行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
※ 計畫中文名稱：利用雙叉桿菌生產半乳寡醣之研究 ※
※ 計畫英文名稱：Production of galacto-oligosaccharides ※
※ by bifidobacteria ※
※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※※
計畫類別：個別型計畫
計畫編號：NSC89-2313-B002-093
執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日
計畫主持人：游 若 萩 教 授
計畫參與人員：于 佳 茜 碩士班研究生
執行單位：國立臺灣大學食品科技研究所
中 華 民 國 八十九 年 十 月 三十一 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫中文名稱：利用雙叉桿菌生產半乳寡醣之研究
計畫英文名稱：Study on pr oduction of galacto-oligosacchar ides by
bifidobacter ia
計畫編號：NSC89-2313-B002-093
執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日
主持人：游若萩教授 國立臺灣大學食品科技研究所
電子信箱：
yurc@ccms.ntu.edu.tw 一、中文摘要 本 研 究 利 用 萃 取 人 體 腸 駐 型 益 生 菌 （probiotics）-雙叉桿菌（bifidobacteria）之 半乳醣 ，以乳醣為原料進行半乳寡醣的 生 產 研 究 。 結 果 顯 示 利 用 超 音 波 破 碎 含 Triton X-100的懸浮菌液（50mg/ ml），可將 所 選 用 的 五 株 腸 駐 型 雙 叉 桿 菌 Bifidobacterium adolescentis CCRC 14606、B. bifidum CCRC 14615 、 B. infantis CCRC 15416、B. infantis CCRC 14633、B. longum CCRC 14634中之半乳醣 萃取出來。利 用萃取出的粗酵素液進行轉醣反應，結果以 CCRC 14634之半乳醣 表現最好，約可 得到5％的半乳寡醣，主要產物為三醣。再 以粗酵素液進行轉醣反應條件的探討，發現 CCRC 14634之酵素在pH 4-6間活性都很穩 定，最適轉醣反應pH值為6.0；而溫度在25-55℃間酵素亦很穩定，最適轉醣反應溫度為 45℃；當反應5小時後可得最大寡醣產量， 時間再延長寡醣將被水解。而在基質濃度試 驗中，得知CCRC 14634之轉醣反應Km值約 為1.3 M。在反應液中添加二價金屬離子並 不能促進轉醣反應；添加EDTA及Cu2＋ 、Zn2 ＋ 等會使酵素失活。以CCRC 14634之半乳醣 於pH 6.0的磷酸緩衝液中，添加1.0M乳 糖溶液，於50℃下反應5小時，進行半乳寡 醣之大量製備，並將製備出的半乳寡醣進行 菌體利用性試驗，發現自製之半乳寡醣可促 進雙叉桿菌（B. longum CCRC 14634）生 長 ； 但 對 產 氣 莢 膜 桿 菌 (Clostridium perfringenes CCRC 10913)之生長，也有促進 作用。 關鍵詞：雙叉桿菌、半乳醣 、水 解反應、轉醣反應、半乳寡醣 AbstractIn order to produce galacto-oligosaccha-rides which is useful for probiotics, this study was conducted to study the characters ofβ-galactosidase from bifidobacteria and use lactose substrate to produce galacto-oligo-saccharides. Beta-galactosidase from Bifido-bacterium adolescentis CCRC 14606 、 B. bifidum CCRC 14615 、 B. infantis CCRC
15416、B. infantis CCRC 14633、B. longum
CCRC 14634 were extracted by ultrasonic treatment in the presence of Triton X-100. Crude enzyme of CCRC 14634 was found to be the most efficient producer of galacto-oligosaccharides. The yield was about 5% of total sugar and trioligo-saccharide was main product. Crude β -galactosidase was stable over pH 4-6, with maximal transgalactosylated activity at pH 6. The optimal temperature for transgalactosylation was 45℃. The maximum production was obtained after 5 hours of reaction. In the transgalactosylated reaction, the Km value of crude enzyme of CCRC 14634 was 1.3 M for lactose. EDTA, copper, cobalt, magnesium, stannium and zinc could not improve transgalactosylation. Moreover, EDTA, copper, and zinc inhibited the enzyme activity. Finally, crude β -galactosidase of CCRC 14634 and suitable reaction conditions was used to prepare galacto-oligosaccharides. The prepared galacto-oligosaccharides was found to be the best carbon source for Bifidobacterium longum CCRC 14634 when compared to other
commercial galacto-oligosaccharides, lactose, and glucose. However, the prepared galacto-oligosaccharides also stimulated the growth of
Clostridium perfringenes CCRC 10913.
