由Lasiodiplodia theobromae 引起之百香果果腐病
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(2) 334. 台灣農業研究 第 68 卷 第 4 期. 菌 核 病， 以 及 Phytophthora nicotianae 引 起 的 疫 病。 另 外， 亦 有 由 Meloidogyne incongita 引起的根瘤線蟲 (Hsu et al. 2002)。而在 2017 年 7 月中旬，於南投縣埔里鎮大坪頂之腐爛果 實病害樣品上，發現在罹病果實表皮上產生黑 色點狀之柄子殼 (pycnidia)，經鏡檢時發現疑 似 Lasiodiplodia 病 原 之 孢 子。 爾 後， 將 罹 病 組織經病原分離純化、鏡檢病原形態特徵及依 柯霍氏法則 (Koch’s postulates) 進行病原性測 定 後， 確 認 為 由 Lasiodiplodia theobromae 引 起之百香果果腐病 (fruit rot)，亦可稱黑腐病 (black rot)。本文即為此試驗報告。. 材料與方法 將田間罹患果腐病之百香果果實攜回實驗 室，以解剖刀切下罹病病斑之病健部組織，以 0.5% 次氯酸鈉 (NaClO) 漂洗消毒 30 s，繼而 以 70% 酒 精 消 毒 30 s， 最 後 再 以 無 菌 水 漂 洗 2 次。 自 然 風 乾 後， 置 於 以 2% (w/v) 水 瓊 脂 (water agar; WA) 平板上，待病組織長出菌絲 後，以解剖刀切取菌絲尖端移到馬鈴薯葡萄糖 培養基 (potato dextrose agar; PDA) 上。經純 化後，待其產孢再進行單孢分離，並將分離株 (Un-140, Un-143) 保 存 於 PDA 斜 面 培 養 基 及 無菌水中，置於 10℃備用。 將 Un-140 及 Un-143 菌 株 培 養 於 PDA 培 養基上，觀察菌落等外觀形態。並將分離株培 養於表面置有木麻黃針葉之 2% WA 培養基上 (Ni et al. 2011)，以 24℃定溫培養約 7 d，待其產孢 後，以滅菌之針頭挑取分生孢子置於載玻片上。 以 光 學 顯 微 鏡 (differential interference contrast; DIC, LEICA DM 2500, Wetzlar, Germany) 進行 孢子形態觀察，並以 NIS-Elements BR 3.0 軟 體 (Nikon, Tokyo, Japan) 測 量 50 個 以 上 分 生 孢 子 之 長 度 及 寬 度。 分 子 鑑 定 方 面， 則 是 將 分 離 菌 株 單 孢 培 養 於 PDA 培 養 基 平 板 上 7 d 後， 委 託 源 資 國 際 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 (Tri-I Biotech Inc., Taichung, Taiwan) 進行聚 合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction; PCR) 與 DNA 定序，使用之引子對為 ITS4 及 ITS5、 EF1-688F 及 EF1-1251R (White et al. 1990; Alves et al. 2008)，分別增幅 internal transcribed. spacer (ITS) 及 translation elongation factor 1-alpha (TEF-1α) 序 列 進 行 核 酸 定 序。 定 序 後 序 列 在 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 資料庫中進行序列分析比對，並將該 序列登錄於 NCBI 基因資料庫。 將分離株培養於含滅菌後木麻黃針葉之 2% WA 平 板 上， 置 於 24 ℃、12 h 光 照 下 培 養 7 d 後，以無菌水洗下培養皿內之分生孢子 (conidia)，並利用血球計數器 (hemacytometer, Bright-Line, Horsham, PA) 測定孢子濃度。再 以無菌水製成孢子懸浮液 (10 5 spores mL -1) ， 供接種試驗用。接種方法分別為離體 (摘下來) 及植體上之未熟果與熟果接種方式：(1) 離體 之未熟果、熟果接種：購買自南投縣埔里鎮大 坪頂之「台農 1 號」果實，選取未熟果及熟果 果 實 後， 先 以 75% 酒 精 進 行 果 實 表 皮 消 毒。 