以生態、形態及分子證據探討利用山漆莖屬黃蝶之系統分類位置

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 以生態、形態及分子證據探討利用山漆莖屬黃蝶之系統分類位置 Biosystematics of Breynia-feeding “Eurema hecabe” based on morphological, ecological and molecular evidence. 研究生：林郁婷 Yuh-Tyng lin 指導教授：徐堉峰博士 Yu-Feng Hsu. 中華民國 101 年六月.

(2) 目錄前言……………………………………………………………………4 材料與方法……………………………………………………………10 結果……………………………………………………………………16 討論……………………………………………………………………20 參考文獻………………………………………………………………25. I.

(3) 附表目錄表一、前翅腹面地標點位置……………………………………….….31 表二、後翅腹面地標點位置……………………………………….….32 表三、本研究所使用之引子……………………………………….….33 表四、分子樣本資料………………………………………………......34 表五、各型黃蝶樣本前翅地標點以普氏疊合後，殘差進行多變量分析之駢對比較侯特齡氏檢定結果…………….………………….35 表六、各型黃蝶樣本前翅翅緣地標點以普氏疊合後，殘差進行多變量分析之駢對比較侯特齡氏檢定結果…………………………..35 表七、各型黃蝶樣本後翅地標點以普氏疊合後，殘差進行多變量分析之駢對比較侯特齡氏檢定結果………………………………..35 表八、各型黃蝶間 wingless 基因之 Fst 值……………………………. 36 表九、各型黃蝶間 RpS2 基因之 Fst……………………………………36 表十、各型黃蝶間 HAPDH 基因之 Fst 值……………………………36. II.

(4) 附圖目錄圖一、日本地區黃蝶之緣毛形態………………………………………37 圖二、地標點位置……………………………………………………..38 圖三、各型黃蝶之典型變異分析圖，前翅地標點之形狀資料經普氏疊合分析法後的殘差進行典型變異分析之結果………………. 39 圖四、各型黃蝶之典型變異分析圖，前翅翅緣地標點之形狀資料經普氏疊合分析法後的殘差進行典型變異分析之結果…………..40 圖五、各型黃蝶之典型變異分析圖，後翅地標點之形狀資料經普氏疊合分析法後的殘差進行典型變異分析之結果………………..41 圖六、各型黃蝶雄蝶背面紫外光翅紋反射格式………………………42 圖七、各等級之雌蝶背面紫外光翅紋反射格式………………………43 圖八、各型黃蝶之基因型網狀親緣關係圖…………………………..44. III.

(5) 摘要寄主之利用可能造成植食性昆蟲之族群分化進而達成同域種化。黃蝶(Eurema hecabe Linnaeus,1758)為昆蟲中著名的多表現型 (polyphenism)範例，在台灣地區黃蝶可利用豆科(Fabaceae)、鼠李科 (Rhamnaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)的植物做為其幼生期之寄主。日人針對日本地區黃蝶研究，將食用鼠李科及部分豆科植物之黃色型緣毛黃蝶自黃蝶中分出，為北黃蝶(E. mandarina)。過去雖有部分研究探討，台灣地區食用大戟科山漆莖屬(Breynia)做為寄主之黃蝶分類地位尚不明確，因此本研究將台灣地區之黃蝶依據其寄主植物分為北黃蝶、豆科型黃蝶、大戟科型黃蝶三群進行探討，以確立利用大戟科山漆莖屬(Breynia)之黃蝶的分類地位。生態學研究結果發現三型黃蝶之發育起點溫度接近，但北黃蝶的有效積溫值較高，且三型黃蝶生長發育之最適溫區不同。將三型黃蝶的後翅翅型利用普氏疊合後(Generalized Procrustes Analysis, GPA)進行典型變異分析(Canonical variates analysis, CVA)有顯著差異，大戟科型黃蝶的前翅翅型進行典型變異分析亦與其他兩型有顯著差異。三型黃蝶的雌蝶背面之紫外光翅紋反射格式也存在差異。進行網狀親緣關係(hapoltype network)之比較，在 wingless 片段與 RpS2 片段大戟科型黃蝶皆能自成一群。wingless 片段與 RpS2 片段之 Fst 值則顯示大戟 1.

(6) 科型黃蝶與其他兩型黃蝶之基因交流受到限制。綜合本研究以及過去對於台灣地區黃蝶之相關研究推斷，認為台灣地區利用大戟科山漆莖屬之黃蝶為一隱蔽種。. 關鍵字：黃蝶、寄主小種、同域種化. 2.

(7) Abstract Host shift might cause differentiation between populations of phytophagus insects and lead to sympatric speciation in the end. Eurema hecabe, a polyphenic butterfly who uses Fabaceae, Rhamnaceae and Euphorbiaceae plants as hosts The past studies discriminated the yellow wing fringe form of E. hecabe that using Rhamnaceae and Fabaceae plants as a distinct species called E.mandarina. The Euphorbiaceae-feeding populations only use Breynia species as hosts and its systematic status is not clear yet. This study aims to clarify the systematic status of the Breynia-feeding E. hecabe in Taiwan. I separated Taiwanese populations of E.hecabe complex into three groups according to their hosts; they were Eup-type, Fab-type and E. mandarina, respectively. In the ecological investigations, threshold temperature of development were similar among three types, though E. mandarina had higher effective accumulated temperature. The optimum temperature ranges of the three types were different. Results of canonical variates analysis showed that shape of forewing was significantly different between Eup-type and the other two, and shape of hind wing was different among the three types. Female UV reflection pattern of three types were different. The Eup-type formed a monophyletic group in the molecular analyses based on wingless gene and GAPDH gene. The high value of Fst illustrated that gene flow between Eup-type and the other two was limited. To integrate the results of ecological experiments, morphological measurements, and molecular analysis, I concluded that the Breynia-feeding E. hecabe should be a cryptic species. Keywords : Eurema hecabe; host race; sympatric speciation 3.