Keywords: bifidobacteria,
β-galac-tosidase, hydrolysis, transgalactosylation, galacto-oligosaccharides. 二、緣由與目的 半乳寡醣是存在於母乳中的天然益菌 助生質，可以促進人體腸道內有益菌如雙叉 桿菌、乳酸桿菌的生長，而增進人體對環境 有害因子的抵抗力，維持正常生理功能的運 作。同時具有類似膳食纖維的效果與改善液 體食物流變性質，現已被視為重要之保健性 食品與加工適性兼備的食品添加物。 目前半乳寡醣的生產，都是利用微生物 所產生之半乳醣 （β-galactosidase）進 行酵素性的合成反應，同時藉由適當反應條 件的控制，可以增加半乳寡醣之產量。在 O’Brien 和 Mitsuoka〔1〕、Roy 等〔2〕的 研究中指出腸內益生菌雙叉桿菌亦具有半乳 醣 的活性，可以進行半乳寡醣基之轉移 反應。研究指出雙叉桿菌對於半乳寡醣利用 性是以三醣為最高，其中又以含有乳糖結構 的三醣較易被雙叉桿菌利用，亦即β-4’-galactosyllactose〔3-4〕。 本研究期望自人體內所分離出的腸駐 型雙叉桿菌中找到適合生產半乳寡醣的菌 株，探討其β-galactosidase 的特性；並用以 合成半乳寡醣，供人體內益生菌利用，促進 身體健康。 三、結果與討論 一. 不同雙叉桿菌菌株之半乳醣 進行水 解與轉醣反應之探討 半乳醣 可以將乳糖合成半乳寡 醣最早是由 Wallenfels〔5〕證實。經研究發 現其可同時進行轉醣與水解反應活性，當控 制反應條件於高乳糖及高溫下會趨向轉醣反 應的發生〔6〕。而在 O’Brien 及 Mitsuoka 〔1〕和 Smart 等〔7〕的報告指出雙叉桿菌 中多具有半乳醣 的酵素活性。本實驗中 選 用 Bifidobacterium adolescentis CCRC 14606、B. bifidum CCRC 14615、B. infantis CCRC 15416、B. infantis CCRC 14633、B. longum CCRC 14634 等五株雙叉桿菌，進行 半乳醣 的篩選。 1. 半乳醣 之製備 取培養達靜止期初期的菌液，菌數在 2-5×1011 CFU / ml，利用超音波破碎，實驗 組為添加有 0.2％的 Triton X-100 的磷酸鹽 緩衝液，以弱化細胞壁，利用超音波破碎細 胞壁 5 分鐘；而對照組則為僅使用含 0.2％ 的 Triton X-100 的磷酸鹽緩衝液來弱化細胞 壁。處理完後，利用離心方式去除細胞或殘 骸得到粗萃取液，以 oNPG 進行活性分析。 所得結果顯示破碎 5 分鐘者 oNPG 水解活性 最高，約高於對照組 2.5 倍。 2.半乳醣 對 oNPG 及乳糖基質活性之探 討 Dumortier 等〔8〕指出，B. bifidum 之 半乳醣 在 pH 4.5 時轉醣反應活性最 高，而 pH 6.5 時水解反應活性最高。為了 降低水解活性、提高轉醣活性，建議使用 pH 4.3 及 45℃進行寡醣之合成。本實驗中 同時以另一種乳糖衍生物 oNPG 來進行快速 的水解活性分析，oNPG 可被半乳醣 水 解而形成黃色之 o-nitrophenol，可於 405nm 吸 光 下 測 定 。 在 水 解 活 性 分 析 上 ， 若 以 oNPG 基質呈色法測知，所得酵素活性定義 為在 37℃、pH 6.5 反應條件下每分鐘分解 1 m mol oNPG 所需之酵素量。結果以 CCRC 14606 在水解 oNPG 是明顯最高者。而在乳 糖基質之反應，包括寡醣合成及水解方面， 轉醣與水解活性的定義為 45℃、pH 4.3 下 每小時合成 1μmol 寡醣或水解 1μmol 乳糖 所需之酵素量。結果顯示兩者的表現上都以 CCRC 14634 最高。 另外，在 HPLC 結果中也可以看出， 所得到的寡醣幾乎都是三醣，僅在酵素活性 較高的 CCRC 14634 中偶有極微量的四醣產 生。Dumortier 等〔8〕以 B. bifidum 所進行 之實驗中可以產生三醣-五醣的寡醣，因此 推測本實驗中此種情形有可能是因為酵素活 性過低所致，使得三醣濃度不高，故其再和 酵素複合體發生有效碰撞的機會極低，因此 不易產生四醣。 二.影響半乳醣 進行轉醣反應之因素
