2004 年臺灣國際科學展覽會
研究報告
作者：林育生
區別：北區
科別：微生物學
作品名稱：乳酸桿菌和啤酒酵母之相互作用及其代謝產物 對 Clostridium difficile 生長之影響
關鍵詞：乳酸桿菌、啤酒酵母、偽膜性腸炎
標題：乳酸桿菌和啤酒酵母之相互作用及其代謝產物對 Clostridium difficile 生長之影響
一、 前言：
市面上可以看到多種品牌紛紛推出了以“啤酒酵母＂作為號召的乳製品，標榜健康取向 的“啤酒酵母優酪乳＂也是其中的一件，我們蒐集了關於啤酒酵母以及乳酸桿菌的文獻，打 算研究之間的關係，乳酸菌屬於益生菌，主要的用途是製作優酪乳，可以協助維持體內正常 的腸道菌相，降低血清膽固醇以及預防骨質疏鬆症(Rolfe, 2000)；啤酒酵母最主要的用途為 啤酒的製作，具有解決失眠、消除疲勞、改善痢疾的功效。外國的克芙爾(kefir)也是屬於含 有乳酸桿菌及酵母菌菌相的食品，而且也對健康有益。因此我們提出了一個問題﹕啤酒酵母 與乳酸桿菌的代謝產物是否有著互利的功效呢？在拋出第一個問號後我們繼續尋找資料以 及著手我們的實驗。在文獻中(Gaon et al.,2003；Corthier et al.,1992,1986)也曾經提及啤酒酵 母與乳酸桿菌對於 Clostridium difficile 所引起的偽膜性腸炎的關係，所以使我們又想問兩個 問題：究竟 Ampicillin 對於乳酸桿菌、酵母菌、C. difficile 的影響有多大？而乳酸桿菌及酵 母菌對於 C. difficile 的影響又是什麼？
二、 研究過程與方法：
研究器材：
(一)器材 1.恆溫培養箱 2.殺菌釜 3.厭氧缸 4.厭氧產氣包 5.攪拌均質器
6.離心機 (13000 rpm) 7.離心管
8.培養皿 9.無菌操作台
(二)藥品
1.Ampicillin sodium (Sigma) 2.MRS broth (Bacto)
3.TSB broth (Bacto) 4.Yeast Extract (Sigma) 5.Peptone (Bacto) 6. Glucose (Sigma) 7.Malt Extract (Bacto) 8.Agar (Merck)
(三)培養基資料
1. YM broth (Yeast Extract & Malt Extract) 酵母抽取物培養基 Yeast Extract ………3g Peptone ………5g Glucose ………10g Malt Extract ……….………3g 2. MRS broth
Peptone ………. 10 g Lab-Lemco (Oxoid) ………. 10 g Yeast Extract ……… 5 g Glucose ……… 20 g Tween80 (polyoxyethylenen sorbitan mono-oleate) ……… 1 mg 磷酸氫二鉀 ……….………… 2 g
醋酸鈉（含 3 結晶水） ……….……… 5 g 檸檬酸氨 (Amonium citrate) ………..…… 2 g 硫酸鎂（含 7 結晶水） ……….…… 200 mg 硫酸錳（含 4 結晶水） ……….…… 50 mg 蒸餾水 ……….…… 1000 ml 3. TSB broth (Trypticase Soy Broth) 胰化酪蛋白大豆培養液
Trypticase ………...…… 15 g Peptone ………..… 17 g Phytone peptone ……….……… 3 g Glucose ………....…….. 2.5 g 磷酸氫二鉀……….. 2.5 g 蒸餾水 ……….……….. 1000 ml
實驗步驟：
1. 實驗菌種的挑選
克芙爾是西方國家眾多乳製食品之一，其中的菌相就包括了乳酸桿菌和酵母菌，因此我們 所挑選的菌種皆為克芙爾中的主要菌種。
酵母菌(Yeast) 乳酸菌(Lactobacillus)
Saccharomyces cerevisiae CCRC 21447 Lactobacillus kefiri CCRC 14011 Saccharomyces cerevisiae CCRC 22234 Lactobacillus acidophilus CCRC 14079
Saccharomyces unisporus CCRC 22601 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CCRC 10696 Lactobacillus fermentum (PCC)
