你們的日子能互相幫助、成長、學習、吐槽，也謝謝我們研究室的助理們本翰、婷芸、喬凱、以及學弟妹們翊萱、孝文、淨婷、衍儒、怡珊、珈鑫，我會永遠記得我這兩年在實驗室生活的日子。希望往後的日子還能繼續保持聯絡，在實驗室的各位以後也請多多指教! 除此之外要感謝隔壁實驗室的好朋友馨慧，夜半時分是妳給我鼓勵，讓我能夠繼續在這條路走下去；謝謝提供我藥物的凱宣學長與玉菁，讓我毫無顧慮的能繼續實驗；最後感謝我的好朋友、我的家人以及怡潔，沒有你們的陪伴與關懷，不會有今天的我。. 僅以本論文，獻給所有我生活中最重要的朋友以及家人們. 家揚國立台灣師範大學. 謹誌於. 生命科學研究所. 中華民國 96 年 7 月.

(4) 目錄壹、中文摘要………………………………………………. 1 貳、英文摘要………………………………………………. 3 叁、緒論一、研究背景與文獻論述………………………………………... 5 (一)、鬼臼毒素及其衍生物的發展………………………………. 5 1.天然植物萃取物於臨床抗癌用藥的發展…………................. 5 2.鬼臼毒素(podophyllotoxin)之發現………………………….... 6 3.鬼臼毒素之應用……………………………………................. 6 4.鬼臼毒素之結構……………………………………................. 7 5.鬼臼毒素之抗癌作用機制……………………………………. 7 6.鬼臼毒素於臨床應用之缺點………………………................. 8 7.鬼臼毒素衍生物之發展……………………………................. 9 8.各種不同鬼臼毒素衍生物之作用機轉……………................. 10 9.鬼臼毒素衍生物於癌症治療之臨床應用…………................. 11 10.新穎鬼臼毒素衍生物 ─ Ching001………………................. 12 (二)、癌症轉移抑制劑的發展……………………………………. 13 1.癌症的轉移……………………………………………………. 13 I.

(5) 2.細胞骨架 actin filament 與癌細胞轉移………………………. 13 3.癌細胞轉移抑制劑……………………………………………. 14 二、研究目標……………………………………………............... 16. 肆、研究材料與研究方法一、研究材料……………………………………………………... 17 二、研究方法……………………………………………………... 18 1. 細胞培養 (Cell Culture)…………………………………...… 18 2. 藥物之細胞毒性分析 (Compound Cytotoxicity Assay)…… 18 3. 細胞週期分析 (FLOW Cytometry)…………………………. 18 4. DNA Ladder Assay……………………………………….....… 19 5. 西方墨點法 (Western Blot)……………………………….… 20 6. 免疫細胞染色法 (Immunocytochemistry)………………….. 20 7. 分子模擬對接 (Molecular Docking)....................................... 21 8. 細胞轉移能力分析 (Trans-well Migration Assay)………….. 22 9. 動物實驗 (Animal Model Test)…………………………....... 22 10. HE-staining (Haematoxylin-Eosin staining)……………….... 23. 伍、實驗結果一、藥物 Ching001 對於肺癌細胞之細胞毒性…………………. 25. II.

(6) 二、藥物 Ching001 對於細胞週期的影響………………………. 25 三、藥物 Ching001 對於肺癌細胞凋亡的檢驗………………..... 26 四、藥物 Ching001 對於細胞骨架 microtubule 的影響…...……. 27 五、藥物 Ching001 對於肺癌細胞 actin 骨架調控蛋白的影響… 28 六、藥物 Ching001 對於肺癌細胞的轉移能力測試…………….. 28 七、藥物 Ching001 於動物模式中的效力………………………. 29. 陸、討論……………………………………………………. 31 柒、未來工作………………………………………………. 38 捌、附圖……………………………………………………. 40 玖、附表……………………………………………………. 61 拾、文獻總整………………………………………………. 62. III.

(7) FIGURE CONTENT Figure 1 The microtubulin polymerizatioin/depolymerization inhibitors as mitotic agents……………………………………………..…... 39 Figure 2 The structures of the colchicine, podophyllotoxin and it’s derivatives.………………………………………….……….......... 40 Figure 3 The structure of microtubule.…………………………………….. 41 Figure 4 Dynamic instability of microtubules.……………………………... 42 Figure 5 The microtubule polymerization inhibitors and de-polymerization inhibitors………………………………………………………….. 43 Figure 6 The cell cycle and mitosis.………………………………………... 44 Figure 7 The apoptosis signaling pathway in the cell.……………………... 45 Figure 8 The structure of other DNA topoisomerase inhibitors.…………… 46 Figure 9 The mechanism of topoisomerase II and etoposide.............................47 Figure 10 The role of Rac, Rho, and CDC42 in regulation of actin construction and cell migration........................................................ 48 Figure 11 The direction of lamellipodium construction will lead the way to the cell migration………………………………………………. 49 Figure 12 The IC50 cytotoxicity test of normal lung MRC5 and lung cancer cells including CL1-0, CL1-5, A549 and H1299…………. 50. IV.

(8) Figure 13 FLOW cytometry analysis of lung cancer cell lines A549, CL1-0, CL1-5, H1299 treated with different concentration (0.5 μΜ and 1 μM) of Ching001 for 24hr and 48hr by PI staining……….…. 51 Figure 14 The DNA ladder assay and Western blot after Ching001 treatment for 48hr of CL1-0, CL1-5, A549, and H1299 lung cancer cell lines....................................................................... 52 Figure 15 The α–tubulin staining of CL1-5 and A549 lung cancer cell lines………………………..…………….…………………...… 53 Figure 16 The F-actin staining of CL1-5 and Western blot of actin regulation factor Rac and Rho………………………….………... 54 Figure 17 The trans-well migration assay of CL1-5………………………. 55 Figure 18 The animal model experiment using ICR-nude mice for tumor growth inhibition test and body weight alteration……..... 56 Figure 19 The biochemistry test result of tested animal blood sample……... 57 Figure 20 The tissue slide HE-staining of the ICR-nude mice in animal model tested………………………………………….…58. V.

(9) TABLE CONTENT. Table 1. The hematology and biochemistry test of the nude mice blood sample after the drugs treatment..............................................59. VI.

(10) ABBREVIATIONS. ARP2/3. Actin Related Protein 2/3. CDC42. Cell Division Cycle 42. DAPI. 4'-6'-Diamidino-2-phenylindole. DMEM. Dulbecco's Modified Eagle Medium. DMSO. Dimethyl Sulfoxide. DTT. Dithiothreitol. EDTA. Ethylene-diamine-tetra-acetates. EGFR. Epidermal Growth Factor Receptor. FBS. Fetal Bovine Serum. FITC. Fluorescine Isothiocyanate. G2/M arrest. Gap-2/Mitosis phase arrest. HBSS. Hank's Balanced Salt Solution. HE-staining. Haematotoxylin-Eosin staining. HPV. Human Papilloma Virus. M-phase. Mitosis-phase. PBS. Phosphate Buffer Saline. PBST. Phosphate Buffer Saline with Twee-20. PEG. Polyethylene Glycol. VII.

(11) PI. Propidium Iodide. P/S. Penicillin/Streptomycin. S-phase. Synthesis-phase. RTK. Receptor Tyrosine Kinase. VEGF-R. Vascular Endothelial Growth Factor Receptor. VIII.

(12) 壹、中文摘要自 1982 年起，癌症即為台灣地區十大死因之首，現已成為疾病死亡之主要原因之一，其中肺癌的死亡率近年來無論於男性或女性皆高居癌症死亡原因前二位，且台灣地區肺癌死亡率的增加速度亦有逐年上升之趨勢；雖然現有之外科手術、放射線治療等方式不斷進步，以及不斷的有新穎的化學治療藥物被發展出來，包括許多天然植物的萃取物如紫杉醇、常春花鹼類藥物、以及喜樹鹼類藥物，但化療藥物對於病人所產生的副作用以及藥物所具有的潛在抗藥性，仍為抗癌藥物發展受阻的重要原因。鬼臼毒素 (podophyllotoxin) 原為自天然植物所萃取之天然藥物，對於細胞骨架 microtubule 具有很高的去穩定化作用，造成細胞無法正常分裂並使細胞週期停止於細胞分裂期，最後造成細胞凋亡 (apoptosis)。鬼臼毒素在早期便已被作為藥物使用，但因其對於正常細胞以及癌細胞的毒殺選擇性較不佳，又因其使用後所造成的強烈副作用，導致鬼臼毒素無法被使用在臨床癌症的治療上。 Ching001 為中研院化學所李文山博士所發展，針對鬼臼毒素的結構進行修飾後所產生的鬼臼毒素衍生物，在本篇實驗中發現，新穎的鬼臼毒素衍生物 Ching001 對於不同肺癌細胞株皆有相當高的毒殺作用，在低濃度處理時，對於正常肺細胞則無明顯之細胞毒性。而 Ching001 的. 1.