1.反應時間 依照 Dumortier 等〔8〕的反應條件， 以 pH 4.3、45℃、0.5 M 乳糖溶液進行反應 並 定 時 取 樣 。 結 果 顯 示 CCRC 14606 及 CCRC 14634 之半乳醣 在反應 4 小時內 會有最大量的寡醣生成，可產生三醣以上寡 醣 約 5 ％ 左 右 。 而 CCRC 15416 、 CCRC 14633 則在反應的 6 小時有最大量寡醣生 成，佔總醣量的 4％左右。CCRC 14615 約 反應 10 小時才得到最大寡醣生成量 4％。 以寡醣生成後的穩定性來說，CCRC 14634 最差，大約 15 小時時即幾乎測不到寡醣含 量的；而 14606 在 30 小時後測不到寡醣存 在。 各試驗菌株反應液中單糖、乳糖、寡 醣的生成情形，在 CCRC 14606 及 CCRC 14634 有較相似的情形，乳糖快速被反應， 大約 10 小時時分別只剩下 20％及 10％左 右；在此同時單糖會不斷累積，而 CCRC 14634 又比 CCRC 14606 分解速度更快。 Cruz 等 〔 9 〕 利 用 Penicillium simplicissium 之半乳醣 試驗也有相同的 現象，可能是因酵素會同時進行寡醣的合成 與雙糖的水解，當水解量達到某一個程度 時，過多的單糖累積，會刺激寡醣分子開始 被水解，直到均為單糖分子，且此種水解會 由高分子往低分子進行，也就是說三醣會比 乳糖水解更快。 2.反應 pH 值 本試驗探討β-galactosidase 在 pH3-8 之 活性，結果顯示五株菌在 pH 3 以下或 pH 8 以上都不具任何活性；主要活性在 pH 4-6 之間。CCRC 14606 及 CCRC 15416 之β-galactosidase，在 pH 4-6 間之活性差異不 大 。 CCRC 14615 及 CCRC 14633 之 β -galactosidase 不論在轉醣活性或水解活性的 表現上，都是在 pH 6 時最大。CCRC 14634 的轉醣活性在 pH 4-6 間差不多，但水解反 應活性卻在 pH 6 時明顯較高。而 CCRC 14634 在寡醣合成活性上，不論反應液中 pH 值為何，只要在酵素活性表現範圍內皆 優於其它菌株。 3.反應溫度 五株菌的之β-galactosidase 轉醣反應活 性，皆約在 45℃時有最高的活性。而以 37 ℃時轉醣活性表現最低，這種現象和之前文 獻中所推測的寡醣產生機制，有可能是菌體 為了避免環境所帶來的衝擊才產生的可互相 映證，像合成寡醣可以降低高乳糖所造成之 高滲透壓的作用或者可以在高溫下有保護菌 體的效果〔10〕，所以菌體才會在生長最適 溫度時轉醣活性最低。 4.基質濃度 利用不同的乳糖濃度進行試驗，可以發 現當乳糖濃度過低時，約 0.2M 以下，在五 株試驗菌株酵素活性的表現上都只有水解反 應的發生。而當乳糖濃度高於 0.2M 後，轉 醣反應活性開始快速增加，CCRC 14606、 CCRC 14615、CCRC 15416 及 CCRC 14633 在 0.4M 乳糖濃度以上後轉醣反應增加趨勢 漸趨緩和；而 CCRC 14634 在轉醣活性表現 上則明顯較佳，雖然 0.4M 以上活性不再呈 直 線 上 升 ， 但 仍 有 明 顯 增 加 的 趨 勢 直 到 1.0M 以後才漸趨穩定。 根據 Michaelis-Menten 之酵素動力學顯 示，Km 值是為達到一半最高催化速率時所 需之基質濃度，故 Km 可視為使用酵素基質 的大約濃度。在各試驗菌株中 CCRC 14606 之 Km 為 570 mM，CCRC 15416 為 480 mM ， CCRC 14633 為 440 mM ， CCRC 14634 為 1360 mM，此和文獻中記錄相近 〔8〕。另外所得之 Vmax 也顯示了 CCRC 14634 之最大反應速率最高。 5.金屬離子及 EDTA 金屬離子的存在會對酵素水解與轉醣活 性的表現有所影響的。本實驗中選用Ca2+、 Cu2+、Co2+、Mg2+、Sn2+、Zn2+等不同氯化 鹽及EDTA，各2.5 mM添加於反應液中，結 果 顯 示 在 添 加 CuCl2、 ZnCl2、 EDTA 等 三 組，對五株試驗菌株的兩種酵素活性都呈現 完全之抑制。Ca離子的添加對CCRC 14615 的 兩 種 活 性 表 現 均 為 抑 制 作 用； 對 CCRC 14606及CCRC 14633的水解活性略增，但對 於轉醣反應活性則略降；對CCRC 14634則 相反。添加CoCl2的效果，在五株試驗菌的 轉醣活性上都是呈現抑制的效果；但對於水 解活性上則CCRC 14606、CCRC 14615、 CCRC 15416 呈 現 小 幅 下 降 ， 但 CCRC 14633、CCRC 14634則小幅增加，幾乎可視 作 沒 有 影 響 。 添 加 MgCl2時 ， 對 於 CCRC