2. 菌體活化
第一次菌體活化：將乾燥菌體(粉)加入液態培養基中(酵母菌為 YM 5 ml、乳酸桿菌為 MRS 10 ml、C. difficile 為 TSB 10 ml)
第一次之後的菌體活化：自原試管中取 100μl 加入各自的液態培養基(酵母菌菌體活化 40~48 小時、乳酸桿菌 16~24 小時、C. difficile 32~36 小時，厭氧環境；每次實驗的進行均 需事先菌體活化一至二代)
實驗設計與流程﹕
取酵母菌之培養後上清液加 入乳酸桿菌
取乳酸桿菌之培養後上清液 加入酵母菌
篩選出互相生長促進率高的組合
探討乳酸桿菌和啤酒酵母之相互作用能否提高 彼此在 Ampicillin 環境下的存活率
在 Ampicillin 環境下乳酸桿
菌之存活率
添加酵母菌之 培養後上清液 對 Ampicillin 環境下乳酸桿
菌的存活率
在 Ampicillin 環境下酵母 菌之存活率
添加乳酸桿 菌之培養後 上清液對 Ampicillin 環境下酵母 菌的存活率
探討酵母菌和乳酸桿菌之代謝產物在 Ampicillin 環境下對 C. difficile 的抑制作用 探討乳酸桿菌和啤酒酵母之相互作用
添加酵母菌之 培養後上清液 對 Ampicillin 環 境下 C. difficile 的存活率
添加乳酸桿菌之 培養後上清液對 Ampicillin 環境下 C. difficile 的存活 率
添加酵母菌和 乳酸桿菌之培 養後上清液對 Ampicillin 環境 下 C. difficile 的 存活率
在 Ampicillin 環 境下 C. difficile 之存活率
第一部份：探討數株益生性乳酸桿菌與啤酒酵母之代謝產物對彼此間生長的影響﹕
實驗一：探討乳酸桿菌之代謝物對酵母菌之影響 1.將乳酸桿菌及酵母菌菌體活化
2.將乳酸桿菌菌液放入離心機中離心(5500 rpm，20 分鐘)
3.將 1 ml 乳酸桿菌培養後上清液與 100μl 酵母菌菌液加入新的 YM 4 ml 中(其中正控制 組加 MRS 不加上清液，負控制組加無菌水不加上清液)，在 25℃培養 24 小時
4.上述菌液序列稀釋至10−6和10−8，取 1 ml 於 YM 培養基上培養 5. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
實驗二：探討酵母菌之代謝物對乳酸桿菌之影響 1.將乳酸桿菌及酵母菌菌體活化
2.將酵母菌菌液放入離心機中離心(5500 rpm，20 分鐘)
3.將 1 ml 酵母菌培養後上清液與 100μl 乳酸桿菌菌液加入新的 MRS 9 ml 中(其中正控制 組加 YM 不加上清液，負控制組加無菌水不加上清液)，在 37℃培養 12 小時
4.上述菌液序列稀釋至10−6和10−8，取 1 ml 於 MRS 培養基上培養 5. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
第二部分：探討 Ampicillin 對乳酸桿菌、酵母菌、C. difficile 的生長之影響
導致偽膜性結腸炎的原因為廣效性抗生素的過量使用(例如﹕一線抗生素 Ampicillin、二 線抗生素 Clindamycin、三線抗生素 Cephalosporins)，但一般臨床較常使用的為一線抗生素 Ampicillin，二線抗生素很少使用，因為其危險性也相對較高。所以我們決定使用 Ampicillin 進行實驗。而成人對 Ampicillin 的高劑量用量換算為試管中液態培養大約是 0.025μg/ ml Ampicillin 用量之換算﹕
1. 市售的 Ampicillin 藥碇服用最大劑量每次為 500 mg 2. 人體胃的容量為 2L
3. 乳酸桿菌、酵母菌、C. difficile 在腸道內菌叢之正常比例分別約為 1%
4. 人體腸道中一種菌最大的菌數可以到達1012個菌，但試管中最多僅至109個菌
−6 −8
綜合以上想法，我們算出抗生素在試管的用量：500 mg/2L × 1% × 109/1012 = 0.0025 µg/ ml
實驗三：Ampicillin 對乳酸桿菌、酵母菌、C. difficile 的生長之影響 1. 將乳酸桿菌、酵母菌、C. difficile 菌體活化