(13) 作用機轉，主要也是作用於細胞骨架 microtubule 上，造成 microtubule 的聚合受到抑制並進一步增加不穩定性，使肺癌細胞無法順利進行細胞分裂，並使細胞週期停止於 G2/M 期，如再持續以 Ching001 處理肺癌細胞，則會進一步影響細胞內之訊息傳遞，降低細胞凋亡抑制蛋白 Bcl-2 之表現量，並活化細胞凋亡所需之蛋白酶 caspase-9，造成細胞走向細胞凋亡，而達到其抑制肺癌細胞生長增殖並造成細胞毒殺作用之能力。再者我們亦發現 Ching001 會藉由減少 Rac、Rho 等訊息傳遞之表現量而使細胞骨架 actin filament 的結構發生改變，失去 filopodium 或 lamellipodium 等促進細胞移動能力之外表型態，並於 in vitro 實驗中發現可以有效的抑制具有高度轉移潛力的肺癌細胞株 CL1-5 之轉移能力。在動物實驗中，給予 2 mg/kg Ching001 治療的裸小鼠其腫瘤之生長也明顯受到抑制達 15 天之久，並於裸小鼠之血液、生化檢查以及組織切片染色中亦發現，Ching001 對於裸小鼠之正常生理功能並不具有明顯的傷害或引發免疫反應，並於腫瘤切片中可觀察到細胞凋亡發生，且實驗期間裸小鼠之體重亦維持於正常範圍內。根據以上實驗結果，我們認為此一新穎的鬼臼毒素衍生物 Ching001 對於正常肺細胞與肺癌細胞具有專一性之毒殺作用，並且對於裸小鼠中能有效抑制腫瘤生長，並無產生嚴重生理損害以及造成嚴重副作用，相當具有潛力可以發展成為新穎的癌症用藥。且其對於肺癌細胞的轉移抑制能力，亦具有潛力發展成為抑制肺癌細胞轉移的新穎藥物。 2.

(14) 貳、英文摘要. Since 1982, cancer had been the leading cause disease of death in Taiwan, and the mortality of lung cancer has risen most dramatically in both men and women. Recently, the improvement in surgical and radiotherapeutic remedy, and more and more chemotherapy drugs including many potential anti-cancer drugs investigated from nature plant such as Taxol, Vinorelbin, and Camptothecin had been developed. However, the serious side effects and the potent in drug resistance of these drugs, still remain difficult for their development as anti-cancer drugs. Podophyllotoxin is a nature compound purified from Podophyllum peltatum. It has strong polymerization inhibition ability toward the cell skeleton microtubule. It prevents the cell from normal mitosis and causes G2/M arrest of the cell, finally results in cell apoptosis. Podophyllotoxin had been used as medicine in different countries for thousand of years. However, its poor selectivity to normal/tumor cells and serious side effects after drug treatment prevent it from the usage as anti-cancer drugs. Ching001, a podophyllotoxin derivatives developed from Dr. Wen-Shan Li at Institute of Chemistry of Academia Sinica in Taiwan. Ching001 was modified for the purpose to be a potential anti-cancer drug. In the present study, we found that novel podophyllotoxin derivative Ching001 had highly cytotoxicity toward different lung cancer cell lines, whereas Ching001 3.

(15) showed low cytotoxicity to the normal lung cell line. In addition, it prevented lung cancer cell from mitosis by inhibiting the polymerization of microtubule and causing cell cycle arrest at G2/M phase. These events eventually led to apoptosis through inhibition of the expression of anti-apoptosis factor Bcl-2 and activation of the expression of apoptosis protease caspase-9. Importantly, Ching001 could effectively inhibit the highly metastasis potential lung cancer cell line CL1-5 through inhibit actin filament construction signaling factors Rac and Rho to inhibit the filopodia or lamellipodia construction. In migration assay experiment, we proved that Ching001 treatment could inhibit the cell from migration in vitro. In the animal model test, 2 mg/kg Ching001 treatment could apparently inhibit the tumor growth for 15days and the effect was stronger than Taxol treatment at same dosage. The hematology and biochemistry tests of nude mice blood samples as well as tissue staining indicated that Ching001 treatment did not distinctively influence the normal function of vitality in animal model. In addition, tumor tissue staining showed that after Ching001 treatment, it induced apoptosis of tumor cells and led to tumor nodule shrinkage. According to the experiments described above, we believed that novel podophyllotoxin derivative Ching001 will be a potential anti-cancer drug. It may be a good anti-metastasis agent as well.. 4.

(16) 参、緒論一、研究背景與文獻論述 (一)、鬼臼毒素及其衍生物之發展. 1. 天然植物萃取物於臨床抗癌用藥的發展許多天然植物於不同地區、不同文化中，皆被用以作為藥物使用，其中亦不乏有被認為具有抗癌效果之天然植物，例如南洋紫杉 (Taxus brevifolia) 、長春花類植物. (Madagascar periwinkle 、. Catharanthus roseus)。而自這些植物提煉出來的 Taxol 紫杉醇 (或其有效成分 paclitaxel) (Spencer and Faulds, 1994; Wall, 1998) 、 Vincristine、Vinblastine、Vinorelbine、Vintripol、Vinxaltine 等長春花鹼類藥物 (Budman, 1992, 1997) ，於研究中發現對於細胞骨架 microtubule 具有抑制其分解或抑制其聚合之能力 (Fig. 1)，其他如自喜樹 (Camptotheca acuminate) 萃取之 Camptothecin 喜樹鹼 (Wall, 1998) 亦被認為對於細胞中之第一型 DNA 拓樸異構酶 (DNA topoisomerase I) 具有抑制作用，而這些天然植物萃取物以及其所發展出來之新穎抗癌藥物，皆可達成抑制細胞分裂或生長之功能，而這些藥物在癌症臨床應用上，亦被證實具有相當之療效。. 5.

(17) 2. 鬼臼毒素(podophyllotoxin)之發現八角蓮 (Podophyllum peltatum，俗稱 Mayapple 或 Mandrake)為鬼臼屬的天然植物，廣泛分布於美洲、亞洲等地，被作為天然解毒劑、瀉藥、催吐劑、驅蟲劑、或毒藥等藥物使用 (Hande, 1998; Kelly and Hartwell, 1954)，而後亦被發展作為殺蟲劑、驅蟲劑、植物生長抑制劑等等許多不同用途 (Garcia et al., 2000; Imbert, 1998; Miyazawa et al., 1999)。於 1880 年代，Podwyssotzki 等人於 Podophyllum peltatum 之粗萃取物 podophyllin 中分離了其活性物質鬼臼毒素 podophyllotoxin (Podwyssotzki, 1880, 1881, 1882)，而鬼臼毒素為鬼臼屬植物之木聚醣 (lignan)中最主要的活性成分 (Imbert, 1998)，進而開始了人們對於鬼臼毒素的廣泛研究。 3. 鬼臼毒素之應用於 1820 年代，鬼臼屬植物的樹脂常應用於治療外生殖器疣 (venereal warts) (Kalpan, 1942)，而在 1980 年代，於研究中發現鬼臼毒素可藉由抑制病毒早期複製或減少宿主細胞的病毒釋放，達到對於病毒生長的抑制效果 (Bedows and Hatfield, 1982)，而相較於其他治療外生殖器疣的藥物，鬼臼毒素可以更快速更完全的達成治療目的，故繼而用以治療各種由病毒所引起之外生殖器疣 (Lassus, 1987)，並用於治療因人類乳突狀病毒 HPV (human papilloma virus) 所造成的其他 6.

(18) 疾病。其他亦應用在治療卡波西氏肉瘤 (Schwartsmann et al., 1996)、結核病 (scrofula)、梅毒 (syphilis)、淋病 (gonorrhea)、咳嗽 (coughing) 等等 (Kelly and Hartwell, 1954) 亦由病毒感染所引起之疾病、症狀，在 90 年代末期鬼臼毒素亦用以作為癌症治療藥物（請見以下論述）。 4. 鬼臼毒素之結構鬼臼毒素的結構 (Fig. 2A) 於 1930 年代由 Späth 所解出 (Borsche and Nieman, 1932; Späth et al., 1932a; Späth et al., 1932b)，其結構主要由四個環(A~D 環)所構成，而在 C 環的 C1 位置上具有一個額外的苯環構造(E 環)，其中 A 環以及 E 環是鬼臼毒素分子其活性所必須存在之結構，而 D 環酮環 (lactone ring) 結構之存在可提高鬼臼毒素作用之活性，另外在鬼臼毒素結構中 C 環的 C4 位置可接受大分子基團的修飾，進而產生不同的鬼臼毒素衍生物 (Gordaliza et al., 2004; Srivastava et al., 2005; You, 2005)，所以其他許多種類利用半合成方式產生的鬼臼毒素衍生物，多在 C 環之 C4 位置進行分子修飾而改變分子活性，甚至改變鬼臼毒素分子的作用機制。. 5. 鬼臼毒素之抗癌作用機制鬼臼毒素主要之抗癌作用機制，在於影響細胞分裂時所必須的細胞骨架 microtubule (Figs. 3 and 4)，鬼臼毒素作用機制類似於秋水仙素. 7.