接種模式分為無傷口及有傷口處理，有傷口部 分 以 無 菌 之 針 頭 在 接 種 處 上 針 刺 製 造 傷 口。 以微量滴管吸取 Un-140 分離株之孢子懸浮液 10 μL (約 1,000 個 孢 子)， 分 別 滴 於 未 熟 果 及 熟 果 果 實 之 無 傷 口 及 有 傷 口 接 種 處。 再 滴 上 10 μL 已 降 溫 但 尚 未 凝 固 之 2% WA， 以 便 將 孢子懸浮液固定於接種處，每顆果實僅做一個 接種點。接種後果實置於塑膠盒中保濕，並放 置於室溫下 (25–30℃)，逐日觀察並記錄病徵 出現之情形。每處理 10 重覆，本試驗重複進 行 2 次。(2) 植體上未熟果、熟果接種：於行 政院農業委員會農業試驗所溫室內種植之「台 農 1 號」百香果進行植體果實接種試驗，接種 模式分為無傷口及有傷口處理。接種方式如上 述， 並 以 透 氣 膠 帶 將 WA 固 定 於 果 實 表 面， 接種後果實隨即進行套袋，以避免後續自然狀 態下其他病原之感染，每處理 10 重覆。接種 後每週觀察及記錄接種點之果腐病發生情形， 本試驗重複進行 2 次。所有對照組均接種無菌 水。接種果實發病後，將罹病組織切下以 0.5% NaClO 溶 液 漂 洗 消 毒 後， 再 以 70% 酒 精 消 毒 約 30 s，最後以無菌水漂洗 2 次。自然風乾後， 再放置於 2% WA 培養基上，以確定罹病果實 是否為原接種病原菌所引起，以完成柯霍氏法 則。.
(3) 335. 百香果果腐病. 結果與討論 本研究於 2017 年 7 月中旬於南投縣埔里 鎮大坪頂之「台農 1 號」百香果之罹病果實上， 觀察到果實外觀呈現腐爛、凹陷狀、出現綠黑 色至黑化塊斑，病斑邊緣為淡黃褐色，但無汁 液流出，無果香且果皮軟。後期病斑乾扁呈黑 灰色 (圖 1A)，且在病斑上形成黑色點狀之柄 子殼 (圖 1B)。若潮濕環境下，在罹病果皮上 長出灰黑色黴狀物，造成果實快速腐爛。縱剖 果實可見果肉內呈現黑灰色，果肉依附之膜易 與果皮分離，嚴重是果肉內長出灰白色菌絲 (圖 1C–E)。 百 香 果 果 腐 病 菌 培 養 於 PDA 培 養 基 上， 經 24℃黑暗培養 4 d 後，其菌落呈現灰白色，. (A). (C). 後 期 顏 色 漸 深 至 灰 黑 色， 且 有 濃 密 之 氣 生 菌 絲 (圖 2A)。由柄子殼產生之分生孢子，初期 呈 卵 圓 形、 透 明 無 色 單 室 且 細 胞 壁 厚， 為 未 成 熟 孢 子 (immature conidia) (圖 2B)； 後 期 轉 為 褐 色、 卵 圓 形， 中 間 有 隔， 孢 子 具 有 縱 紋，為成熟孢子 (mature conidia) (圖 2C)。本 研究所分離菌株之未成熟孢子及成熟孢子，其大 小分別為長寬 (24.81 ± 1.30) μm × (13.39 ± 0.73) μm 及 (22.58 ± 1.58) μm × (12.59 ± 0.89) μm， 長 寬 比 平 均 分 為 1.85 μm 及 1.79 μm。 為 進 一 步 確認菌株種的鑑定，將兩分離株 (Un-140、Un143) 之 ITS (Accession No. 分 別 為 MG814039 及 MG814040) 及 TEF-1α (MN114119 及 MN114120) 與 NCBI 基 因 資 料 庫 進 行 分 析 比 對， 發 現 供 試菌株均與 GenBank 上所登錄 Lyc8 strain 之. (B). (D). (E). 圖 1. 百香果果腐病病徵。(A) 黑色塊斑而外圍有黃暈及大面積的壞疽，(B) 於罹病果實表皮上產生點狀之黑 色柄子殼 (pycnidia) 構造，(C、D) 罹病果實內部果肉黑化，並常有 (E) 灰色菌絲產生。 Fig. 1. Fruit rot symptoms of passion fruit. (A) Black spot with yellow halo and necrosis, (B) dark pycnidia on infected fruit surface, and (C, D) blackened flesh inside the infected fruit with (E) an abundance of gray mycelia..