2. 將乳酸桿菌和 C. difficile 9 ml 的菌液加入 1 ml 的 Ampicillin(0.025μg/ ml) ；酵母菌 4ml 的菌液加入 500 μl 的 Ampicillin(0.025μg/ ml)
3. 將乳酸桿菌、C. difficile 菌液再放入 37℃環境中培養 30 分鐘，酵母菌放入 25℃環境中 培養 30 分鐘
4. 菌液序列稀釋至 、10 、10 ，再各取 1 ml 至培養基上培養(乳酸桿菌為 MRS 培 養基，酵母菌為 YM 培養基，C. difficile 為 TSB 培養基)
10−4
5. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
由實驗一、二的結果我們決定用 L. acidophilus 這株乳酸桿菌以及 S. unisporus 這株酵母菌來 完成這個實驗(原因在討論有詳細提及)
實驗四：添加酵母菌培養後上清液對乳酸桿菌在 Ampicillin 環境下之存活率 1. 將酵母菌及乳酸桿菌菌體活化
2. 取 100μl 乳酸桿菌菌液加入 8 ml 之 MRS 中，每管再分別加入 1 ml 的酵母菌培養後上 清液(1 ml 由前面實驗結果之存活率求得：1 ml × 酵母菌在 Ampicillin 作用下之存活率) 3. 12 小時後，將 1 ml 的 Ampicillin(0.025μg/ ml) 加入 9 ml 的菌液
4. 將乳酸桿菌菌液放入 37℃環境中培養 30 分鐘
5. 將菌液序列稀釋至10−8，再各取 1 ml 至 MRS 培養基上培養 6. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
實驗五：添加乳酸桿菌培養後上清液對酵母菌在 Ampicillin 環境下之存活率 1. 將酵母菌及乳酸桿菌菌體活化
2. 取 100μl 酵母菌菌液加入 3.9 ml 之 YM 中，每管再分別加入 600μl 的乳酸桿菌培養後 上清液(600μl 由前面實驗結果之存活率求得：1 ml × 乳酸桿菌在 Ampicillin 作用下之 存活率)
3. 24 小時後，將 0.5 ml 的 Ampicillin(0.025μg/ml) 加入 4.5 ml 的菌液 4. 將酵母菌菌液放入 25℃環境中培養 30 分鐘
5. 將菌液序列稀釋至 10-6，再各取 1 ml至YM 培養基上培養 6. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
第三部份：L. acidophilus 與 S. unisporus 之代謝產物抑制 C. difficile 的生長 實驗六：酵母菌代謝物在 Ampicillin 環境下對 C. difficile 的影響
1. 將酵母菌及 C. difficile 菌體活化
2. 取 100μl C. difficile 菌液加入 8 ml TSB，再加入 1 ml 酵母菌培養後上清液(1 ml 由前面 實驗結果之存活率求得：1 ml ×酵母菌在 Ampicillin 作用下之存活率)，培養 32 小時(厭 氧環境，37℃)
3. 將 1 ml 的 Ampicillin(0.025μg/ ml) 加入 9 ml 菌液中 4. 將菌液放入 37℃厭氧環境中培養 30 分鐘
5. 菌液序列稀釋至 10-1、10-2，再各取 1 ml至TSB 培養基上培養 6. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
實驗七：乳酸桿菌代謝物在 Ampicillin 環境下對 C. difficile 的影響 1. 將乳酸桿菌及 C. difficile 菌體活化
2. 取 100μl C. difficile 菌液加入 8.4 ml TSB，再加入 600μl 乳酸桿菌培養後上清液(600 μl 由前面實驗結果之存活率求得：1 ml ×乳酸桿菌在 Ampicillin 作用下之存活率)，培 養 32 小時
3. 將 1 ml 的 Ampicillin(0.025μg/ml) 加入 9 ml 的菌液 4. 將菌液放入 37℃厭氧環境中培養 30 分鐘
5. 菌液序列稀釋至 10-5、10-6，再各取 1 ml至TSB 培養基上培養 6. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