(19) (colchicine, Fig. 2C)，所以可競爭於秋水仙素結合在 tubulin 上之相同位置 (Desbene and Giorgi-Renault, 2002; Sackett, 1993; Schonbrunn et al., 1999) ，使得 microtubule 之結構去穩定化，造成細胞骨架 microtubule 之聚合作用受到抑制 (tubulin polymerizatioin inhibition, Fig. 5)，無法順利聚合 microtubule 以進行細胞分裂 (Fig. 6)，造成細胞生長受到抑制，並使細胞週期停止於細胞分裂期 (Mitosis, M)，造成 M-phase arrest ，最後甚至導致細胞凋亡 (apoptosis, Fig. 7) (Gordaliza et al., 2000; King and Sullivan, 1946; Sullivan and Wechsler, 1947; Tseng et al., 2002)。 6. 鬼臼毒素於臨床應用之缺點由於鬼臼毒素對於細胞具有生長抑制之能力，故亦被用以測試對於癌細胞之抗癌效果，結果發現鬼臼毒素對於癌細胞具有高度毒殺作用 (Belkin, 1948; Hartwell and Shear, 1947)，但其對於癌細胞的毒殺作用亦同時對於正常組織細胞有著相同的影響，並且施用鬼臼毒素的病人會伴隨強烈的腸胃道副作用，例如嘔吐、暈眩、白血球下降 (neutropenia)、骨髓造血功能受到抑制 (myelosupression)等等 (Hande, 1998; Kelly and Hartwell, 1954; Sinkule, 1984; Vogelzang et al., 1982)。故雖然鬼臼毒素對於癌細胞為一具有潛力之抗癌藥物，卻因其副作用強烈，於臨床之應用性倍受限制，但也由於鬼臼毒素所具有之高度毒殺能力，引發了許多科學家以鬼臼毒素之結構為基礎， 8.

(20) 嘗試對其結構進行修飾以改變其生物活性，而產生許多新穎並具有潛力的鬼臼毒素衍生物類抗癌藥物，現在已有數種不同結構以及不同生物活性之鬼臼毒素衍生物用於癌症臨床化療用藥，並對於不同癌細胞皆具有相當之療效 (Imbert, 1998; Stahelin and von Wartburg, 1989; Stahelin and von Wartburg, 1991; You, 2005)。 7. 鬼臼毒素衍生物之發展 Etoposide (VP-16 或 VP-16-213, Fig. 2D)以及 Teniposide (VM-26, Fig. 2F)，為現行兩種主要的鬼臼毒素衍生物，此二半合成藥物為 1966 年由 Sandoz 所發展 (Sinkule, 1984; Stahelin and von Wartburg, 1991)。Etoposide 以及 Teniposide 皆以鬼臼毒素分子為半合成之基礎，Etoposide 於鬼臼毒素分子的 C4 位置以一個大分子的醣基取代其原有的羫基，而 Teniposide 與 Etoposide 不同之處在於其醣基分子尾端甲基則以含硫五碳環取代，其他如 TOP-53 (Fig. 2G) (Byl et al., 2001; Utsugi et al., 1996)亦於 C4 位置進行取代，以及水溶性之 etoposide phosphate (Fig. 2E) (Schacter, 1996)則為 E 環 4’位置的磷酸衍生物，其水溶性之優點則期望可以大幅降低因有機合成過程或是用藥所使用之有機溶劑所產生之強烈副作用，而此二種不同的鬼臼毒素衍生物亦被認為是相當具有潛力之癌症用藥 (You, 2005)。. 9.

(21) 8. 各種不同鬼臼毒素衍生物之作用機轉 Etoposide 以及 Teniposide 等鬼臼毒素類衍生物與其合成前身鬼臼毒素之作用機轉完全不同，鬼臼毒素衍生物主要分為兩種：其一為鬼臼毒素類藥物 (podophyllotoxin-like) ，另一為 Etoposide 類藥物 (Etoposide-like)。鬼臼毒素類藥物主要作用於 microtubule，抑制 tubulin 聚合作用，造成細胞週期停止於 M-phase，最後導致細胞凋亡。而 Etoposide 類藥物(Fig. 8) 則作用於第二型 DNA 拓樸異構酶 (DNA topoisomerase II)，會穩定第二型 DNA 拓樸異構酶以及 DNA 分子所形成的複合物 (cleavable complex)，進而造成單股或雙股的 DNA 斷裂，並使細胞週期停留在 DNA 複製期 (DNA synthesis, S-phase)，最後造成細胞死亡 (Fig. 9) (Chen et al., 1984; Loike and Horwitz, 1976a; Long, 1992; Long et al., 1984; Minocha and Long, 1984; Ross et al., 1984; Rowe et al., 1985; Thurston et al., 1986; van Maanen et al., 1988; Yang et al., 1985)，但 Etoposide 類藥物卻不會作用在 microtubule 上造成細胞週期停止於 M-phase (Loike and Horwitz, 1976b; Stahelin, 1973)。由於 Etoposide 類藥物的問世以及其藥物作用機轉的確立，進而促使科學家們開始針對第一型或第二型 DNA 拓樸異構酶作為新的癌症治療標的，發展出更多具有潛力的癌症治療用藥，例如 GL311. 10.

(22) (Huang et al., 1999; Lee and Huang, 2001)、NK-611 (Hanauske et al., 1995)、azatoxin (Leteurtre et al., 1992)、topotecan、irinotecan (Ardizzoni, 2004; Fiorica, 2002; Herzog, 2003)等等 (Fig. 8)。而其他衍生物如 anthracyclines、acridines、dactinomycin、ellipticines 則會嵌插進入 DNA 分子，以造成 DNA 分子的斷裂而達到其細胞毒殺之目的 (Nelson et al., 1984; Tewey et al., 1984)，亦為有潛力發展之抗癌藥物。 9. 鬼臼毒素衍生物於癌症之臨床應用 Etoposide 於 1983 年取得美國食品藥物管理局 FDA 核准上市，直到目前仍為重要的癌症用藥，在臨床上對於許多不同癌症皆具有治療效果，如白血病 (leukaemia) (Bishop et al., 1990b; Rivera et al., 1982a; Rivera et al., 1982b)、攝護腺癌 (prostate cancer) (Trump and Loprinzi, 1984)、乳癌 (breast cancer) (Boas et al., 1990; Cox et al., 1988)、小細胞以及非小細胞肺癌 (small cell and non-small cell lung caner) (Bishop et al., 1990a; Johnson, 1999)、生殖細胞腫瘤 (germ cell tumor) (Bosl et al., 1988)、淋巴癌 (lymphoma) (Salles et al., 1994; Sparano et al., 1993)、肌瘤 (sarcoma) (Carli et al., 1987; Licht et al., 1994; Worth et al., 1997)、以及各種不同具有轉移能力之惡性腫瘤 (Bokemeyer, 1998; Carlson et al., 1990)等等。. 11.

(23) 10. 新穎鬼臼毒素衍生物 — Ching001 雖然許多不同結構與功能之鬼臼毒素衍生物不斷的問世，但基於其具有之鬼臼毒素骨架或是其所需用之有機合成溶劑如 PEG 、 tween80、ethanol 等等，在臨床用藥上尚具有強烈的副作用以及細胞毒殺作用，對於癌細胞與正常細胞，仍然不具有良好的選擇性，此外癌細胞對於藥物的抗藥性問題也漸漸受到重視，故發展更多副作用更低並更具有良好細胞選擇性的新穎鬼臼毒素衍生物，為一相當重要之課題。 Ching001，為由中研院化學所李文山博士 (Dr. Li, W.-S., Institute of Chemistry, Academia Sinica, Taiwan) 所提供之鬼臼毒素衍生物，以鬼臼毒素之架構為基礎，並於其 C4 位置進行 N3 之取代 (Fig. 2B)，以期能改善其細胞毒殺作用之選擇性 (也就是針對癌細胞之高專一性)，同時降低藥物使用副作用，並研究此一新穎之抗癌藥物對於癌細胞之毒殺作用、細胞骨架以及細胞週期之影響，找出其可能作用標的與其作用機轉，並期望進行動物試驗以確立其在生物體內之實際生物活性與抗癌效果。. 12.

(24) (二)、癌症轉移抑制劑的發展 1. 癌症的轉移癌症為台灣地區十大死因之首，現已成為疾病死亡之主要原因，而肺癌的死亡率無論於男性或女性皆高居癌症死亡首位，雖然現有之癌症治療方式如外科手術、放射線治療、與化學藥物治療等不斷進步，但肺癌患者仍無法克服其早期復發以及轉移的死亡風險。癌症的轉移為一複雜且牽涉廣泛的機制，目前尚未徹底明瞭，而其過程包括原位癌 (in situ carcinoma) 的發生、癌細胞對周圍基質的侵略 (invasion of basement membrane) 、癌細胞的轉移移動 (migration)、癌細胞於基質組織的血管新生作用 (angiogenesis)、癌細胞對於血管或淋巴管的內滲作用 (intravasation) 、外滲作用 (extravasation)，造成癌細胞的遠端轉移 (distance metastasis) 至其他位置甚至轉移至遠端臟器，導致病人無法以手術方式切除其腫瘤細胞，僅能以化療或放射線治療之方式延緩癌症進程，而已開始進行遠端轉移之癌症病人，其預後通常較差。 2. 細胞骨架 actin filament 與癌細胞轉移 Actin filament 為細胞內之細胞骨架，用以支持細胞型態、提供細胞內胞器移動之網絡，並於細胞進行移動 (migration)、爬行扮演主要. 13.