(8) 前言 Mayr(1963)定義同域種化(sympatric speciation)為不存在地理屏障之生殖隔離；地理屏障是指兩族群間的距離超過個體可移動之距離，或兩族群間所間隔之環境不適合其居留因而杜絕交流。同域種化藉由選汰作用於異質性環境下(Maynard-Smith, 1966)，產生遺傳多型性 (polymorphism)以適應各種類型之環境，再透過同型交配(assortative mating)降低基因交流，漸漸造成不同族群間的生殖隔離。植食性昆蟲生活史中大半時間與其寄主植物之關係密不可分，許多植食性昆蟲會在其寄主附近進行求偶與交配(Bush, 1969, 1974, 1975 ; Price, 1975; Hiroki & Kato, 1996)，當部分族群轉而利用一新寄主植物時其交配選擇與寄主選擇常互有相關。有些因偏好不同寄主植物，而各自利用之寄主植物出現時間有差異，使得利用不同寄主的族群出現時間亦隨之產生差異而無法相遇(Seitz & Komma,1984; Itami et al. 1998)。以上因素都可能使植食性昆蟲因寄主植物之偏好而導致同型交配形成不同 host race。不同 host race 間的差異介於同種內之遺傳多型性與不同物種之間，因此被認為是同域種化的中間步驟(Diehl &Bush, 1984)。 Drès & Mallet (2002)對host race提出以下定義：1.在野外利用不同寄主植物，且對其寄主有忠誠度；2.利用不同寄主植物之族群有共域 4.

(9) 之分布；3.不同族群間有一個以上的基因座(locus)有穩定的遺傳差異； 4.求偶偏好與其寄主選擇間有相關，但利用不同寄主的族群間仍有基因交流；5.利用非其偏好的寄主植物會降低其適存度(fitness)，雜交產生的後代適存度也較低。植食性昆蟲因食性轉換(host-shift)而形成不同host race最著名的例子為北美的蘋果果實蠅(Rhagoletis pomonella)，因雌蟲在寄主植物附近交配而發展出利用山楂(Crataegus spp.)與蘋果(Malus pumila)兩host races(Bush 1969; Bush & Smith 1998; Feder 1998)，其他如鞘翅目金花蟲科的Lochmaea capreae有利用柳樹(Salix caprea)與樺樹(Betula pubescens)兩host races(Mikheev & Kreslavsky 1980)，鱗翅目捲蛾科的Zeiraphera diniana利用落葉松(Larix decidua) 與松樹(Pinus cembra)兩族群在幼蟲顏色、雌性費洛蒙、allozyme frequence皆有差異(Baltensweiler 1977,1993; Day 1984; Priesner & Baltensweiler 1987a,b; Emelianov et al. 1995,2001,2002)。粉蝶科(Pieridae)黃蝶屬之黃蝶(Eurema hecabe Linnaeus,1758)分布範圍西起於非洲，北至朝鮮半島、日本本州，東達巴布紐新幾內亞，南至澳洲北部及東部。Yata(1995)將黃蝶分為 18 個亞種，台灣地區的黃蝶族群屬於指名亞種 E. hecabe hecabe Linnaeus，在台灣全島平地至海拔 2500 公尺山地皆有分布，在澎湖、綠島、蘭嶼也有採集紀錄(山中，1972; 徐，2000)，為常見一年多世代性物種，終年可見其成蝶飛 5.

(10) 舞。黃蝶在台灣地區紀錄之主要寄主植物至少包括鼠李科 (Rhamnaceae)、豆科(Fabaceae)以及大戟科(Euphorbiaceae)共三科九屬的植物(徐，2002)，為蝴蝶中較少見之廣食性物種(Chapman, 1982; Fiedler, 1996)。關於黃蝶過去已有諸多相關研究，黃蝶受到溫度、光照週期的影響而有不同季節形態(Kato & Handa,1992; Kato,1999)。Kato et al.(1992) 將日本地區之黃蝶依據緣毛顏色分為黃色型以及褐色型兩群(圖一)，且發現兩群黃蝶在食性上具有不同之偏好性：黃色型黃蝶寄主包括鼠李科以及豆科合歡(Albizia julibrissin)、鐵掃帚(Lespedeza cuneata)，褐色型黃蝶則僅侷限於利用豆科植物，替換寄主植物會降低幼蟲存活率及發育速度；兩型黃蝶在日本地區的分布也有差異，褐色型黃蝶僅分布於亞熱帶區域的沖繩群島，黃色型黃蝶則主要分布於日本本島之溫帶地區及沖繩群島。Matsuno (1999)檢測黃蝶在紫外光下的紫外光反射翅紋，發現沖繩群島地區的黃色型黃蝶與褐色型黃蝶反射翅紋不同，因昆蟲複眼可接收紫外光，推測兩型黃蝶在視覺上可辨識彼此，推論兩型黃蝶可能為不同種。Kobayashi et al.(2001)發現兩型黃蝶間有不對稱的求偶行為模式，褐色型雌蝶僅會選擇同型之雄性交配；黃色型雌蝶則隨著羽化日齡的增長，拒絕褐色型雄蝶的比例增加；但在雄蝶對於同型與不同型之雌蝶求偶行為並無顯著差異。Kato & Yata(2005) 6.