實驗八﹕乳酸桿菌代謝物與酵母菌代謝物同時在 Ampicillin 環境下對 C. difficile 的影響 1. 將 C. difficile、乳酸桿菌、酵母菌菌體活化
2. 取 100μl C. difficile 菌液加入 7.4 ml TSB，再加入 1 ml 酵母菌培養後上清液和 600μl 乳酸桿菌培養後上清液，培養 32 小時
3. 將 1 ml 的 Ampicillin(0.025μg/ ml) 加入 9 ml 的菌液 4. 將菌液放入 37℃厭氧環境中培養 30 分鐘
5. 菌液序列稀釋至 10-1、10-2，再各取 1 ml至TSB 培養基上培養 6. 48 小時後計算培養基上的單一菌落數目
三、研究結果與討論：
(一) 研究結果：
表一、乳酸桿菌之代謝產物對酵母菌生長之影響
乳酸菌株
S. cerevisiae21447 (108 CFU/ml)
菌數變化 (%)*
S. cerevisiae22234 (109 CFU/ml)
菌數變化 (%)
S. unisporus22601 (108CFU/ml)
菌數變化 (%) MRS broth 4.2±0.8 a 100 2.8±0.1 a 100 9.4±0.7 b,c 100 Water 3.1±0.3 b,c 74 6.7±0.1 d 239 7.8±1.0 c,d 83
L. kefiri 14011 2.8±0.6 c** 67 2.3±0.5 b,c 82 16±2.4 a 170
L. acidophilus 14079 2.8±0.5 c 67 2.2±0.3 c 79 15±9.5 a 160
L. delbrueckii subsp.
bulgaricus 10696
3.8±1.1 a,b,c 90 2.7±0.2 a,b 96 16±2.8 a 170
L. fermentum 3.9±0.3 a,b 93 2.3±0.4 b,c 82 2.7±1.6 d 29
*：菌數變化計算方法： [ 處理組 / 正控制組(MRS broth) ] × 100%
**：每一直行數據上標不同的英文字母代表彼此的差異顯著，相同的字母代表彼此沒有顯著差異(p<0.05)
表二、酵母菌之代謝產物對乳酸桿菌生長之影響
酵母菌株
L. kefiri 14011 (1010 CFU/ml)
菌數變 化(%)*
L. acidophilus 14079 (109 CFU/ml)
菌數變 化(%)
L. delbrueckii subsp.
bulgaricus 10696 (109 CFU/ml)
菌數變 化(%)
L. fermentum (1010 CFU/ml)
菌數 變化 (%) YM broth 1.5±0.3a 100 5.9±6.1 a 100 5.6±2.8 a 100 1.6±0.6 a,b 100 Water 1.2±0.5a 80 6.8±6.3 a 115 5.6±3.1 a 100 3.9±1.8 b 244 S. cerevisiae
21447
1.4±0.5a** 93 11±5.9 a 186 7.5±5.5 a 134 5.4±3.4 a,b 338
S. cerevisiae 22234
1.3±0.4a 87 9.6±6.9 a 163 6.1±5.1 a 109 6.0±4.5 a 375
S. unisporus 22601
2.1±0.8a 140 8.4±2.4 a 142 7.3±4.9 a 130 8.1±6.3 a 506
*：菌數變化計算方法： [ 處理組 / 正控制組(YM broth) ] × 100%
**之符號說明如同表一
表三、Lactobacillus acidophilus 14079 之代謝產物對 Saccharomyces unisporus 22601 在 Ampicillin(0.0025μg/ ml)環境下生長之影響
處理 S. unisporus 22601(109 CFU/ml) 存活率(%)*
Water 18±0.2 a 100
Ampicillin 18±1.2 a 100
Ampicillin+ L. kefiri 14079 上清液 20±0.4a** 111
*：存活率計算方法：[ 處理組 / 控制組(Water) ] × 100%