(25) 角色。當細胞接受細胞外之訊息刺激，經由酪胺酸激酶接受器 (Receptor Tyrosine Kinase; RTK) 接受訊息並活化其下游細胞訊息傳遞，便會導致細胞開始進行移動爬行 (Fig. 10) (Anand-Apte and Zetter, 1997)。Rho、Rac 以及 CDC42 為 small G-protein family 之成員(Hall, 1992; Nobes and Hall, 1994)，於細胞內受到酪胺酸激酶接受器活化後，經由活化其下游蛋白，如 ARP2/3 形成 actin filament 構築中心，進而調控細胞骨架 actin filament 之合成，最後造成細胞開始朝向 actin filament 延伸方向進行細胞移動 (Fig. 11) (Tapon and Hall, 1997; Yamazaki et al., 2005)。而 Rho、Rac 以及 CDC42 分別調控細胞內之 actin filament 減少 stress fiber 的形成、並增加 lamellipodium 以及 filopodium 之構造產生，以支持細胞形成細胞突觸而促使細胞開始進行移動。而 lamellipodium 以及 filopodium 之構造通常存在於具有較強移動能力的細胞前端，故一般認為細胞的移動主要皆源自於細胞內 actin filament 之構築，而相對於具有越高轉移潛力的癌細胞之轉移，其細胞內之 lamellipodium 及 filopodium 之構造可能越趨完整。 3. 癌細胞轉移抑制劑現今發展中的癌細胞轉移抑制劑，主要包括有三類：(一)酪胺酸激酶接受器抑制劑 (Tyrosine Kinase Receptor inhibitor)，如 VEGF-R 14.

(26) (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor) 抑制劑 Thalidomide， (二)單株抗體類藥物，如 Avastin 可抑制 VEGF-R 之訊息傳遞，Iressa 可抑制 EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) 之訊息傳遞，以上二種癌細胞轉移抑制劑皆可經由抑制其下游訊息傳遞，而導致細胞無法順利增生，並抑制血管新生以及導致細胞凋亡反應產生，而達到癌細胞轉移抑制的效果。另外尚有第三類為內生型血管新生抑制劑，如 angiostatin 以及 endostatin，分別為 plasminogen 以及 collagen 之蛋白質片段，前者會結合 ATP 合成酶(ATP synthase) 並進一步影響造成血管增生的內皮細胞生長受到抑制，而後者會直接抑制血管內皮細胞之增生，最後導致腫瘤細胞缺乏血液帶來的養分與氧氣而造成癌細胞凋亡。於本論文中，我們使用由中研院化學所李文山博士所提供之新穎鬼臼毒素衍生物 Ching001 測試其對於肺癌細胞之轉移抑制能力，並期望其對於肺癌細胞具有毒殺效果的同時，亦對於癌細胞之轉移具有抑制之效果。. 15.

(27) 二、研究目標. 1. 以 Ching001 及其前身物鬼臼毒素，利用多種不同肺癌細胞株以及正常肺細胞株進行細胞毒性測試，以期了解新穎鬼臼毒素衍生物 Ching001 對於正常肺細胞株以及肺癌細胞株的細胞毒殺作用是否具有專一性。 2. 利用 FLOW cytometry 對於已處理 Ching001 之不同肺癌細胞株進行細胞週期的檢測，以期了解 Ching001 對於細胞週期影響，並以 DNA ladder assay 檢測 Ching001 與細胞凋亡之間的關係。 3. 利用免疫細胞染色法 (immunocytochemistry) 檢測 Ching001 處理後對於肺癌細胞之細胞骨架造成的改變以及其影響。 4. 以 trans-well migration assay 的方法針對具有轉移潛力的肺癌細胞株進行轉移能力測試，並了解 Ching001 處理後是否對於肺癌細胞轉移具有抑制能力。 5. 在分子機制方面，利用 Western blot 的方法了解 Ching001 對於不同肺癌細胞之細胞週期、細胞凋亡、細胞骨架、癌細胞轉移作用蛋白表現之影響和其作用機轉。 6. 於動物模式中實際測試 Ching001 於活體內對於肺癌細胞之生長抑制效果，並同時以血液檢查、生化檢查、以及組織切片了解 Ching001 對於生物體之器官毒性和正常功能的影響。. 16.

(28) 肆、研究材料與研究方法一、研究材料 1. 具有不同轉移能力之肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5 (源自中央研究院生物醫學研究所楊泮池博士, P53 mutant)、A549 (P53 wild type)、H1299 (P53-null) 以及正常肺細胞 MRC-5 (購自 ATCC 美國細胞培養公司)。以含有 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco, Invitrogen corporation ) 以及 1% penicillin/streptomycin (Gibco)之 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)培養於 37℃，含有 5% CO2 之培養箱內。 2. 新穎鬼臼毒素衍生物 Ching001，來自中央研究院化學所李文山博士提供。 3. ICR-Foxn1 nude mice 免疫缺陷裸小鼠，來自國家實驗動物中心。. 17.

(29) 二、研究方法 1. 細胞培養 (Cell Culture) 將細胞培養於含有 10% FBS 以及 1% penicillin/streptomycin 之 DMEM 培養基 (pH 7.4)中，並於 37℃、含有 5% CO2 之培養箱內生長，當細胞於培養皿中長滿至單層時，即可進行繼代培養。繼代培養於無菌操作台內實施，首先除去老舊須汰換之 DMEM 細胞培養基，繼以 Phosphate Buffer Saline (PBS) 潤洗，以徹底清除老舊培養基，再以 trypsin-EDTA 處理細胞，使細胞脫落於原貼附之培養皿後，取適當比例之細胞重新培養於新的培養基中，置於培養箱內生長。. 2. 藥物之細胞毒性分析 (Compound Cytotoxicity Assay) 首先取 2.5 x 106 不同肺癌細胞/正常肺細胞於 10cm 培養皿中，分別以不同濃度 Ching001 或鬼臼毒素以 0.5 μM、1 μM、3 μM、5 μM 或 DMSO 處理 48 小時後，經過 trypsin-EDTA 處理使細胞自培養皿上脫落，並利用 trypan blue 將細胞染色，於顯微鏡下計數細胞量，可得知細胞經藥物處理後，藥物是否對於細胞具有毒殺作用。. 3. 細胞週期分析 (FLOW Cytometry) 細胞於不同細胞週期時，具有不同的核酸含量變化，利用 Propidium. 18.

(30) Iodide (PI, from Sigma) 嵌插入核酸分子，並利用 FLOW cytometry 偵測 PI 所發出之螢光量，來代表樣品中核酸分子含量的多寡。首先將不同肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、A549、H1299 個別處理 0.5 μM 或 1 μM 之 Ching001，並依照 24hr 或 48hr 不同時間點收取細胞，經過 PBS 潤洗二次，並於 80%酒精於-20℃固定細胞 over-night 後再以 PBS 潤洗細胞完全去除酒精，加入 2 μg/ml PI、1 μg/ml RNase A 以及 Triton-X100 於 PBS 混合液，於 37℃避光反應 1hr，反應結束後以 FLOW cytometry 偵測各不同時濃度、不同時間點之不同細胞的細胞週期變化。. 4. DNA Ladder Assay 於細胞凋亡發生時，DNA ladder 為細胞進行細胞凋亡後所產生的後期結果，由於細胞凋亡時所引發的一連串訊息傳遞而活化內生性核酸水解酶 (endogenous nuclease)，在 nucleosome 間之 linker DNA 做切割，造成凋亡的細胞具有以 200bp 為間隔倍數的 DNA 片段化的特徵。不同肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、A549、H1299 經過不同濃度 3 μM 或 5 μM 之 Ching001 處理 48 小時後，利用離心的方法收取細胞，經過 PBS 潤洗後利用 80%酒精固定細胞 over-night，其後再以 PBS 潤洗二次以完全除去酒精，加入 DNA 萃取溶液 (0.2 M phosphate-citrate buffer, pH 7.8) 混合均勻後以 37℃反應 1hr，再以離心方式取其上清液，並加入 RNase A 於 37℃反應 45min 去除 RNase，反應後加入 proteinase K 再 19.

(31) 於 37℃反應 45min 以去除多餘蛋白質，最後將反應完全之樣品利用膠體電泳分析其 DNA ladder 之呈現情形。. 5. 西方墨點法 (Western Blot) 西方墨點法利用抗體與蛋白質的專一性結合，為用以偵測特定蛋白質之實驗方法。首先將細胞處理 5 μM Ching001 或僅處理溶劑 DMSO，並於不同時間點 6hr、12hr、24hr、48hr 收取細胞，並以 2 倍 RIPA buffer (0.1 M Tris-HCl，0.3 M Nacl，0.5% Deoxycholic acid，2% NP-40，2 mM EDTA，10 μM PMSF，100 pg/ml aprotinin，5 pg/ml leupeptin，1 μM DTT) 打破細胞並進行蛋白質定量，於各樣品中取 50 μg 的蛋白質樣品進行膠體電泳並轉漬於 PVDF membrane 後，利用 anti-Bcl-2 (1/2000, Upstate)、anti-caspase-9 (1/3000, Upstate)、Rho (1/2000, Upstate)、Rac (1/2000, Upstate) 之專一性抗體辨識蛋白質分子並以 ECL 呈色，於照相系統上偵測結果。. 6. 免疫細胞染色法 (Immunocytochemistry) 免疫細胞染色法主要利用專一性辨識 α-tubulin 或 F-actin 之抗體進行細胞骨架分析，再利用帶有螢光分子的二次抗體辨識一次抗體，以便於利用螢光激發並顯現目標蛋白 α-tubulin 或 F-actin 於細胞內的表現量與表現位置。首先將各不同肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、A549、H1299 20.