(11) 檢視日本西南諸島與台灣之標本後，依據緣毛形態與翅紋季節型關係和寄主植物相關聯之關係，提出黃色型與褐色型黃蝶應為不同生物種，並在檢視模式標本後將緣毛黃色型黃蝶更名為北黃蝶(E. mandarina de l’Orza, 1869)。台灣地區黃蝶利用之寄主植物科別較日本地區更為廣泛，根據過去寄主植物交換研究(邱，2003; 莊，2006)發現，台灣地區的黃蝶在寄主植物利用上的確有分化之情形，且進行寄主交換會降低存活率。莊(2006)曾利用粒線體 COI 與 COII 片段對台灣地區的黃蝶進行親緣關係之探討。Nartia et al.(2006)發現日本地區之黃蝶有受到內共生菌 Wolbachia 感染之情形，若族群最近曾經遭受 Wolbachia 感染產生天擇性橫掃(selective sweep)會造成粒線體 DNA 之變異量降低、影響基因之頻率使其偏離中性。林(2009)對台灣地區之蝴蝶受 Wolbachia 感染之情形進行普查亦發現台灣地區之黃蝶有遭受 Wolbachia 感染。因此本研究選擇使用核 DNA 進行相關之分群探討。Wahlberg & Wheat(2008)研究指出使用一個以上的基因片段能獲得較可信的親緣關係，Drès & Mallet(2003)亦提出 host race 間應該存在超過一個以上的基因座(locus)差異。故本研究選用過去常用於近緣種間親源關係分析的 wingless 片段以及 Wanlberg & Wheat(2008)發表之 GAPDH、RpS2 兩個基因片段來分析台灣地區各型黃蝶之親緣關係。 7.

(12) 分類鑑定上，形態特徵佔有不可或缺的地位，在過去日籍學者對於黃蝶的研究中，標本檢視佔相當大之部分，其中區分黃蝶與北黃蝶的重要形態特徵之一為緣毛之描述(Kato & Yata, 2005; 白水，2006)，然而邱(2003)及莊(2006)檢視台灣地區黃蝶利用之寄主與其緣毛之關係，發現大體上台灣地區黃蝶緣毛形態雖大致與 Kato(1992)對日本地區族群之緣毛形態定義相符，但仍有部分利用個體不符合其定義。且日本地區缺乏的利用大戟科之黃蝶的緣毛形態也混有多型(莊，2006)，因此，緣毛形態並非一區分利用不同寄主族群的良好特徵。而 Yata(1995)對黃蝶屬進行另一常用於昆蟲分類上重要的形態特徵分析 ─交尾器結構進行綜合分析，亦未能發現利用不同寄主之黃蝶交尾器有明顯差異。白水(2006)提出北黃蝶與黃蝶之斑紋與後翅外緣形狀有差異，然而黃蝶屬成蟲之斑紋形態又具有高度變異，尤其高溫期的斑紋退化甚鉅，因此使相較於翅紋，使用翅型可能較適宜做為鑑定之特徵。根據過去之研究(邱，2003; 莊，2006)，台灣地區食用鼠李科及部分豆科植物的族群與日本地區之黃色型黃蝶應為同種，即為北黃蝶；寄主植物僅限於豆科之族群則為褐色型黃蝶；利用大戟科山漆莖屬植物之黃蝶族群與前兩者間確有分化情形，但該族群之分類地位仍然不明確。因此本研究將藉由生態學、形態以及分子證據進一步探討各型 8.

(13) 黃蝶間之關係，尤其著重檢討過去尚欠缺研究之食用大戟科山漆莖屬植物之黃蝶釐清其分類地位，驗證寄主轉換是否使造成立用山漆莖屬黃蝶達成同域種化。. 9.

(14) 材料與方法研究材料自全台各地採回黃蝶卵後，依據 Kato et al.(1992)及莊(2006)之食性測試結果將採回之黃蝶卵分為北黃蝶(產於鼠李科桶鉤藤 Rhamnus formosana、豆科鐵掃帚 Lespedeza cuneata、毛胡枝子 Lespedeza formosa、合歡 Albizia julibrissin)、豆科型黃蝶(產於豆科田菁 Sesbania cannabiana、黃槐 Senna sulfurea、決明 Senna tora、楹樹 Albizia chinensis)、大戟科型黃蝶(產於大戟科山漆莖屬紅仔珠 Breynia vitis-idaea)共三型，並將各型隨機均分為四組，分別置入 15℃、20℃、 25℃、30℃之梯溫飼養箱以 12 小時光照 12 小時黑暗之光週期飼養。每一蝶卵均單獨置入一 80×50×30mm3 之透明塑膠盒飼養。每日檢視一次，記錄幼蟲之生長狀態並定期更換食草，待幼蟲化蛹後移除所有食草並固定蛹以提高羽化成功率。羽化後之成蝶製成標本做為後續形態資料分析之用。. 生態學研究：有效積溫(effective accumulated temperature) 生物在其發育過程中需要自外界攝取一定的熱量，亦即生物完成發育或某一階段的發育所攝取的總熱量為一常數，稱為有效積溫法則 (Law of effective accumulated temperature) (Higley et al., 1986 ; Arnold, 10.

(15) 1959 ; Chiang,1985)。有效積溫法則可用下列公式表示： D×T=K …………………(1) D：完成生長發育所需的時間(duration of development) T：完成此發育階段期間之平均溫度(average temperature) K：有效積溫常數(constatnt). 由於發育速率 V 與發育時間 D 呈倒數關係，因此可將發育速率與溫度之關係改寫為： V=T/K ……………………(2). 發育起點溫度為昆蟲發育速率為零的溫度。一般昆蟲的發育起點溫度在 0℃以上，在發育起點以上的溫度才為對生長發與的有效溫度。因此應校正公式(1)為： D(T－C)=K …………………(3) C：發育起點溫度(threshold of development) (T－C)：發育期間的平均有效溫度(average effective temperature). 因此可將發育速率改寫為： V. T  C  …………………(4) K. 昆蟲在期發育期間內所攝取的有效溫度總和稱為有效積溫 11.