**：每一直行數據上標相同的字母代表彼此沒有顯著差異(p<0.05) ，不同的字母代表著彼此間有顯著差異
表四、Saccharomyces unisporus 22601 之代謝產物對Lactobacillus acidophilus 14079 在 Ampicillin(0.0025μg/ ml)環境下生長之影響
處理 L. acidophilus 14079(1010 CFU/ml) 存活率(%)*
Water 15±0.3 a 100
Ampicillin 2.1±0.3 b 14
Ampicillin+ S. unisporus 22601 上清液 2.2±0.3b** 15
*,**之符號說明如同表三
表五、Saccharomyces unisporus 22601 和Lactobacillus acidophilus 14079 之代謝產物對 Clostridium difficile在Ampicillin環境下生長之影響
處理 C. difficile 存活率(%)*
Water 1.8±0.1 a (108 CFU/ml) 100
Ampicillin 1.8±0.2 a (108 CFU/ml) 100
Ampicillin+ L. kefiri 14079+ S. unisporus 22601 4.1±0.6 c (102 CFU/ml)** 0.00033 Ampicillin+ L. kefiri 14079 1.9±0.0 b (107 CFU/ml) 18 Ampicillin+ S. unisporus 22601 3.4±0.4 c (103 CFU/ml) 0.0019
*,**之符號說明如同表三
(二)討論：
第一部份：數株益生性乳酸桿菌與啤酒酵母之代謝產物彼此間生長的影響
乳酸菌在自然界中分布相當廣泛，可和其他微生物形成穩定之生態，其泛指可利用碳 水化合物如：葡萄糖、乳糖進行發酵而產生一半以上代謝物為乳酸的細菌總稱，屬於格蘭 氏陽性菌。我們探討的乳酸桿菌為最大的乳酸菌屬，外型為長桿狀細胞，通常分布在土壤、
食品、腸道、以及糞便等處，其最適生長環境為 pH 5.5~ 6.2，但是實際對 pH 值的耐受度 則因菌種不同而各有歧異，又由磷酸酮基酶(phosphoketolase,PK)的有無而有多種區分(李，
2000；廖，1998；Lidbeck and Nord ,1991)，我們所使用的 L. acidophilus 屬於絕對同型發酵 菌﹕僅能發酵六碳醣，其產物為乳酸，L. fermentum 則屬於絕對異型發酵菌﹕可以發酵五 碳醣及六碳醣，發酵五碳醣的產物為乳酸、醋酸、乙醇或二氧化碳，六碳醣則為乳酸及醋 酸。我們所選擇的培養基 MRS 提供了足夠的醣類來源、氮源、以及足夠的離子，以確保 生長環境的誤差降到最小。
在表一中，我們探討乳酸桿菌之代謝物對酵母菌之影響，我們利用培養後的上清液以 取得其在生長時所代謝的產物，並且希望由這種方式來探討兩種菌之間代謝產物對於雙方 的影響。我們得到的實驗結果：L. kefiri 、L. acidophilus 之培養後上清液對 S. cerevisiae CCRC21447 的生長和負控制組沒有顯著差異， L. fermentum 之培養後上清液對 S.
cerevisiae CCRC21447 的生長和負控制組的生長沒有顯著差異，而 L. delbrueckii subsp.
bulgaricus 和正負控制組皆無顯著差異；L. delbrueckii subsp. bulgaricus之培養後上清液對 S. cerevisiae CCRC22234 和正控制組無顯著差異，其餘三株乳酸菌之培養後上清液對 S.
cerevisiae CCRC22234 的生長菌數在統計上介於正負控制組之間，代表選用的乳酸桿菌之 培養後上清液對 S. cerevisiae CCRC22234 生長無顯著影響；L. kefiri、L. acidophilus、L.
delbrueckii subsp. bulgaricus 之培養後上清液對 S. unisporus 的生長大於正控制組代表著它 們的代謝產物可以顯著促進 S. unisporus 的生長，其中 L. kefiri 之培養後上清液的生長促進 率為 70%，L. acidophilus 之培養後上清液的生長促進率為 60%，而 L. delbrueckii subsp.
bulgaricus 之培養後上清液的生長促進率為 70%，但是因為 L. kefiri 和 L. delbrueckii subsp.