14606、CCRC 15416、CCRC 14633等的轉 醣活性是抑制作用，但對於CCRC 14615、 CCRC 14634則不影響；分析水解活性，對 CCRC 14606、CCRC 14615、CCRC 1434影 響不大，對CCRC 15416有明顯抑制作用， 對 於 CCRC 14633 則 有 促 進 效 果 。 而 添 加 SnCl2則對試驗菌的兩種酵素活性都是抑制 的效果，可達50％以上，僅在CCRC 14634 菌株之轉醣活性是維持略增的。因此，對 CCRC 14606、14615、15416、14633等菌來 說添加實驗中所使用的金屬離子，效果均不 顯著，因此不建議在反應液中添加額外的二 價金屬離子，而僅以含鈉的緩衝液進行反 應。實驗中加入EDTA將反應液中之金屬離 子去除，會使酵素失活，推測此酵素反應是 需要有金屬離子作cofactor才能作用，且以 添加鈉離子較佳，其它二價離子的作用則在 不 同 菌 株 有 不 同 表 現 。 Becker 及 Evans 〔11〕認為半乳醣 作用需要單價陽離子 乃因其可誘導酵素結構上構形的改變，而可 是酵素作用，且鈉離子因為分子直徑小更能 與酵素緊密結合而優於K+。 三.半乳寡醣對於雙叉桿菌與產氣莢膜桿菌 的影響 本實驗以 B. longum CCRC 14634 的半 乳醣 酵素粗萃液，於 1.0M 乳糖溶液中 進行大量製備的反應，反應條件為 pH6.0、 50℃之磷酸緩衝液進行之。所產生之半乳寡 醣 稀 釋 成 5 ％ 的 半 乳 寡 醣 液 後 添 加 於 modified Reinforced Clostridial medium 中， 和商品化半乳寡醣、葡萄糖等一起觀察對雙 叉桿菌、產氣莢膜桿菌生長促進的作用。 結果發現雙叉桿菌在添加半乳寡醣的培 養基中生長確實較添加其他碳源者為快，大 約 12 小時即可獲最大之菌數。在葡萄糖培 養基中則要 15 小時，乳糖更慢，則要 18 小 時。 產氣莢膜桿菌在乳糖之培養基生長最 好，自製半乳寡醣次之，較差的則是商品化 半乳寡醣及葡萄糖。在添加有乳糖的培養基 中大約 6 小時就達到穩定期；而在添加商品 化半乳寡醣與葡萄糖的培養基中都是在 9 小 時達到穩定期。推測可能是自製半乳寡醣內 所含乳糖量較商品化寡醣高，而能讓產氣莢 膜桿菌利用，故在促生效果上才會和乳糖組 相類似。 根據 Mlobeli 等〔12〕利用葡萄糖、乳 糖、水蘇糖、纖維雙糖等進行雙叉桿菌生長 速率探討，B. bifidum 在添加葡萄糖的培養 基中生長速率是最快的，相對的菌體量、代 謝速率等也隨之增快；而實驗中也證實了， 乳糖對於雙叉桿菌不是一個很好的基質。另 外 Hopkins 等〔13〕也提及了雙叉桿菌不同 菌種間對於不同碳源的利用情形會有所差 異，甚至不同菌株間也會有此種現象發生。 不過可以看出在其選用的雙叉桿菌中對於半 乳寡醣、低聚合度的寡果糖等多有良好的利 用情形；而普遍對於木寡醣的利用情形較不 佳。在體內實驗的結果中，也證實當食用半 乳寡醣後，體內的雙叉桿菌及乳酸菌菌數會 增加，類桿菌屬（bacteroidaceae）菌數則減 少，且短鏈有機酸會增加〔14〕。這些作用 可有效刺激腸道蠕動，減少大腸直腸癌的發 生並延緩老化的現象。 四、計畫成果自評 1. 本研究計畫成果報告內容與原申請研究 計畫書內容相符，並達成預期目標。 2. 研究成果具學術及應用價值，適合在學 術期刊發表。 五、參考文獻
1.O’Brien, M. and Mitsuoka, T. 1991. Quantitative fluorometric assay for rapid enzymatic characterization of
Bifidobacterium longum and related bifidobacteria. Microbiol Immunol. 35: 1041-1047.