(16) (effective accumulated temperature)。在計算時，若計算每天平均有效溫度累積，溫度以℃做為單位，發育時間則以日為單位，則有效積溫的單位為「日度」(day-degree)。. 在多組溫度處理的實驗中，C 與 K 可以利用統計學上之「最小自乘方」求得： V   T  V  VT C  nV  V  2. 2. 2. K. nVT  V   T nV 2  V . 2. ……………………(5). ……………………(6). 因實驗計算取樣會有一定的誤差，故使用以下公式計算發育起點之誤差。. 形態學研究 1.幾何形態學(geometric morphometry)測量將乾燥完成之標本以數位相機(Pentax K20D)架設支架拍攝各樣本之背面及腹面影像。取前翅及後翅腹面之影像利用幾何形態學測量做翅型形狀分析，檢視不同型黃蝶之前翅與後翅形狀。所使用. 12.

(17) 之地標點選取與幾何形態分析軟體均自美國紐約大學石溪分校的幾何形態學研究網(http://life.bio.sunysb.edu/morph/)下載而來，主要使用之程式為： 1.TpsDig2 (Rohlf,2006)：用於對影像進行地標點選取。 2.PAST (Hammer et al.,2008)：用於分析各型黃蝶之地標點資料。使用 TpdDig2 軟體，選取每個樣本之前翅地標點共 20 個、後翅地標點 15 個。為減少人為因素之誤差，對每一樣本圖形相同位置求取三次座標，再以其平均值為其樣本座標( Baylac et al.,2003) 輸出為 TPS 檔，以利 PAST 軟體分析使用。各地標點之描述詳見表一、二，圖二。將取得之地標點，利用普氏疊合分析法(Generalized Procrustes Analysis, GPA)將每一樣本的形狀座標進行旋轉、平移置中以及大小一致化，以去除大小及位置這些非形狀因素的影響，使各樣本轉入普氏座標。轉換後之殘差值(Procrustes rtsiduals)用於典型變異分析 (Canonical variates analysis, CVA)。 2.紫外光反射翅紋格式將標本腹面置於兩支 F13T5/BLB 及四支 8W-UVB-T5(固德電器有限公司)所組成之紫外光光源下，透過濾鏡濾除去紫外光以外 13.

(18) 之反射光波段後，以 PENTAX H2520-UVM 鏡頭及 SONY XCD-SX910UV CCD 相機拍攝各型黃蝶之雌、雄蝶在紫外光下之成相(Chiao et al.,2009)。黃蝶之紫外光反射在標本與入射光源垂直的角度時並非對反射率之最大值，因此將每個標本旋轉使標本平面與入射光夾角呈 110±5 度之夾角拍攝紫外光反射成相。豆科型黃蝶以及大戟科型黃蝶之雌蝶利用 PhotoshopCS4 軟體擷取右前翅影像後，使用 ImageJ 軟體分析反射區域與前翅之面積比，利用統計軟體 JMP7 進行獨立樣本 t 檢定(Independent t test)比較其紫外光反射情形之差異。. 分子遺傳方面研究：根據樣本採集之情形進行隨機選取樣本，同一地點相同寄主植物不選取超過兩隻個體。剪取樣本之腳部及胸部肌肉組織，使用 Purgene DNA Isolation kit 萃取 DNA。並利用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)放大核 DNA 目標片段 wingless、GAPDH、RpS2，所使用之引子詳見表三，分析之樣本資料見表四。 PCR 反應條件設定以 95℃作用 4 分鐘使 DNA 雙股裂解，每一 PCR 循環以：95℃進行 30 秒 DNA 變性(denaturation)，50℃作用 30 秒使之黏合(annealing)，延長(extension)反應以 72℃作用 1 分鐘，共. 14.

(19) 進行 40 次循環；最後後以 72℃進行 7 分鐘之延長。定序後之序列以軟體 Sequencher 4.10.1 (GeneCode, Boston, USA) 進行序列比對檢查，刪除引子之序列。整理後之序列則利用 National Center for Biotechnology Information (NCBI)上序列進行比對以確認物種序列無誤。使用 DnaSP 5.10.01 軟體將核 DNA 序列中的 heterozygous sites 解開(phase)後，將解開之序列用 Sequencher 4.10.1 整理並轉檔輸出。再利用 hapview 軟體建立樣本之基因型網狀親緣關係(hapoltype network)。Fst 值之計算使用 DnaSP 5.10.01 軟體。. 15.

(20) 結果一、各形黃蝶之有效積溫將各型黃蝶利用不同溫度飼養，計算幼蟲期天數用以估算各型黃蝶的發育起點溫度以及有效積溫。其中北黃蝶於 30℃下飼養多出現幼蟲期有六齡之齡期異常情形，且大戟科型黃蝶幾乎無法在 15℃環境下成功飼養至化蛹，為避免極端條件造成之誤差，以 20℃以及 25 ℃飼養隻個體進行計算及分析。計算結果北黃蝶、豆科型黃蝶及大戟科型黃蝶之發育起點溫度分別為(0.0081±0.24)℃、(0.0222±0.53)℃及(0.0109±0.31)℃。有效積溫則分別為 451.79 日度、371.28 日度以及 365.69 日度。. 二、成蟲翅膀幾何形態學測量 (一)前翅腹面地標點典型變異分析對三型黃蝶共 95 個成蝶前翅樣本做普氏疊合分析(GPA)旋轉疊合轉入普氏座標後，進行典型變異分析(CVA)(圖三)，結果顯示三型黃蝶的前翅形狀有顯著差異(Wilks’ Λ=6.583×10-2, F(72,112)=4.507, P<0.001)。以駢對比較侯特齡檢定分析(Hotelling's pairwise comparisons)進行各型黃蝶間之駢對比較(表五)，大戟科型黃蝶與另外兩型黃蝶間有顯著差異(P<0.001)，而北黃蝶與豆科型黃蝶間則無顯著. 16.