(32) 分別處理不同濃度之 Ching001，或於不同時間點 6hr、12hr、24hr、 48hr 收取細胞，收取下來之細胞先以 PBS 潤洗二次後再以 1% formaldehyde 於室溫固定細胞 20 min，再以 PBST (PBS + 0.1% tween20) 潤洗細胞二次，並注意保持細胞濕潤，接著利用帶有綠螢光 FITC 之 anti-α-tubulin (1/200, Upstate) 或 anti-F-actin (Phalloidin-FITC, 1/20, Sigma Alderich) 抗體以辨識目標蛋白 α-tubulin 或 F-actin，並混合藍螢光核染劑 DAPI (4'-6'-Diamidino-2-phenylindole, Sigma)於 37℃反應 1hr，經過 PBST 潤洗二次後，以螢光顯微鏡偵測細胞中目標蛋白的表現。. 7. 分子模擬對接 (Molecular Docking) 為了暸解 Ching001 對於 tubulin 上之 colchicine binding site 之結合能力，首先利用 GOLD3.1.1 之分子模擬對接軟體計算已知之鬼臼毒素之構形，再將此構形對接於 tubulin 之 colchicine binding site 上，以此計算結果再與已知結晶構形之鬼臼毒素-tubulin 做比對，以確認此一計算軟體 GOLD3.1.1 可準確計算並模擬分子對接模式。接著利用軟體計算 Ching001 之立體空間結構，兼之考慮分子間作用力，例如氫鍵、疏水性作用力、凡得瓦力等等，計算 Ching001 以及 tubulin 兩分子間鍵結狀況以及其結合親和力。. 21.

(33) 8. 細胞轉移能力分析 (Trans-well Migration Assay) 此試驗利用 Boyden chamber (Falcon, trans-well column) 測試細胞之轉移移動能力，此 column 底面覆有一層含有 8 μm 孔洞之膜，利用此膜將 well 分為上下兩層，使上層具有轉移能力之細胞能穿越此孔洞至膜的另一面達到下層，並貼附於其上。首先取 5 x 104 已經藥物處理的細胞，置於 trans-well 上層不含有 FBS 之 DMEM 培養基中，而下層則為含有 10% FBS 之 DMEM 誘導培養基，並將細胞連同此 column 置於 37℃培養箱中培養 16 小時，此期間並持續以藥物處理。此時，細胞如具有轉移能力，則會穿過 8 μm 孔洞之膜達到較具養分含有 10% FBS 之下層培養基，而貼附於膜上相對於上層的另一面。經過 16 小時之培養、轉移後，利用棉花棒仔細清除上層多餘之細胞，並以 1% formaldehyde 固定下層細胞於膜上，再以 crystal violet 進行細胞染色，於顯微鏡下觀察結果並拍照紀錄及定量。. 9. 動物實驗 (Animal Model Test) 本動物實驗主要利用 ICR-Foxn1 nude mice 裸小鼠 (國家實驗動物中心) 進行藥物對於腫瘤細胞生長抑制效果之測試。首先以 trypsin 處理並收集肺癌細胞 A549，接著以 PBS 潤洗，再以 Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS，from Invitrogen) 潤洗二次並調整細胞濃度至每 100 μl 含有 5 x 106 的細胞。取 100 μl 的 HBSS 細胞懸浮液注入五周齡的 22.

(34) ICR-nude mice 裸小鼠背部皮下。腫瘤細胞注射後約 10~14 天，當腫瘤大小長至約 50 mm3 時，開始各別給予不同劑量 0.4 mg/kg 或 2 mg/kg 之 Ching001 或 4 mg/kg 之現行臨床化療藥物 Taxol 注射於裸鼠腹腔，每隔一天注射一針，分為五天施與 (day 1，3，5，7，9) 共計給藥 5 針，並以一組僅注射 solvent (由 99%酒精、助溶劑 cremophor、ddH2O 組成，其比例為 2：1：7) 之裸小鼠作為 solvent control 以及一組完全不處理之裸小鼠作為 untreated control。自藥物治療開始，實驗紀錄總計 35 天，於實驗期間測量腫瘤大小變化以及其體重變化並紀錄，量取腫瘤最長的一邊 A 與最短的一邊 B，以(A x B2)/2 代表腫瘤體積大小，畫製腫瘤生長曲線圖及體重變化圖。實驗結束後，採取各組裸小鼠之血液樣本進行生化及血液的分析檢查，並取其心臟、肺臟、肝臟、腎臟、及腫瘤做組織切片觀察。 10. HE-staining (Haematoxylin-Eosin staining) 在動物實驗後，給予各不同藥物處理之小鼠取其重要組織器官如心臟、肺臟、肝臟、腎臟、以及腫瘤組織利用臘塊切片的方式，以 HE-staining 方式對其細胞核 (以 Haematoxylin 染色，呈現藍紫色) 與細胞質 (以 Eosin 染色，呈現紅色) 進行染色，觀察其組織切片是否與對照組組織切片有差異。HE-staining 作法為先取組織器官並以 formaldehyde 固定後再作為蠟塊切片，取此組織切片以 xylene 脫臘、. 23.

(35) 再分別以 99.9%酒精、70%酒精、50%酒精以及二次水復水後，以核染劑 Haematoxylin 染色 5 分鐘並接著以二次水潤洗，再以酸性酒精 (70%酒精加上 1% hydrochloric acid) 處理 15 秒並再以二次水潤洗後，以 Eosin 染色 15 分鐘並再以水潤洗後，即可以 50%酒精、70%酒精、99.9%酒精依序進行脫水，最後以 histoclear 進行封片並於顯微鏡下觀察。. 24.

(36) 伍、實驗結果一、藥物 Ching001 對於肺癌細胞之細胞毒性以不同濃度之 Ching001 以及其前身物鬼臼毒素，對於不同肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、H1299 以及正常肺細胞株 MRC5 進行細胞毒殺能力測試，其結果以回歸曲線推算其 IC50。Ching001 對於各不同肺癌細胞株以及正常肺細胞株之 IC50 其值各為：CL1-0 = 1.99 μM、CL1-5 = 1.90 μM、A549 = 1.21 μM、H1299 = 2.58 μM、MRC5 = 8.27 μM。鬼臼毒素對於各不同肺癌細胞株以及正常肺細胞株之 IC50 各為：CL1-0 = 0.28 μM、CL1-5 = 0.006 μM、H1299 = 1.09 μM、MRC5 = 4.23 μM (Fig. 12)。. 二、藥物 Ching001 對於細胞週期的影響以不同濃度 0.5 μM、1 μM Ching001 處理不同肺癌細胞株 CL1-0、 CL1-5、A549、H1299，並於不同時間點 24hr、48hr 以 FLOW cytometry 觀察其細胞週期的變化。發現在 24hr、低濃度 0.5 μM Ching001 處理後，CL1-5 以及 H1299 其細胞週期會明顯的停止在 G2/M 期，並同時有 sub-G1 細胞的出現，而 CL1-0 則已開始出現細胞凋亡現象。如以 1 μM 濃度處理各不同肺癌細胞株 24hr，則 A549、CL1-5 以及 H1299 其細胞週期皆會明顯停留在 G2/M 期，並同時在四株不同細胞株中皆 25.

(37) 可觀察到細胞凋亡的反應 (Fig. 13)。另外如果延長 Ching001 之處理時間，則可發現在低濃度 0.5 μM 處理之狀況下，CL1-5、H1299 亦具有 G2/M 細胞週期休止的現象，並同時在 CL1-0、CL1-5 以及 H1299 會有細胞凋亡增加之反應。如再提高 Ching001 處理濃度，則 A549 亦會發生明顯的 G2/M 細胞週期停止現象，伴隨 sub-G1 週期的細胞增加，並有明顯的細胞凋亡反應，而於 CL1-0、CL1-5、以及 H1299 則發生嚴重的細胞凋亡反應 (Fig. 13)。. 三、藥物 Ching001 對於肺癌細胞凋亡的檢驗在 DNA ladder 的試驗中，我們以 DMSO 作為 control 組，利用不同濃度 3 μM、5 μM Ching001 以及四種不同肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、 A549、H1299，經過 48hr 的處理後，利用膠體電泳分析細胞凋亡的特徵 DNA ladder。以 Ching001 處理後各種不同肺癌細胞株，無論是在 3 μM 或是 5 μM 的處理下，皆能明顯表現出細胞凋亡的特徵 DNA ladder；而在未處理 Ching001 的 DMSO control 組，僅能看到完整而未受切割的細胞 DNA，不會有 DNA ladder 現象的產生 (Fig. 14A)。而若以 5 μM 分別處理四種不同肺癌細胞 6hr、12hr、24hr、48hr，並經過蛋白質萃取以及定量後針對細胞凋亡的分子標記 (molecular marker) 進行 Western blot，則可發現在 A549 以及 H1299 其抗細胞凋. 26.

(38) 亡 (anti-apoptosis) 之蛋白質分子 Bcl-2，經過 Ching001 處理 6hr、 12hr、24hr、48hr 後有逐漸減少的趨勢。再者針對細胞凋亡的分子標記 caspase-9 進行 Western blot 後，亦在四株不同的肺癌細胞裡同時發現不活化態的 pro-caspase-9 在經過 Ching001 處理後自 6hr 至 48hr，皆有逐漸下降的趨勢，而活化態的 caspase-9 則在 Ching001 處理過後逐漸表現 (Figs. 14B and C)。. 四、藥物 Ching001 對於細胞骨架 mucrotubule 的影響經由免疫細胞染色發現，經過 5 μM Ching001 處理 24hr 後的肺癌細胞株 CL1-5、以及 A549，其細胞骨架 microtubule 皆呈現疏鬆且受破壞的狀況，並且同時有雙核至多核的現象以及 apoptotic bodies 的產生 (Fig. 15A)。如降低 Ching001 濃度至 0.5 μM 針對 CL1-5 以及 A549 處理 6hr，可觀察到在 Ching001 處理 6hr 後，細胞的細胞骨架 microtubule 其結構開始疏鬆破碎，再持續處理至 12hr 到 24hr 則 microtubule 網絡幾近受到破壞而聚集於核周圍，而在處理 24hr 後兩種不同的肺癌細胞株皆會開始出現雙核細胞，且型態已與未處理細胞迥異，如繼續處理至 48hr，則細胞已呈現雙核至多核狀態，並有 apoptotic bodies 產生 (data not shown)。另外於細胞分子模擬對接實驗亦發現，Ching001 可確實與 tubulin 具有良好的親和性，且結合於 colchicine binding site 上. 27.