bulgaricus 較難培養，故接下來的實驗我們以 L. acidophilus 作為實驗的對象，L. fermentum
之培養後上清液對 S. unisporus 生長菌數與負控制組沒有顯著差異，意味著其代謝產物對 S. unisporus 的生長沒有助益。綜合以上的結果，再加上其他關於乳酸桿菌的文獻，我們推 測原因為﹕生長沒有受到影響的實驗結果，是因為乳酸桿菌所產生的醋酸以及聯乙醯的濃 度不高，以致於這兩種抑制因素所造成的效果並不明顯(王，2000；Jay ,1982；Naidu et al.,1999)，而 L. fermentum 因為其為完全異型發酵乳酸菌，故其特別的代謝物質乙醛使得抑 菌效果與促進因素達平衡(Naidu et al.,1999)Kennes(1991)與 Hickey(1983)等人曾提出酵母菌 以及乳酸桿菌在葡萄糖以及檸檬酸的代謝上有互助的功能，所以我們推論其為促進生長的 原因之一，而上述兩種促進因素與抑制因素比例的不同造成了實驗結果的差異性。
在表二中我們探討酵母菌代謝產物對於乳酸桿菌生長的影響，而相對於表一實驗結果 的多樣性，我們得到的實驗結果較為單純﹕我們所選用的三株酵母菌之培養後上清液加入 L. kefiri、L. acidophilus、L. delbrueckii subsp. bulgaricus、L. fermentum，生長情況在統計上 和正負控制組皆無顯著差異。綜合上面的結果，我們提出以下的推論﹕酵母菌在生長環境 中釋出的酸性物質對於乳酸桿菌並無顯著影響，再加上兩者在前述葡萄糖與檸檬酸的共同 代謝，因此乳酸桿菌的生長情形不會因為酵母菌的代謝產物而產生顯著的影響。
第二部分：Ampicillin 對乳酸桿菌、酵母菌、C. difficile 生長之影響
C. difficile屬於格蘭氏陽性菌，中文命名為困難梭狀桿菌，為芽孢桿菌屬，存在於土壤、
沙、污水、排泄物、人類的腸道中，個體呈桿狀，其長度大約為 3.0~16.9 µm，寬度約為 0.5~1.9 µm。通常以獨立個體存在，但部分以 2~6 個細胞連接排列。屬於緣毛類，在液體 培養基上具有移動性(Bahl et al., 2001；Aktories et al., 2000；Rood et al., 1997)。此菌還會產 生內孢子，內孢子存在時使細胞膨脹，使得菌體外型有些許改變，其顏色與大小仍會隨著 培養時間有所改變。其最適合的生長環境介於 30~37℃，厭氧，可以發酵葡萄糖、甘露糖、
甘露醇，平常的時候在腸道內即存在，但是在服用廣效性抗生素後，會使得腸道內益生菌 的數量極劇減少(Kelly et al.,1998)，C. difficile大量增生，以至於毒素A及B會大量產生，導 致偽膜性腸炎(Bartlett et al., 1992, 1980；Fekety et al., 1993, 1997)。第三個實驗中我們使用 Ampicillin作為廣效性抗生素的代表，Ampicillin屬於磺胺劑類抗生素，所以不像某些抗生
素的功能僅為抑制細菌細胞壁的形成，其抗菌的功能為阻斷一定量的葉酸從菌體形成，因 此它的抗菌機制而使得使用的範圍更廣。
表三、表四、表五的發現為：L. acidophilus 在 Ampicillin 的環境下存活的百分比為 14%；S. unisporus 在 Ampicillin 的環境中存活率為 100%，其生長情形不受到 Ampicillin 影 響；C. difficile 在 Ampicillin 的環境中生長沒有受到抑制，存活率 100%。這意味著只要有 廣效性抗生素存在時，體內的益生菌的數量──尤其是乳酸桿菌──會受到抑制，而 C.
difficile 不為所動，這樣的環境下它就佔有相對的優勢，因此 C. difficile 在腸道菌相中存在 百分比的提高造成了致病的潛在原因。而要解釋同樣在 Ampicillin 環境下不同菌被抑制的 差異性效果，可以回到 Ampicillin 的原始特性﹕阻斷葉酸的合成，因此假如一個微生物它 對於葉酸的需求度比較高，則它被 Ampicilln 影響的情形就會越嚴重。在這個推論下，我 們可以得知在所選用的三株菌中，C. difficile 和 S. unisporus 對葉酸的需求度較小，而被抑 制得最強的 L. acidophilus 對葉酸的需求度最大。
綜合第一部分以及第二部分的結果，我們可以先推算添加 Ampicillin 和 L. acidophilus 之培 養後上清液對 S. unisporus 的生長促進率：
1. L. acidophilus 之培養後上清液對 S. unisporus 的生長促進率為 60%
2. S. unisporus 添加 Ampicillin 的存活率為 100%
3. L. acidophilus 添加 Ampicillin 的存活率為 14%
(L. acidophilus 對 S. unisporus 促進率× L. acidophilus 存活率 + 100%) × (S. unisporus 存活率)
= (60% × 14%+100%) × 100 % = 108%
求出的理論値和實驗結果(111%)差距不大：L. acidophilus 的上清液讓 S. unisporus 在 Ampicillin 環境下存活率提高 11%(表三)。
推算添加 Ampicillin 和 S. unisporus 之培養後上清液對 L. acidophilus 的生長促進率：
1. S. unisporus 之培養後上清液對 L. acidophilus 的生長促進率為 42%
2. S. unisporus 添加 Ampicillin 存活率為 100%
3. L. acidophilus 添加 Ampicillin 存活率為 14%
(S. unisporus 對 L. acidophilus 促進率× S. unisporus 存活率 + 100%) × (L. acidophilus 存活率)
= (42% × 100%+100%) × 14 % = 20%
求出的理論値和實驗結果(15%)的差距，推測是因為 S. unisporus 之培養後上清液對 L.