(21) 差異(P>0.05)。另針對三型黃蝶前翅外緣形狀進行分析，移除翅脈交點與翅脈和中室之交點後，將 95 個樣本的 12 個地標點資料做普氏疊合分析後進行典型變異分析(圖四)。三型黃蝶的前翅外緣形狀具有顯著差異 (Wilks’ Λ=1.974×10-1, F(40,144)=4.503, P<0.001)。對各型黃蝶間做駢對比較侯特齡檢定分析之駢對比較(表六)，北黃蝶、豆科型以及大戟科型三型黃蝶間彼此差異均相當顯著(P<0.001)。. (二)後翅腹面地標點典型變異分析將三型黃蝶共 95 個樣本之成蝶後翅腹面地標點進行普氏疊合後，將殘差值進行典型變異分析，三型黃蝶後翅形狀有差異(Wilks’ Λ=3.508×10-2, F(52,134)=11.18, P<0.001)，如圖五所見由第一典型變異軸(CVA1)與第二典型變異軸(CVA2)可看出大戟科型黃蝶與北黃蝶、豆科型黃蝶有明顯區分。進行侯特齡檢定之駢對比較(表七)，各型黃蝶間駢對比較均有顯著差異(P<0.001)。. 三、成蟲背面紫外光翅紋反射格式各型黃蝶之雄蝶背面之紫外光翅紋反射格式部分，共檢測北黃蝶 30 隻、豆科型黃蝶 43 隻、大戟科型黃蝶 37 隻，各型黃蝶雄蝶之紫. 17.

(22) 外光反射區域皆涵蓋前後翅大部分面積，各型間並無明顯差異(圖六)。前翅背面具紫外光反射區域與目視隻黃色區域相同；後翅背面自 Sc+R1 脈至 CuA2 脈之間區域均有紫外光反射，翅緣小部分面積不反射紫外光。雌蝶部分檢視北黃蝶樣本 32 隻、豆科型黃蝶 55 隻、大戟科型黃蝶 55 隻。其中北黃蝶雌蝶背面均無紫外光反射區域，而豆科型黃蝶與大戟科型黃蝶之雌蝶主要反射紫外光區域在前翅中室與中室至 A1+A2 脈之間(圖七)。將豆科型黃蝶與大戟科型黃蝶前翅紫外光反射區面積與前翅總面積之比值進行獨立樣本 t 檢定(Independent t test)結果有顯著差異(t=15.11459, P<0.001)。豆科型黃蝶紫外光反射面積較小，平均佔前翅面積之 0.069794±0.036262。大戟科型黃蝶紫外光反射面積較大，平均佔前翅面積之 0.196107±0.050261。. 四、基因型網狀親緣關係(hapoltype network) 分別分析各型黃蝶之核 DNA 序列 wingless、RpS2、GAPD 基因形間的關係，建立網狀親緣關係圖。wingless 基因分析 20 個樣本 40 條序列，序列長度 379 bp，包含 15 個變異位點，有 15 個基因型(圖八)；其中大戟科型黃蝶(n=12)佔兩個基因型，以 1 步之變異量與其他基因型相連；北黃蝶(n=18)及豆科型黃蝶(n=10)在 wingless 基因則無. 18.

(23) 明顯之分群情形。大戟科型黃蝶與其他兩型黃蝶間之 Fst 值皆高於 0.7，豆科型黃蝶與北黃蝶之 Fst 值則僅為 0.04(表八)。 RpS2 基因分析 21 個樣本共 42 條序列，序列長度 411bp 有 16 個變異位點，共有 15 個基因型(圖八)；大戟科型黃蝶(n=12)在 RpS2 基因網狀關係中亦包含有兩個基因型，與北黃蝶(n=18)之基因型以 1 步之變異量相連；豆科型黃蝶(n=12)有三個基因型，分別以 0 及 1 步之變異量與北黃蝶之基因型相連；北黃蝶則共有 10 個基因型。各型黃蝶間 Fst 值皆高於 0.5(表九)。在 GAPDH 基因之網狀親緣關係分析 21 個樣本共 42 條序列，序列度長 691 bp 變異位點 38 個，共有 20 個基因型(圖八)，但三個分類單元的黃蝶間並無明顯分群之關係。各型黃蝶 GAPDH 基因的 Fst 值則介於 0.07 至 0.26 間(表十)。. 19.

(24) 討論一、各型黃蝶的溫度適應與生長表現環境溫度可以影響昆蟲之體溫以及其新陳代謝速率 (Szujecki,1987)，低溫造成昆蟲體內代謝速率降低、生理失調並提高其死亡率，高溫對昆蟲生理的影響有時並非立即呈現，但到生長發育後期可能會出現不育的延遲現象或死亡。在梯溫飼養黃蝶的過程中發現食用大戟科紅仔珠的黃蝶幾乎無法存活於 15℃，而北黃蝶在 30℃ 下飼養則有許多個體產生齡期增加(幼蟲期共六齡)、無法羽化或羽化失敗之情形亦較多。雖各型黃蝶之發育起點溫度相當接近，但三型黃蝶發育之最適溫區(optimum temperature range)顯然有所差異，本研究所採樣之北黃蝶多來自中海拔地區，大戟科型黃蝶之分布除大漢山林道外則多半為台灣南部之低海拔地區。Taylor(1981)對於廣分布性昆蟲之適應提出一假說，廣布性之昆蟲為因應不同緯度之環境溫度狀況，會有不同的發育策略。推測本研究之三型黃蝶應有區域性適應(local adaptation)的現象，故欲以有效積溫及發育起點之數值檢測此三型黃蝶是否能有效區分，尚有進一步探討之空間。. 二、各型黃蝶之形態差異以典型變異分析重疊後的三型黃蝶翅形，不論是前翅或後翅的分. 20.