(39) (Fig. 15B)。. 五、藥物 Ching001 對於肺癌 actin 細胞骨架調控蛋白的影響經由免疫細胞染色的方法，針對細胞骨架 F-actin (filamentous actin) 進行染色，以釐清經過不同濃度 Ching001 處理 48hr 過後是否對於細胞骨架 F-actin 之構造產生影響。於結果中可觀察到對照組之肺癌細胞 CL1-5 其 F-actin 構造完整而散佈於細胞質內，並兼有細胞突觸 lamellipodium 及 filopodium，而在經過 Ching001 處理過後，其 F-actin 細胞骨架皆呈現疏鬆而破碎的外觀，並且失去其用以進行 migration 之細胞突觸 lamellipodium 及 filopodium (Fig. 16A)，此一情況於其他肺癌細胞株亦可被觀察到 (data not shown)。而利用 Western blot 方法檢測細胞內調控 actin filament 細胞骨架之調控蛋白 Rac、Rho 其蛋白質表現量與 actin filament 結構的關係，可發現經過 6~48hr 不同時間處理 1 μM Ching001 的各肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、A549、以及 H1299，其 actin filament 調控蛋白 Rac 之表現量會明顯下降，而 Rho 之表現量亦有輕微下降 (Fig. 16B)。. 六、藥物 Ching001 對於肺癌細胞的轉移潛力測試利用具有高度轉移潛力的肺癌細胞株 CL1-5 處理不同濃度 0.5 μM、1. 28.

(40) μM、3 μM、5 μM、10 μM 之 Ching001，並以處理溶劑 DMSO 作為對照組，經過 48hr 作用並進行轉移能力測試 16hr 後，以結晶紫 (crystal violet) 針對具有轉移能力的細胞進行細胞染色，再計數所轉移的細胞數目進行定量分析。其結果可明顯觀察到，在未處理藥物的溶劑對照組中有多量具有轉移能力被染色的細胞，而在經過 Ching001 處理後，於低濃度 0.5 μM 時已有顯著受到抑制的作用，如再提高 Ching001 處理濃度至 1 μM、3 μM、5 μM、甚至 10 μM，則具有高度轉移潛力的肺癌細胞株 CL1-5 其轉移能力則嚴重受到抑制 (Fig. 17A)。如以溶劑處理的對照組所具有轉移能力的細胞量為 100%，則以各不同濃度 0.5 μM、1 μM、3 μM、5 μM、10 μM Ching001 處理後仍具有轉移能力的細胞量分別為：25.4%、6.0%、4.9%、4.6%、以及 3.1% (Fig. 17B)。. 七、藥物 Ching001 於動物模式中的效力於動物實驗中，我們利用免疫缺陷裸小鼠 ICR-nude mice 作為模式動物，並注射 5 x 106 相等細胞量的肺癌細胞 A549 於其背部皮下，待其腫瘤長至 50 mm3 大小後開始注射不同處理的藥物，其劑量分別為： solvent，4 mg/kg Taxol，0.4 mg/kg Ching001，2 mg/kg Ching001，以及完全不處理之對照組 (untreated control)，在開始連續每隔一天，共處理五天藥物並同時紀錄腫瘤生長曲線以及體重變化曲線，最後犧牲. 29.

(41) 裸小鼠並採集其血液樣本、組織樣本進行血液、生化、以及組織切片檢查。於結果發現給 2 mg/kg 劑量之 Ching001 予裸小鼠後，對於腫瘤細胞的生長抑制效果，可有效持續至第 24 天，且其對於生長的抑制效果皆較同劑量處理之現行化療用藥 Taxol 為佳 (Fig. 18A)。而在裸小鼠之血液檢查與生化檢查的部份，相較於 Taxol、solvent 處理組和完全不處理的裸小鼠，不同劑量 Ching001 的給予對於正常身體相關的功能指標並無明顯變化 (Fig. 19 and Table 1)，僅肝指數 GPT 及 GOT 於 solvent control 及 taxol 處理組較為偏高，另在實驗進行期間，各組別裸小鼠體重皆無明顯改變 (Fig. 18B)。而於組織器官切片染色中，亦可見經過 Ching001 處理後之小鼠，其身體重要組織器官如心臟、腎臟、肝臟以及肺臟與對照組小鼠之組織器官皆無明顯差異 (Fig. 20A and B)，而於小鼠腫瘤之切片中亦可發現，對照組小鼠其腫瘤細胞生長良好，但於 Ching001 處理之小鼠，其腫瘤組織切片則呈現細胞凋亡之現象 (Fig. 20C and D)。. 30.

(42) 陸、討論在藥物之細胞毒性實驗中，我們使用了 Ching001 以及其前身藥物鬼臼毒素處理不同肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、H1299 以及正常肺細胞株 MRC5 作為模式細胞株，其結果發現在低濃度之 Ching001 處理時，對於正常肺細胞以及肺癌細胞株具有相當良好的細胞毒殺選擇性，舉例來說，如以 3 μM 之 Ching001 處理時，不同肺癌細胞株其細胞存活率皆低於 40%，但正常肺細胞株其細胞存活率尚可達 80%左右。而相較於 Ching001，以鬼臼毒素處理相同肺癌細胞株以及正常肺細胞株，則僅需相當低濃度便會對正常肺細胞以及肺癌細胞株造成嚴重的毒殺效果。由此實驗結果可知，相較於其前身物鬼臼毒素對於細胞之毒殺效果缺乏良好選擇性 (Gordaliza et al., 2004)，Ching001 在低濃度處理時，對於正常肺細胞以及肺癌細胞具有較佳的癌細胞專一性，對於肺癌細胞具有高度的毒殺作用而對於正常肺細胞則其毒殺作用較輕微，故我們認為 Ching001 相當具有潛力繼續發展成為癌症治療藥物。. 而在細胞毒性試驗後，我們想進一步了解 Ching001 其對於肺癌細胞毒殺作用的作用機轉，所以首先利用 FLOW cytometry 的方法進行細胞週期的分析，以期了解 Ching001 對於細胞週期的影響為何。在結果中我們發現，以 Ching001 處理的各種不同肺癌細胞株，於低濃度 0.5 μM. 31.

(43) 的處理時 CL1-5 以及 H1299 細胞株在細胞週期 G2/M 時期有明顯休止的現象，而 CL1-0 細胞株對於 Ching001 較為敏感，於低濃度處理狀況下已有細胞凋亡反應增加，另外 A549 細胞株則為抗性較強之細胞株，於低濃度處理下，並無明顯影響其細胞週期。於 48hr 延長時間處理或提高濃度至 1 μM 處理後，四株不同肺癌細胞株皆會伴隨著 sub-G1 期的細胞出現以及細胞凋亡反應的增加，並且同時其 G2/M 期之細胞休止現象有減少之情況。故據此實驗結果，我們利用 DNA ladder 以及 Western blot 的方法來證實 Ching001 與細胞凋亡的關係。. DNA ladder 為細胞進行細胞凋亡後所產生的後期結果，由於細胞凋亡的發生而活化內生性核酸水解酶 (endogenous nuclease) ，在 nucleosome 間之 linker DNA 做切割，造成凋亡的細胞具有 DNA 片段化的特徵，為細胞凋亡已經在細胞體內發生之有力證據 (Li et al., 2001; Vermeulen et al., 2005)。而在兩種不同濃度 3 μM 以及 5 μM Ching001 處理 48hr，經過 DNA 萃取以及膠體電泳後，可以明顯觀察到 DNA ladder 的特徵，所以 Ching001 的處理確實會造成肺癌細胞走向細胞凋亡。並且在對於抗細胞凋亡分子標記 Bcl-2 以及細胞凋亡分子標記 caspase-9 之 Western blot 分析中亦可證明，Ching001 的處理會造成 Bcl-2 以及不活化態 pro-caspase-9 的表現量下降，並同時造成活化態的 caspase-9 表現量上升，故推測 Ching001 會經由影響細胞凋亡訊息傳遞路徑上的分子， 32.