(4) 336. 台灣農業研究 第 68 卷 第 4 期. (A). (B). (C). 圖 2. 百香果果腐病菌之菌落及分生孢子形態。(A) 百香果果腐病菌於 PDA 培養基上於 24℃培養 4 d 後的菌 落形態；(B) 透明未成熟孢子；(C) 內具橫格及縱格之褐色成熟孢子。標尺 = 10 μm。 Fig. 2. Colony and conidial morphology of Lasiodiplodia theobromae. (A) Colony of L. theobromae on PDA at 24℃ after cultured for 4 d; (B) hyaline immature conidia; and (C) brown mature conidia with septa. Bars denote 10 μm.. ITS (KX013185) 及 CMM 0499 strain 之 TEF1α (MH632293) 之序列具有 100% 之相同度。 為 了 進 一 步 測 定 其 病 原 性， 本 研 究 將 L. theobromae Un-140 分離株之孢子懸浮液分別 接種於離體及植體上之未熟果與熟果。結果顯 示， 分 離 株 以 孢 子 懸 浮 液 接 種 於 以 針 刺 製 造 傷口處理之離體之未熟果，接種 3 d 後，果實 果 色 開 始 慢 慢 轉 為 淡 紫 色， 但 還 未 見 病 徵 產 生。接種 7 d 後，未熟果之青綠色果實已轉色 為熟果實果色，在果實接種點開始出現黑褐色 病斑，以手指按壓果實，果皮軟化腐爛現象， 剖開果實可見果皮內側產生灰黑色病斑。而在 離體之熟果有傷口處理下，於接種 2 d 後，果 實於接種點開始產生水浸狀病斑。爾後病斑逐 日擴大，約 7 d 整個果實完全腐爛，剖開果實 可見果皮內側產生一圈灰黑色病斑 (圖 3)。另 外，於植體上接種方式下，L. theobromae Un140 以孢子懸浮液接種於以針刺製造傷口處理 之未熟果與熟果果實上，分別於接種後約 7–14 d 及 5–7 d 果實逐漸掉落。其中，發現未熟果 果實逐漸轉色，但未觀察到病徵產生。將掉落 果實採收，置於室溫約 2 wk 後，不僅未熟果. 轉色為熟果或是原本熟果之傷口處理下，皆可 在果實上接種點開始出現水浸狀、果皮軟化現 象，黑灰色病斑出現。爾後病斑逐漸擴大，果 實表皮會皺縮，導致果實完全腐爛。縱剖罹病 果實，可見果皮內側產生明顯灰黑色、毛絨狀 菌絲，果肉與種子明顯分離、不飽滿，聞起來 略 帶 酸 腐 味 道 (圖 4A–4B、 圖 4E–4F)。 對 照 組則是以無菌水處理之未熟果及熟果上，均未 見 病 斑 產 生 (圖 4C–4D、 圖 4G–4H)。 另 外， 無傷口處理下之離體或植體果實，皆未觀察到 果 實 上 有 病 斑 產 生。 之 後 再 進 行 罹 病 組 織 分 離，結果顯示所得菌株與接種病原菌菌株，其 形態特徵皆相同，並完成柯霍氏法則，證實本 研究所分離之 L. theobromae 對百香果果實具 有病原性。 L. theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. 有性 世 代 為 Botryosphaeria rhodina (Cooke) Arx.， 其寄主植物種類繁多，可感染熱帶及亞熱帶之 木 本 植 物 與 果 樹， 如 酪 梨、 香 蕉、 櫻 桃、 腰 果、 柑 橘、 木 瓜、 番 石 榴、 椰 子 樹 等 (Ismail et al. 2012; Marquest et al. 2013)， 所 造 成 之 病 徵 有 頸 腐 (collar rot)、 梢 枯 (die-back)、 蒂.