(25) 析結果都顯示利用大戟科為寄主的黃蝶翅形與其他兩者顯著的不同。且三型黃蝶之後翅翅形互有顯著差異，白水(2006)亦描述北黃蝶(E. mandarina)後翅外緣 CuA 脈處有明顯角度、黃蝶(E. heacbe)之後翅外緣則較圓弧無明顯之角度。因此在形態特徵上，或可利用後翅翅形做為北黃蝶、豆科型黃蝶與大戟科型黃蝶之鑑別特徵。三型黃蝶之雌蝶有紫外光反射面積大小具有差異，各型黃蝶之雄蝶皆具有大面積的紫外光反射區域，然而除北黃蝶之雌蝶背面均無紫外光反射外，其餘各型不論雌雄蝶之同型個體間反射面積大小均有相當程度之變異。Brunton & Majerus(1995)選取紋黃蝶屬(Colias)與鉤粉蝶屬(Gonepteryx)進行反射光譜之檢測，發現在同種個體間紫外光波段之反射率與譜形均有高變異，顯示紫外光反射 patterns 並非造成生殖隔離機制之一。且蝶類紫外光反射 pattern 的差異可能源自於環境、寄主以及遺傳等因素造成，惟有源自於遺傳因子所產生的反射 pattern 差異可以作為系統分類上的依據(Knüttel & Fiedler, 2000)。豆科型與大戟科型黃蝶之雌蝶雖面積比之母群體平均值有顯著差異，但在檢視個體之紫外光反射情形時，略有呈現連續性變異之情形。各型黃蝶紫外光形態上的差異是否具有族群間視覺辨識之訊息，仍有待進一步行為實驗探討。. 21.

(26) 三、網狀親緣關係圖檢視各型黃蝶之親緣關係檢視三個核基因片段結果僅 wingless 與 RpS2 片段可以將利用大戟科紅仔珠之黃蝶分為同一群，wingless 片段有北黃蝶與豆科型黃蝶共享同一基因型的情況，GAPDH 片段無法有效將三型黃蝶分群，而豆科型黃蝶及北黃蝶則使用此三個片段皆無法有效分群。大戟科型黃蝶在 wingless 與 RpS2 兩個基因之 Fst 值皆相當高，顯示利用大戟科山漆莖屬植物的黃蝶在這兩個基因與其他黃蝶族群的基因交流應是中斷的。 Narita et al.(2006)使用核 DNA tpi 片段與 Ef1α 片段檢測黃色型與褐色型黃蝶之分群關係，其中 tpi 片段可將黃色型黃蝶與褐色型黃蝶分為兩單系群，此片段在鱗翅目物種位於 Z 染色體上(Turner & Sheooaed 1979)包含一段高度變異之非編碼區(intron)，雖然對於族群間之分群效果良好，但較少使用於種級以上之親緣探討。而以 Ef1α 片段對黃色型與褐色型黃蝶進行分群，兩者互為並系群，在網狀親緣關係圖上雖褐色型黃蝶皆為同一基因形且並無與黃色型黃蝶共用，但褐色型黃蝶與黃色型黃蝶之基因型間並無變異步數之間隔。. 四、三型黃蝶之系統分類關係討論本研究以生態、形態、分子三方面對北黃蝶、豆科型黃蝶與大戟 22.

(27) 科型黃蝶進行探討，結果發現三型黃蝶適應之溫度範圍有所差異，豆科型黃蝶適應之溫度範圍最廣，高溫環境對北黃蝶之生長較為不利，而大戟科型黃蝶則無法耐受低溫。形態上各型黃蝶之後翅翅形有顯著差異，且雌蝶之背面之紫外光翅紋反射格式亦有所不同。在遺傳上，大戟科型黃蝶在兩個基因片段與另兩形黃蝶有差異，可自成一單系群。豆科型黃蝶與北黃蝶則在一個基因片段上互有差異。Fst 值顯示大戟科型黃蝶與其他兩形黃蝶之基因交流有中斷之情形。過去諸多日籍學者針對日本地區之黃蝶進行研究，提出日本地區兩型黃蝶有寄主專一性、選擇性交配、雌蟲產卵偏好、緣毛顏色差異以及核 DNA 遺傳差異等證據(Kato et al., 1992; Kobayashi et al., 2001; Yata, 2005; Nartia et al., 2006)，並將黃色型黃蝶作分類修訂給予北黃蝶(E. mandarina)之學名，然則日籍學者之研究多以使用日本地區之黃蝶為主，而日本地區之黃蝶分布因日本之南北狹長狀的緯度分布而有很大的地理分部差異。在台灣地區，三型黃蝶分布並無如此大之地理差異(山中，1972; 徐，2000)，且三型黃蝶之分布有相當程度之共域情形。邱(2003)提出台灣地區三型黃蝶有產卵偏好，對於寄主之利用亦偏好其原始寄主。莊(2006)測試發現豆科型黃蝶與北黃蝶(鼠李科型)對於其原始寄主高度忠誠，替換寄主則無法存活；大戟科型黃蝶則無法接受鼠李科桶鉤藤做為寄主，但可以利用豆科田菁且死亡率與 23.