(44) 造成細胞走向細胞凋亡而達到抑制癌症細胞生長的效果。但於不同肺癌細胞株內 Bcl-2 與 caspase-9 活性改變的狀況有不同的情形，如經過 Ching001 處理後，Bcl-2 之表現量於 A549 以及 H1299 細胞株中有下降的情況，但於 CL1-0 以及 CL1-5 細胞株中則此一趨勢不明顯，此一情況可能於各不同肺癌細胞株之基因背景不同而產生不同的調控機制有關，如 CL1-0 及 CL1-5 為 p53-mutant 之肺癌細胞株，而 A549 為 wild-type p-53 肺癌細胞株，而 H1299 則為 p-53-null 之肺癌細胞株，其中原因之一可能為 p-53 表現狀況的不同而導致 Bcl-2 表現狀態的不同；但經過 Chig001 處理後，引發細胞凋亡之蛋白酶 caspase-9 於四株不同肺癌細胞株中皆有活化之狀況，故 Ching001 確實在細胞模式中可以導致肺癌細胞走向凋亡之路徑而達成抗癌之效果。. 而在低濃度之 Ching001 處理時，亦會造成肺癌細胞的細胞週期停止於 G2/M 期，造成細胞停止細胞分裂而無法繼續增殖生長。為了解此一現象，我們利用免疫細胞染色法，針對細胞分裂所必須之細胞骨架 microtubule 進行分析。在正常細胞內，細胞骨架 microtubule 為呈現網狀之完整分佈於整個細胞體內，並可於細胞分裂期促使細胞順利分裂，但在 0.5 μM 低濃度 Ching001 處理後之各種不同肺癌細胞株中，其細胞骨架 microtubule 於 6hr 之處理時間點已可見到呈現疏鬆且破碎的狀態，至 12hr 則其 microtubule 網絡幾乎受到破壞且聚集於細胞核周圍，無法 33.

(45) 順利延伸散佈於整個細胞體內，造成細胞無法順利進行細胞分裂而使細胞週期停止於 G2/M 期，且細胞已失去其原有之細胞型態。如在相同濃度下持續以 Ching001 處理各不同肺癌細胞株 24hr 至 48hr 則可進一步發現，細胞因無法順利進行細胞分裂開始呈現雙核至多核的狀態，並伴隨有 apoptotic bodies 的出現，此則為細胞開始走向凋亡的現象(data not shown)。故 Ching001 的處理首先會對於細胞骨架 microtubule 的聚合作用造成抑制效果，使得細胞骨架 microtubule 無法順利聚合延長而受到破壞並聚集於核周圍，造成細胞無法增殖分裂以及細胞週期的休止，而如在此狀況下持續處理 Ching001，則會進一步造成細胞走向細胞凋亡，而達成 Ching001 對於肺癌細胞之毒殺效果。. 且於分子模擬對接的實驗中亦可解釋，Ching001 可能可以藉由結合於 tubulin 之 colchicine binding site 上，進而推測 Ching001 可藉由穩定的結合在此位置，抑制 tubulin 的聚合能力，而聚合受到抑制的 microtubule 則使細胞週期無法順利進行，導致細胞週期於 G2/M 期停止，最後使細胞走向凋亡，而 Ching001 於 colchicine binding site 上之親和能力、詳細的作用力鍵結方式、以及結合的角度方式，則需再進一步的詳細計算，以實驗證明，方可知悉。. 由於癌症的轉移為癌症造成死亡的主要原因之一，而癌細胞的轉移. 34.

(46) 潛力與細胞的移動能力亦具有相關性，故我們亦利用 Ching001 處理四種不同肺癌細胞株 CL1-0、CL1-5、A549、H1299，針對影響細胞移動能力之 actin filament 及其調控蛋白 Rac、Rho 進行分析，於結果發現經過 Ching001 處理過後之各肺癌細胞株，其 actin filament 之架構會因藥物的處理而疏鬆，並且與細胞移動能力有關之 lamellipodium 以及 filopodium 構造亦消失，並且於 Western blot 分析中也發現經過 Ching001 處理 6hr 過後，調控細胞骨架 actin filament 結構之調控蛋白 Rac 其表現量會顯著下降，表示經過 Ching001 處理過後之肺癌細胞其細胞骨架 actin filament 確實會受到改變，而 stress fiber 調控蛋白 Rho 其表現量之下降相對於 Rac 則較不明顯，其原因可能為細胞內 Rho 之基礎表現量較低，故無法明顯的於本實驗中顯現出差異，但相較於 DMSO 組之實驗結果，經過藥物處理後之 Rho 蛋白表現量亦有些許的降低。而為了了解 Ching001 是否對於肺癌細胞的轉移能力具有抑制能力，故利用 trans-well migration 進行 in vitro 試驗，以具有高度轉移潛力的肺癌細胞株 CL1-5 作為模式細胞，進行轉移能力測試定量。於此試驗結果可發現，Ching001 於低濃度 0.5 μM 即可顯著抑制 CL1-5 的轉移能力達 75%左右，如再提高處理濃度至 1 μM、3 μM、5 μM、10 μM，則 Ching001 可以抑制 90% 以上具有高度轉移潛力的 CL1-5 肺癌細胞之轉移能力。故 Ching001 除了對於肺癌細胞具有高度的毒殺作用之外，亦可經由抑制細胞骨架調控. 35.

(47) 蛋白的訊息傳遞，而抑制細胞骨架產生 lamellipodium 或 filopodium 的結構，進而抑制細胞的移動潛力，故 Ching001 於 in vitro 對於肺癌細胞的高轉移情形所具有之高度抑制能力，我們相信 Ching001 可能具有可發展為對於癌症轉移病患的治療用藥的潛力。. 最後為了確認 Ching001 在生物體內之實際效果，以及了解其對於生物體之正常生理機能的影響，我們利用 ICR-nude mice 免疫缺陷裸小鼠，並注射 A549 肺癌細胞於裸小鼠之背部皮下，經過不同劑量藥物處理後，利用測量並紀錄裸小鼠之腫瘤大小來測試藥物對於肺癌細胞的生長抑制效果。於結果中發現給予不同 Ching001 劑量 0.4 mg/kg、2 mg/kg 之裸小鼠，其腫瘤之生長會明顯受到抑制達第 24 天左右，而相較於給予目前的癌症臨床用藥 Taxol，給予 4 mg/kg 劑量處理之裸小鼠，較低劑量 2 mg/kg 之 Ching001 處理對於腫瘤的生長抑制作用則更為良好。另外，給予 Ching001 治療的裸小鼠，其血液以及生化檢查所得之數值，其檢查數值大多與僅處理 solvent 或完全不處理 (untreated control) 之對照組並無明顯差異，而於 solvent control 組以及 taxol 處理組其 GOT 以及 GPT 之值相較於 Ching001 處理組及完全不處理組為高，造成此結果的原因之一可能 taxol 藥物的施打對於肝細胞的損害程度可能較高，連續之 taxol 施打可能會造成較為嚴重的肝功能損害造成肝臟有發炎的傾向；而另一可能造成肝指數較高的原因為於抽取血液所採取的方法為心 36.

(48) 臟採血法，此一採血法會造成心臟骨骼肌的細胞損害而使心臟肌肉細胞釋放 GOT 多於 GPT，並造成肝指數有上升的情況，所以 solvent control 組有較高之 GOT 及 GPT，後者原因則有待採血時之技術改進及多重複實驗老鼠的測試已進一步確定實際的 GOT 及 GPT 數值。另外在試驗期間，各不同處理組別間之裸小鼠其體重亦無明顯改變，顯示在給藥與實驗期間，小鼠的正常生理功能與發育並未受到藥物處理而受到影響。而於組織器官切片染色中，亦可見經過 Ching001 處理後之小鼠，其身體重要組織器官如心臟、腎臟、肝臟以及肺臟與對照組小鼠之組織器官皆無明顯差異，而於小鼠腫瘤之切片中亦可發現，對照組小鼠腫瘤切片散佈有腫瘤細胞，以及因細胞缺乏養分及氧氣導致部分嗜鹼性球 (basophile) 細胞引起之細胞壞死 (necrosis) 現象，但於處理 Ching001 藥物的小鼠其腫瘤切片，可發現其腫瘤組織呈現許多因細胞凋亡而導致的組織間空泡，並可見腫瘤細胞其細胞核皺縮並呈現狹長型之外表。. 這個結果說明了給予 Ching001 作為癌症治療用藥，對於正常生理之機能並無特殊影響，且相較於現行臨床用藥 Taxol 具有更強之生長抑制效果，更具有發展作為新穎的癌症臨床用藥的價值。. 37.

(49) 柒、未來工作 1. 在細胞模式方面： A. 以蛋白質體的方法分析 Ching001 對整個細胞蛋白體的影響，以尋找更多的影響蛋白 (effector proteins)，再以 Western blot 來驗證蛋白質體學所偵測之蛋白；續以生物資訊之路徑分析 (Pathway analysis) 挑選出經過 Ching001 處理後的細胞內主要訊息傳遞改變路徑，或以分子模擬等方法來分析 Ching001 在細胞內的作用目標分子，以深入探討藥物作用的其他可能機轉。 B. 利用 microtubule polymerization assay 的方法來探討 Ching001 的處理，是否會對於細胞的 microtubule 細胞骨架的聚合作用有抑制的現象，並針對 tubulin 之乙醯化程度之改變，探討 Ching001 對於 tubulin 細胞骨架的聚合抑制作用的分子機制。 C. 利用更多具有不同抗藥性能力之肺癌細胞株，用以測試 Ching001 對於具有抗藥性之細胞株是否具有相同癌細胞毒殺效果。另外並利用更多正常之肺上皮細胞株如 BES-6、TC-cell 或是正常之 lymphocyte 作為對照組，檢查 Ching001 是否對於正常細胞以及骨髓會有毒殺效果。 D. 利用 combine treatment 之方法，將 Ching001 合併處理其他以之抗癌藥物如 COX-II inhibitor 或血管新生抑制劑如 Avastin、Iressa 等等，. 38.