acidophilus 的生長促進率(42%)與統計結果不符：但無論是理論値和實際結果都顯示 S.
unisporus 之培養後上清液的添加對於 L. acidophilus 的存活率有提昇的效用。
第三部份：L. acidophilus 與 S. unisporus 之代謝產物抑制 C. difficile 的生長
表四的發現為抗生素對於 L. acidophilus 的生長會有抑制的效果，而在加入 S.
unisporus 的培養後上清液後生長有上升的現象，故我們接下來想要探討 L. acidophilus與 S. unisporus 的培養後上清液對於 C. difficile 生長的影響。表五的結果為 S. unisporus 上清 液可以使得 C. difficile 的存活率降為 0.0019%而 L. acidophilus 的上清液則可以使 C.
difficile 的存活率降為 18%；此外，我們設計了一組實驗，一次加入兩種菌的培養後上清 液，希望可以達到最大的抑制效果，而結果也非常明顯的將 C. difficile 存活率壓到更低﹕
0.00033%，雖然在統計上沒有明顯的差異，但是無可否認的兩組實驗都將 C. difficile 得 存活率顯著的降低，而同時加入 L. acidophilus 及 S. unisporus 上清液的結果更甚於前者。
關於 S. unisporus 的培養後上清液可以抑制 C. difficile 生長的原因我們推測是因為酵
母菌在培養時通常會將周圍環境的 pH 值降低(Broach et al.,1991,1992；Tuite et al.,1991)，
一方面可以增加一些代謝反應的催化，另外一方面也可以達到抑菌的效果。而 C. difficile 醣類代謝的途徑對於 pH 值非常的敏感(Rood et al.,1997)，效率會降低，因此整體生長也 被抑制，乳酸桿菌的代謝產物﹕醋酸、乳酸也提供了 pH 值降低的機會，使得氨的吸收減 緩，因而產生的胺類的量也減少，所以也可以抑制生長。
Gaon 等(2003)提出 Lactobacillus 的細胞素會促進體內對於感染處理機制的提早活 化，因 Lactobacillus 與 S. unisporus 搭配服用的組合可以有助於增強體內對於感染的免疫 反應，減緩痢疾的症狀。
Saccharomyces 在正常情況下通過消化道時，存活率只有 17~34%，而在有使用 Ampicillin 的情況下通過消化道則存活率反而會提高，原因為競爭的微生物數量減低所
致。所以在服用抗生素期間連帶食用 S. unisporus 應該可以達到預防偽膜性腸炎 (pseudomembranous colitis, PMC)的效果
目前治療偽膜性腸炎的方法包括了於發病後食用Saccharomyces boulardii可以有效防 止復發的產生(Corthier et al., 1992, 1986；Buts et al.,1993；Kimmey et al.,1990；Surawicz et al.,1989)、增強體內免疫系統對感染的反應(Qamar et al.,2001)、甚至抑制毒素的形成與毒 性(Castagliuolo et al.,1996,1999；Dias et al .,1991；Pothoulakis et al.,1993)而且與傳統抗生 素療法搭配時，效率更為提高(Surawicz et al.,1989)，而我們得到的S. unisporus對C. difficile 的抑制效率，也可以達到一定的效果，並且有期刊曾經建議使用成本較低的S. cerevisiae 來作為替代品(Toothaker et al.,1984)而S. unisporus也已經在工業上有一定程度的使用，因 此也具有成本較低的特色，並且我們的實驗證明了在試管中抑制效果非常良好，希望能 夠在活體內的實驗模式下得到更多的證明。此外，Corthier (1986)、Toothaker(1984)等人 曾表示使用廣效性抗生素做治療之前先行服用Saccharomyces boulardii將可以明顯的減少 得到偽膜性腸炎的機會，這也是我們的實驗結果可以發展的方向。而乳酸桿菌對於抑制 C. difficile的抑制或是輔助作用也是我們還可以繼續努力的方向。
四、結論與應用﹕
(一)結論﹕
1.本試驗中所利用的 3 株酵母菌(S. cerevisiae CCRC 21447、S. cerevisiae CCRC 22234、S.