(28) 利用大戟科紅仔珠無顯著差異。粒線體 DNA COI+COII 基因之分析則顯示大戟型黃蝶自成一單系群。綜合本研究及過去對於台灣地區黃蝶之相關研究，利用大戟科山漆莖屬植物之黃蝶族群在食性、溫度適應棲位、形態特徵、遺傳因子方面皆與北黃蝶及利用豆科植物之黃蝶有所差異。推論台灣地區利用大戟科山漆莖屬植物之黃蝶可能為一隱蔽種(cryptic species)，然而在香港、廣東地區亦有利用山漆莖屬植物之黃蝶族群，確切的分類修訂則有待進一步檢視其他地區之樣本及模式標本。. 24.

(29) 參考文獻山中正夫。1972。台灣產蝶類の分布。蝶と蛾。日本鱗翅學會。23： 36-39。白水隆。2006。日本產蝶類標準図鑑。株式会社学習研究社。67-69。邱秀婷。2003。黃蝶寄主植物偏好性分析。國立台灣師範大學生物學系碩士論文。徐堉峰。2000。台灣蝶圖鑑第二卷。國立鳳凰谷鳥園。132-134。莊玉筵。2006。綜合分子與食性證據探討黃蝶的多樣性問題。國立台灣師範大學生命科學系碩士論文。 Arnold C. Y. 1959. The determination and significance of the base temperature in a linear heat unit system. Proc. Am. Soc. Hort.Sci.74:430-445. Baltensweiler W. 1993. A contribution to the explanation of larch budmoth cycle, the polymorphic fitness hypothesis. Oecologia(Berl.) 93:251-255. Baltensweiler W. 1997.Colour polymorphism and dynamics of larch budmoth populations (Zeiraphera diniana Gn., Lep. Tortricidae). Mitteil. Schweiz. Entomol.Gesellsch. 50:12-23. Baylac M., C.Villemant and G. Simbolotti. 2003.Combining geometric morphometrics with pattern recognition for the investigation of species complexes. Biol. J. Linn. Soc. 80: 89-98. Brunton C. F. A. and M. N. Majerus. 1995. Ultraviolet colours in butterflies: intra- or inter-specific communication. Proc. R. Soc. 25.

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(35) 表一、前翅腹面地標點位置。地標點編號. 描述. 1. CuA 脈與 R 脈於翅基的交點. 2. Sc 脈與翅端的交點. 3. R1 脈與翅端的交點. 4. Rs1 脈與翅端的交點. 5. Rs2 脈與翅端的交點. 6. Rs4 脈與翅端的交點. 7. M1 脈與翅端的交點. 8. M2 脈與翅端的交點. 9. M3 脈與翅端的交點. 10. CuA1 脈與翅端的交點. 11. CuA2 脈與翅端的交點. 12. 1A+2A 脈與翅端的交點. 13. R1 脈與中室的交點. 14. Rs1 脈與中室的交點. 15. r-m 在中室的頂點. 16. M3 脈與 r-m 脈的交點. 17. CuA1 脈與中室的交點. 18. CuA2 脈與中室的交點. 19. M1 脈與 Rs 脈的交點. 20. Rs2 脈與 Rs4 脈的交點. 31.

(36) 表二、後翅腹面地標點位置。地標點編號. 描述. 1. Sc+R1 脈與翅基的交點. 2. Sc+R1 脈與翅端的交點. 3. Rs 脈與翅端的交點. 4. M1 脈與翅端的交點. 5. M2 脈與翅端的交點. 6. M3 脈與翅端的交點. 7. CuA1 脈與翅端的交點. 8. CuA2 脈與翅端的交點. 9. 1A+2A 脈與翅端的交點. 10. Rs 脈與中室的交點. 11. M1 脈與中室的交點. 12. M2 脈與中室的交點. 13. M3 脈與中室的交點. 14. CuA1 脈與中室的交點. 15. CuA2 脈與中室的交點. 32.

(37) 表三、本研究所使用之引子。基因片段. 方向. 引子名稱. 引子序列. 參考文獻. GAPDH. Forward. GAPDHf. 5' AARGCTGGRGCTGAATATGT 3'. Wanlberg & Wheat(2008). GAPDH. Reverse. GAPDHr. 5' GWTTGAATGTACTTGATRAGRTC 3'. Wanlberg & Wheat(2008). RpS2. Forward. RpS2f. 5' ATGGCNGARGARAAYTGGAAYGA 3'. Wanlberg & Wheat(2008). RpS2. Reverse. RpS2r. 5' CGGTTRGAYTTRGCAACACG 3'. Wanlberg & Wheat(2008). Wingless. Forwars. LepWg1. 5' GARTGYAARTGYCAYGGYATGTCTGG 3'. (Brower and DeSalle, 1998). Wingless. Reverse. LepWg3R. 5'ATGTTTGTAGTGGAACGATGCAAC 3'. 吳，未發表. 33.