(50) 以分析 Ching001 於癌細胞毒殺能力、轉移抑制能力、血管新生抑制能力是否有更佳之效果。 E. 另外亦可應用 single cell trace 之技術標定追蹤單一細胞，分析細胞之移動能力是否在 Ching001 處理後受到影響。. 2. 在動物模式方面： A. 增加動物實驗的模式，如利用癌細胞胸腔注射 (intra-trachea injection) 的方式探討 Ching001 對於原位 (in situ) 肺癌細胞的生長抑制能力。 B. 利用癌細胞尾靜脈注射的方式，分析 Ching001 在 in vivo 之癌細胞轉移能力抑制效果的測試，如尾靜脈 melanoma 細胞注射；或可利用其他癌細胞之動物轉移模式，如胸部皮下注射乳癌細胞。 C. 使用不同的藥物施用療程，例如 2-round treatment 給予藥物，以測試 Ching001 的處理對於腫瘤細胞的長期生長抑制效果，或是更大型腫瘤的抑制效果。 D. 利用更多不同種類或更大型的動物進行藥物毒性、藥物動力學、藥物代謝以及腫瘤生長抑制能力的測試，期望 Ching001 此一藥物能發展成為新一代的癌症用藥。. 39.

(51) 捌、附圖. Fig 1. The microtubulin polymerizatioin/depolymerization inhibitors as antimitotic agents. (Islam and Iskander, 2004). 40.

(52) Fig. 2 The structures of the colchicine, podophyllotoxin and it’s derivatives. A. Podophyllotoxin B. Ching001 C. Colchicine D. Etoposide E. Etoposide phosphate F. Teniposide G. TOP-53. 41.

(53) Fig. 3 The structure of microtubulin. A. The α,β-heterodimer of tubulin is the protofilament subunit of microtubule. And α,β-tubulin heterodimer can polymerize by using GTP to form protofilament. The GTP molecule (shown in red) is more tightly in α-tubulin than β-tubulin, and this character plays an important role in the dynamic of microtubule polymerization and depolymerization. B. The microtubule is a hollow tube formed by 13 protofilaments aligned around the central of microtubule. C. A view of a microtubule under electron microscope showing a ring of 13 distinct protofilaments. (from Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Bruce Albert et al., 2002). 42.

(54) Fig. 4 Dynamic instability of microtubules. A. When in the highly concentration of GTP-bound α,β–tubulin heterodimer, the filament of microtubule will growing by α,β–tubulin heterodimer polymerization. The new GTP-bound tubulin molecules are added more rapidly than GTP hydrolyzed, so the longer microtubule will be showed. B. Dynamic instability results from the hydrolysis of GTP of β-tubulin during or shortly after polymerization, which reduces its binding affinity to α-tubulin of adjacent α,β–tubulin heterodimer. If the GTP hydrolyzed more rapidly than new tubulin heterodimer added, the presence of GDP-bound tubulin at the end of the microtubule will lead to depolymerization and shrinkage of microtubule. (from The Cell, A Molecular Approach, 2nd edition, Cooper and Hausman, 2000). 43.

(55) Fig. 5 The transition between microtubule growth and microtubule shrinkage could be influenced by microtubule polymerization and depolymerization inhibitors. Taxol could bind the β-subunit of tubulin and stabilize the microtubule from depolymerization. Opposing its action the colchicine, vinblastin and podophyllotoxin like compound could bind with exchangeable GTP on both α- and β-tubulin to destabilize the microtubule as polymerization inhibitors. (modified from Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Bruce Albert et al., 2002). 44.

(56) Fig. 6 The cell cycle and mitosis. A. The cell cycle divided in four-stages. G1 represent the Gap-1 stage, when in this stage the cell is beyond from mitosis. In Synthesis-phase (S-phase), the DNA will be replicated for mitosis. During Gap-2 phase, the cell will synthesize proteins that necessary for mitosis and prepare for further mitosis. At last in Mitosis-phase (M-phase), the mitosis goes on and finish at G1. B. A brief illustration of cell cycle. (from Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Bruce Albert et al., 2002 and Genes VIII, Benjamin Lewin, 2004). 45.

(57) Fig. 7 The apoptosis signaling pathway in the cell. A. The activation of apoptosis in caspase signaling cascade is results from chemical damages to DNA which stimulates the cleavage of Bid and inhibits the anti-apoptosis complex Bcl-2/Bcl-XL and initiates the permeability transition of the mitochondrial membrane. The permiability transition releases several factors for example cytochrome c into the cytoplasm. Cytochrome c is a key protein in electron transport, when it released from mitochondria the apoptotic signals will begin. The activation of Apaf-1 will activates caspase-9 and the series of the caspase activation cascade. The caspases pass the apoptotic signal in a proteolytic way, with caspases cleaving and activating another caspases or apoptosis related proteins, finally leading to cell death. (from www.biocarta.com and Genes VIII, Benjamin Lewin, 2004). 46.

(58) Fig. 8 The structure of other DNA topoisomerase inhibitors. A. GL-311 B. NK-611 C. Azatoxin D. Topotecan E. Irinotecan. 47.

(59) Fig. 9 Topoisomerase II Mechanism. Topoisomerase II will bind one DNA duplex termed the G segment (gate-segment), and the binding of ATP to both N-terminal domains will bring the two domains of topoisomerase II together. This conformational change leads to the cleavage of both strands of the G segment and the bind to additional DNA duplex T segment. The T segment will move through the break of the G segment and out from the bottom of the topoisomerase II. The hydrolysis of ATPs will reset the enzyme and re-anneal the double strand break DNA when will still bound with the G segment. The binding of etoposide to topoisomerase II and DNA cleavage complex will stabilize the complex and prevent from re-annealing the DNA. The permanent double strand DNA breakage will cause recombination repair mechanism or cell apoptosis. (Modified from Biochemistry, 5th edition, Jeremy M. Berg et al., 2002). 48.

(60) Fig. 10 The role of Rac, Rho, and CDC42 in regulation of actin construction and cell migration. A. The signaling from receptor tyrosine kinase (RTKs) could activate its down-stream molecular signaling such as the activation of small G-proteins Rac, Rho, and CDC42. The activation of these small G-proteins will activate the re-construction of actin cytoskeleton as show in B. The activation of Rho will decrease the actin stress fibers and the focal adhesion of the cell, activation of Rac and CDC42 will activate the construction of lamellipodium and filopodium through activation of the actin construction center protein ARP2/3 complex. The formation of lamellipodium and filopodium structure could lead cell to the migrate motion according to the direction of actin filament construction. (Modified from www.biocarta.com, and Cells, Benjamin Lewin et al., 2007). 49.

(61) Fig. 11 The direction of lamellipodium construction will lead the way to the cell migration. After the signaling from receptor tyrosine kinase (RTKs), the actin construction will be activated through multiple signaling pathway including Rac, Rho, and CDC42. The activation of down-stream protein WASP or WAVE1-3 could activation of ARP2/3 protein complex for the construction center of actin filament. (From www.biocarta.com ). 50.

(62) Fig. 12 The IC50 cytotoxicity test of normal lung MRC5 and lung cancer cells including CL1-0, CL1-5, and H1299. 2.5 x 106 cells were seeding in each dish, and treated with different concentration (0.5, 1, 3, 5 μM) of Ching001 or podophyllotoxin for 48hr. DMSO was served as a solvent control. After PBS wash and trypsinization of the cell, the survival of the cell lines was counted under microscope by trypan blue staining. A. The IC50 under Ching001 treatment for 48hr of each cell line: CL1-0 = 1.99 μM, CL1-5 = 1.90 μM, A549 = 1.21 μM, H1299 = 2.58 μM, and MRC5 = 8.27 μM. B. The IC50 of cell lines under treatment of podophyllotoxin for 48hr. CL1-0 = 0.28 μM, CL1-5 = 0.006 μM, H1299= 1.09 μM, and MRC5 = 4.23 μM.. 51.

(63) Fig. 13 FLOW cytometry analysis of dose-dependent and time-dependent cell cycle distribution of lung cancer cell lines A549, CL1-0, CL1-5, H1299 treated with different concentration (0.5 μΜ and 1 μM) of Ching001 for 24hr and 48hr by PI staining. DMSO was served as a solvent control. After 0.5 μM Ching001 treatment, the sub-G1, an indicator of apoptosis (as indicated by red arrows) was detected in CL1-0, CL1-5, and H1299 cells. CL1-5 and H1299 also showed arresting at G2/M (as indicated by blue arrows). Under 1 μM concentration treatment of Ching001 for 24hr, it induced apoptosis of all four lung cancer cell lines. For all cell lines, the apoptosis became more apparent at 48 hr of treatment. P1 represents the sub-G1and apoptosis fractions; P2 represents the G1/S phase of cell cycle; P3 represents the G2/M phase of the cell cycle. 52.

(64) Fig. 14 A. The DNA ladder assay. 2.5 x 106 cells were seeding in each 10cm culture dish with DMSO, 3 μM Ching001, or 5 μM Ching001 treatment for 48hr. The data showed that the apoptosis specific character of DNA fragmentation was induced after Ching001 treatment. B. The Western blot of anti-apoptosis marker Bcl-2 showed that Bcl-2 decreased in both A549 and H1299 lung cancer cell lines. C. The Western blot of apoptosis marker caspase-9 showed that the pro-caspase-9 decreased in all four lung cancer cell lines, and the cleaved active form caspase-9 increased as an indication of apoptosis. 53.