2.Roy, D., Berger, J. L. and Reuter, G. 1994. Characterization of dairy-related Bifido-bacterium spp. based on
theirβ-D-galac-tosidase electrophoretic patterns. Int. J. Food Microbiol., 23: 55-70.
3.Ozawa, O., Ohtsuka, K., and Uchida, R. 1989. Production of 4’-galactosyllactose by mixed cells of Cryptococcus laurentii and baker’s yeast. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 36: 898-902.
4.Yanahira, S., Morita, M., Aoe, S., Suguri, T., Nakajima, I., and Deya, E. 1995. Effects of lactitol-oligosaccharides on the
intes-tinal microflora In rats. J. Nutri. Sci. Vita-minol. 41: 83-94.
5.Wallenfels, K. 1951. Enzymatische synthese von oligosacchariden auf disacchariden. Naturwissenschaften. 38: 306-307.
6.Z'arate, S. and L'opez-Leiva, M. H. 1990. Oligosaccharide formation during enzy-matic lactose hydrolysis: A literature re-view. J. Food Protect., 53: 262-268.
7.Smart, J. B., Pillidge, C. J., and Garman, J. H. 1993. Growth of lactic acid bacteria and bifidobacteria on lactose and lactose-related mono-, di- and trisaccharides and correlation with distribution of β-galac-tosidase and phospho-β-galacβ-galac-tosidase. J. Dairy Res. 60: 557-568.
8.Dumortier, V., Brassart, C. and Bouquelet, S. 1994. Purification and properties of a β-D-galactosidase from Bifidobacterium bifidum exhibiting a transgalactosylation
reaction. Biotechnol. Appl. Biochem., 19: 341-354.
9.Cruz, R., Cruz, V. D., Belote, J. G., Khenayfes, M. de O., Dorta, C., Oliveira, L. H. dos S., Ardiles, E., and Galli, A. 1999. Production of transgalactosylated oligosaccharides (TOS) by galactosyl-transferase activity from Penicillium sim-plicissium. Bioresource Technol. 70:
165-171.
10.Messer, M., Trifonoff, E., Stern, W., Collins, J. G., and Bradbury, J. H. 1980. Carbohydr. Res. 83: 327-334.
11.Becker, V.E. and Evans, H. J. 1969. The influence of monovalent cations and hy-drostatic pressure on β-galactosidase ac-tivity. Biochim Biophys Acta. 191: 95-104. 12.Mlobeli, N. T., Gutierrez, N. A., and Maddox, I. S. 1998. Physiology and kine-tics of Bifidobacterium bifidum during
growth on different sugars. Appl. Micro-biol. Biotechnol. 50: 125.128.
13.Hopkins, M. J., Cummings, J. H., and Macfarlane, G. T. 1998. Inter-species differences in maximum specific growth rates and cell yields of bifidobacteria cultured on oligosaccharides and other
simple carbohydrate source. J. of Appl. Microbiol. 85: 381-386.
14.Ito, M., Deguchi, Y., Matsumoto, K., Kimura, M., Onodera, N., and Yajima. 1993. Influence of galactooligosaccharides on the human fecal microflora. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 39: 635-640.