(38) 表四、分子樣本資料。編號. 採集日期. 採集地點. 寄主植物. EuT1. 2011.VI.18. 南投縣仁愛鄉屯原. 鐵掃帚. EuT2. 2011.IV.22. 屏東縣恆春鎮龍坑. 紅仔珠. EuT3. 2010.VII.03. 高雄縣田寮鄉田寮村. 田菁. EuT4. 2011.XII.04. 南投縣仁愛鄉尖台林道. 桶鉤藤. EuT5. 2010.IX.27. 高雄縣田寮鄉田寮村. 田菁. EuT6. 2010.VII.04. 嘉義市東區. 田菁. EuT7. 2010.XI.06. 屏東縣春日鄉大漢山. 紅仔珠. EuT8. 2011.III.13. 台南縣新化鎮新化林場. 紅仔珠. EuT9. 2010.X.16. 南投縣信義鄉東埔. 桶鉤藤. EuT10. 2010.XI.06. 南投縣仁愛鄉尖台林道. 桶鉤藤. EuT11. 2011.VIII.19. 屏東縣車城鄉保力. 決明. EuT12. 2011.VIII.19. 屏東縣車城鄉保力. 決明. EuT14. 2010.XII.04. 南投縣仁愛鄉尖台林道. 合歡. EuT15. 2010.XI.07. 屏東縣春日鄉大漢山. 紅仔珠. EuT16. 2010.XI.25. 台南縣新化鎮新化林場. 紅仔珠. EuT17. 2011.IV.22. 屏東縣恆春鎮鵝鑾鼻. 紅仔珠. EuT18. 2010.VI.08. 桃園縣復興鄉上巴陵. 鐵掃帚. EuT19. 2011.X.27. 桃園縣復興鄉上巴陵. 鐵掃帚. EuT20. 2010.X.16. 南投縣信義鄉東埔. 桶鉤藤. EuT21. 2010.V.25. 南投縣仁愛鄉屯原. 鐵掃帚. EuT22. 2010.XI.09. 基隆市秋紅湖. 田菁. 34.

(39) 表五、各型黃蝶樣本前翅地標點以普氏疊合後，殘差進行多變量分析之駢對比較侯特齡氏檢定結果(n=95)。分類單元. 北黃蝶. 豆科型黃蝶. 大戟型黃蝶. 北黃蝶. 1. 0.400609. <0.001. 1. <0.001. 豆科型黃蝶大戟型黃蝶. 1. 表六、各型黃蝶樣本前翅翅緣地標點以普氏疊合後，殘差進行多變量分析之駢對比較侯特齡氏檢定結果(n=95)。分類單元. 北黃蝶. 豆科型黃蝶. 大戟型黃蝶. 北黃蝶. 1. <0.001. <0.001. 1. <0.001. 豆科型黃蝶大戟型黃蝶. 1. 表七、各型黃蝶樣本後翅地標點以普氏疊合後，殘差進行多變量分析之駢對比較侯特齡氏檢定結果(n=95)。分類單元. 北黃蝶. 豆科型黃蝶. 大戟型黃蝶. 北黃蝶. 1. <0.001. <0.001. 1. <0.001. 豆科型黃蝶大戟型黃蝶. 1. 35.

(40) 表八、各型黃蝶間 wingless 基因之 Fst 值。分類單元. 北黃蝶. 豆科型黃蝶. 大戟科型黃蝶. 北黃蝶豆科型黃蝶. 0.04001. 大戟科型黃蝶. 0.72368. 0.82051. 表九、各型黃蝶間 RpS2 基因之 Fst 值。分類單元. 北黃蝶. 豆科型黃蝶. 大戟科型黃蝶. 北黃蝶豆科型黃蝶. 0.52525. 大戟科型黃蝶. 0.65473. 0.85842. 表十、各型黃蝶間 GAPDH 基因之 Fst 值。北黃蝶. 豆科型黃蝶. 北黃蝶豆科型黃蝶. 0.26476. 大戟科型黃蝶. 0.13198. 0.07356. 36. 大戟科型黃蝶.

(41) 圖一、日本地區黃蝶之緣毛形態。A：褐色形緣毛 B：黃色型緣毛(Kato, 2000)。. 37.

(42) 圖二、地標點位置。A：前翅地標點，B：後翅地標點。. 38.

(43) 北黃蝶豆科型黃蝶 + 大戟型黃蝶. 2.4 1.6. Axis 2. 0.8. -4. -3.2. -2.4 -1.6. -0.8. 0.8. 1.6. 2.4. 3.2. -0.8 -1.6 -2.4 -3.2 -4 Axis 1. 圖三、各型黃蝶之典型變異分析圖(n=95)，前翅地標點之形狀資料經普氏疊合分析法後的殘差進行典型變異分析之結果。. 39.

(44) 北黃蝶豆科型黃蝶 + 大戟型黃蝶. 4 3 2. Axis 2. 1. -5. -4. -3. -2. -1. 1. 2. 3. -1 -2 -3 -4 Axis 1. 圖四、各型黃蝶之典型變異分析圖(n=95)，前翅翅緣地標點之形狀資料經普氏疊合分析法後的殘差進行典型變異分析之結果。. 40.

(45) 北黃蝶豆科型黃蝶 + 大戟型黃蝶. 4 3 2. Axis 2. 1. -4.8. -3.6. -2.4. -1.2. 1.2. 2.4. 3.6. 4.8. -1 -2 -3 -4 -5 Axis 1. 圖五、各型黃蝶之典型變異分析圖(n=95)，後翅地標點之形狀資料經普氏疊合分析法後的殘差進行典型變異分析之結果。. 41.

(46) 大戟型黃蝶. 豆科型黃蝶. 北黃蝶. 圖七、各型黃蝶雄蝶背面紫外光翅紋反射格式。. 42.

(47) 北黃蝶. 豆科型黃蝶. 大戟科型黃蝶. 圖八、各型雌蝶背面紫外光翅紋反射格式。. 43.

(48) A. B. C. 豆科型黃蝶大戟科型黃蝶北黃蝶. 豆科型黃蝶大戟科型黃蝶北黃蝶. 豆科型黃蝶大戟科型黃蝶北黃蝶. 圖八、各型黃蝶之基因型網狀親緣關係圖。A：wingless 基因，B： RpS2 基因，C：GAPDH 基因。 44.

(49)