unisporus CCRC 22601)的代謝物對四株乳酸桿菌(L. kefiri CCRC 14011、L. acidophilus CCRC 14079、L. delbrueckii subsp. bulgaricus CCRC 10696、L. fermentum PCC)的生長沒有 顯著影響。
2.L. kefiri CCRC 14011、 L. acidophilus CCRC 14079、L. delbrueckii subsp. bulgaricus CCRC 10696 的代謝產物有助於 S. unisporus CCRC 22601 的生長 (L. kefiri CCRC 14011 代謝產 物：170%，L. acidophilus CCRC 14079 代謝產物：160%，L. delbrueckii subsp. bulgaricus CCRC 10696 代謝產物：170%)。
3.在本試驗中所測試之四株乳酸桿菌之代謝物對 S. cerevisiae 21447，S. cerevisiae 22234 兩株
酵母菌之生長沒有顯著影響。
4.酵母菌的上清液加到乳酸桿菌菌液中，對乳酸桿菌的生長並沒有造成顯著的影響，所以我 們只就乳酸桿菌上清加到酵母菌菌液的實驗結果討論﹕
(1) 將 L. kefiri CCRC 14011 和 S. unisporus CCRC 22601 放在同一環境下所產生的交互作用 是會促進 S. unisporus CCRC 22601 菌種的生長，而 L. kefiri CCRC 14011 生長情況不變 (2) L. acidophilus CCRC 14079 和 S. unisporus CCRC 22601 在同一環境下的交互作用是會促
進 S. unisporus CCRC 22601 菌種的生長，而 L. acidophilus CCRC 14079 生長情況不變 (3) L. delbrueckii subsp. bulgaricus CCRC 10696 和 S. unisporus CCRC 22601 在同一環境下的
交互作用是會促進 S. unisporus CCRC 22601 菌種的生長，而 L. delbrueckii subsp.
bulgaricus CCRC 10696 生長情況不變。
5.S. unisporus CCRC 22601 的代謝產物可以顯著的抑制C.difficile的生長(0.0019%)；而L.
acidophilus CCRC 14079 的代謝產物與S. unisporus CCRC 22601 的代謝產物搭配可以使抑 制效果更明顯(0.00033%)。
(二)應用﹕
1. 攝食乳酸桿菌 L. kefiri CCRC 14011、 L. acidophilus CCRC 14079 及 L. delbrueckii subsp.
bulgaricus CCRC 10696，可與酵母菌 S. unisporus CCRC 22601 一起食用，將使得體內益生 菌的增生。
2. L. acidophilus CCRC 14079 的上清液可提高 S. unisporus CCRC 22601 在 Ampicillin 環境下 的存活率(11%)，L. acidophilus 14079 可以改善酵母菌的生長情形以減小偽膜性腸炎產生的 機率。
3. S. unisporus CCRC 22601 的上清液可提高 L. acidophilus CCRC 14079 在 Ampicillin 環境下 的存活率(1%)，雖然增長的幅度不大，但是相對來說可以利用 S. unisporus CCRC 22601 使 得腸道內的菌相較為平衡。
4. 攝食酵母菌 S. cerevisiae CCRC 21447、S. cerevisiae CCRC 22234、S. unisporus CCRC 22601，對體內 L. kefiri CCRC 14011、L. acidophilus CCRC 14079、L. delbrueckii subsp.
bulgaricus CCRC 10696、L. fermentum 菌叢將不造成影響，可以放心食用。
五、參考文獻﹕
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