(5) 337. 百香果果腐病. (A). (C). CK. Un-140. (B). CK. Un-140. (D). CK. Un-140. CK. Un-140. 圖 3. 百香果果腐病菌 (Lasiodiplodia theobromae Un-140) 分別接種於離體 (摘離植株) 的 (A、B) 未熟及 (C、 D) 熟果上所呈現之病徵。 Fig. 3. Symptoms of light brown or dark brown lesions on fruit after inoculating with conidia suspension of Lasiodiplodia theobromae Un-140 through wounds on detached (A, B) immature fruit and (C, D) mature fruits.. 腐病 (stem end rot)、果腐、根腐 (root rot) 及 流膠 (gummosis) 等 (Punithalingam 1976)。在 台灣，已知 L. theobromae 是木瓜蒂腐病、酪 梨蒂腐病、檬果果腐病、香蕉黑腐病、番石榴 果腐病之病原菌 (Hsu et al. 2002; Wang et al. 2007; Ni et al. 2011; Ni et al. 2012)，本研究 顯示亦為百香果果腐病之病原菌。另外，本研 究將 L. theobromae 之孢子懸浮液接種於離體 或植體之未成熟及熟果實上，結果得知在果實 成熟後，有傷口處理下其分生孢子接種點確實 造成黑綠色病斑、果實腐爛凹陷狀之發生；然 而，在無傷口處理下，雖然有分生孢子的存在 仍無法感染熟果實，顯示傷口是造成果實發生 果腐病主要原因。因此，若要降低田間果腐病 病害發生，於田間管理作業及採收運輸過程， 應避免傷口的產生是防治本病害發生之重要策 略之一。. 綜合言之，L. theobromae 會造成百香果果 實果腐病發生，傷口是造成果實發生果腐病主 要原因，應避免在田間管理作業及採收運輸過 程造成果實傷口產生。未來可進一步篩選適當 的防治藥劑，並進行百香果果腐病原之流行病 學研究，以期降低本病害對台灣百香果產業之 威脅性。. 誌謝 本研究工作承行政院農業委員會農業試驗 所農場管理組吳錫家副研究員提供「台農 1 號」 百香果果實給予接種試驗，張立詳小姐與曾淑 瓊小姐協助試驗進行，特此致謝。.
(6) 338. 台灣農業研究 第 68 卷 第 4 期. (A). (B). (C). (D). (E). (F). (G). (H). 圖 4. 百香果果腐病菌 (Lasiodiplodia theobromae Un-140) 分別接種於植體上 (A、B) 未熟果及 (E、F) 熟果果 實上之病徵表現，以無菌水接種為對照組之 (C、D) 未熟果及 (G、H) 熟果。 Fig. 4. Fruit rot symptoms appeared on fruits which still grew on plants after inoculation of Lasiodiplodia theobromae Un-140. Symptoms of light-brown, dark brown or grey to black lesions on (A, B) immature fruit and (E, F) mature fruit after inoculation with conidia suspension of L. theobromae with wound treatment. Treatments inoculated with water on (C, D) immature fruit with (G, H) mature fruit as control..
(7) 百香果果腐病. 引用文獻 Alves, A., P. W. Crous, A. Correia, and A. J. L. Phillips. 2008. Morphological and molecular data reveal cryptic speciation in Lasiodiplodia theobromae. Fungal Divers. 28:1–13. Hsu, S. T., T. T. Chang, C. A. Chang, J. L. Tsai, and T. T. Tsay. 2002. List of Plant Diseases in Taiwan. 4th ed. Taiwan Phytopathology Society. Taichung, Taiwan. 386 pp. (in Chinese) Ismail, A. M., G. Cirvilleri, G. Polizzi, P. W. Crous, J. Z. Groenewald, and L. Lombard. 2012. Lasiodiplodia species associated with dieback disease of mango (Mangifera indica) in Egypt. Australas. Plant Pathol. 41:649–660. Marquest, M. W., N. B. Lima, M. A. de Morais Jr, M. A. G. Barbosa, B. O. Souza, S. J. Michereff, A. J. L. Phillips, and M. P. S. Câmara. 2013. Species of Lasiodiplodia associated with mango in Brazil. Fungal Divers. 61:181–193. Ni, H. F., M. F. Chuang, S. L. Hsu, S. Y. Lai, and H. R.. 339. Yang. 2011. Survey of Botryosphaeria spp., causal agents of postharvest disease of avocado, in Taiwan. J. Taiwan Agric. Res. 60:157–166. (in Chinese with English abstract) Ni, H. F., H. R. Yang, R. S. Chen, R. F. Liou, and T. H. Hung. 2012. New Botryosphaeriaceae fruit rot of mango in Taiwan: Identification and pathogenicity. Bot. Stud. 53:467–478. Punithalingam, E. 1976. Botryodiplodia theobromae. CMI Descr. Pathog. Fungi Bact. 519:1–2. Wang, H. L., P. H. Chen, H. F. Ni, and R. S. Chen. 2007. Physiological characterization and screen of control chemicals for Lasiodiplodia theobromae of papaya. Plant Pathol. Bull. 16:71–77. White, T. J., T. Bruns, S. Lee, and J. Taylor.1990. Amplification and direct sequencing of Fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. p.315–322. in: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M.A., D. H. Gelfand, J. J. Snirsky, and T. J. White, eds.) Academic Press. San Diego, CA. 482 pp..
(8) 340. 台灣農業研究 第 68 卷 第 4 期. Fruit Rot of Passion Fruit Caused by Lasiodiplodia theobromae in Taiwan Chiao-Wen Huang1, Yu-Ting Chang2, Je-Yin Chao2, and Jin-Hsing Huang3,*. Abstract Huang, C. W., Y. T. Chang, J. Y. Chao, and J. H. Huang. 2019. Fruit rot of passion fruit caused by Lasiodiplodia theobromae in Taiwan. J. Taiwan Agric. Res. 68(4):333–340.. A new disease caused by fruit rot of passion fruit (Passiflora edulis) was found in major passion fruit production areas at Puli Township, Nantou County of Taiwan in 2017. The infected fruits showed dark green to black patches with yellow halo. The lesions usually enlarged and joined into a large black and sunken patch with the appearance of black dots (the pycnidia of the pathogen). The flesh inside was blackened with soar flavor and easy to produce black gray hyphae. A kind of fungus was consistently isolated from the diseased tissue. The mycelium of the fungus grew rapidly on potato dextrose agar and formed a grayish-black fluffy colony with dense aerial hyphae at 24℃ after being cultured for 4 d. The conidia of the fungus were initially oval, hyaline, unicellular and had thick cell wall, but days later showed dark-brown color and developed one septum with longitudinal lines. The causative fungus was identified as Lasiodiplodia theobromae based on morphological characteristics and internal transcribed spacer (ITS) rDNA sequence blasting on National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank database. The identified L. theobromae could cause similar symptoms on the fruits on trees and the detached fruits by inoculating the tested fruits with conidia suspension through wound treatment, and the same pathogen could be re-isolated from the diseased fruit tissue to fulfill the Koch’s rules. Immature and mature passion fruit could show disease symptoms when inoculated with L. theobromae through wound treatment but no symptom was found to those without wound treatment. This study is the first report about fruit rot of passion fruit caused by L. theobromae in Taiwan. Key words: Passion fruit, Fruit rot, Lasiodiplodia theobromae.. Received: April 9, 2019; Accepted: July 16, 2019. * Corresponding author, e-mail: [email protected] 1 Assistant Research Fellow, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC. 2 Summer Internship Students, Department of Plant Pathology, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan, ROC. 3 Associate Research Fellow, Plant Pathology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, Taichung, Taiwan, ROC..
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