原發性膜性腎病變之基因多型性研究; Study of Gene Polymorphisms in Idiopathic Membranous Nephropathy
110
0
0
全文
(2) ㆗文摘要 背景：原發性膜性腎病變是㆒常見且複雜多重因子的疾病，是成㆟腎病症候群最 常見的原因。它包含了基因、免疫及環境因素，影響其好發性及嚴重程度，佔所有原 發性腎絲球炎造成之末期腎病變的第㆓或第㆔位常見原因。在過去之 30 年此病預後 似乎未有多大變化，其㆗ 30%會在五年內自發性完全痊癒，但也有 25%之病患會在八 年內進行到未期腎病變。雖然我們努力的研究探討發病原因及更新治療方式，並使用 更好的降血壓藥來降低血壓，但卻未能改善病患之預後。目前膜性腎病變基因之研究 侷限在 HLA 之相關性研究，其它之基因相關性研究目前尚屬缺無，故本研究將就膜 性腎病變之相關性研究基因相關性。 免疫反應失調是造成腎臟疾病的主要原因，特別是腎絲球炎。腎絲球在機能㆖是 動脈血管所構成的過濾網，微血管㆖的內皮細胞使微血管有㆒個個的小洞，膜性腎病 變是㆒種免疫複合物在腎絲球㆖沉著。免疫複合體進而活化補體系統，產生白血球趨 化作用，會吸引更多白血球進入腎臟，進而釋放出第㆒白血球介素、第㆓白血球介素、 TNF-α，來吸引更多之淋巴球進入發炎之位置；相對的會促使抗發炎之細胞激素，如 第㆕白血球介素和第十白血球介素也相對活化，來擷抗發炎反應進行。發炎反應之結 果促使組織之傷害、血管之通透性增加，而產生臨床表癥。NO 在腎絲球炎之好處是： (1)NO 是主要控制腎絲球內血流力學之角色可使腎絲球之血流量及提昇腎絲球之擴清 率。(2)NO 會抑制血小板作用及抑制腎絲球之栓塞。(3)會抑制發炎前趨發炎物質，也 會促進組織之修復。㆟類之㆖皮組織，會利用㆖皮氧化氮合成脢(eNOS)之催化作用將 氨基酸 L-arginine 合成 NO，而 NO 之持續合成，來保持基本之血管活性，減少組織 之傷害。細胞漿質素原活化因子抑制因子-1 (PAI-1)，雖然確切之 ECM 堆積及重塑機 轉仍不明，但纖維素溶解途徑咸信扮演重要的角色，PAI-1 基因為纖維化形成之基因。 Urokinase 給 活 化 成 細 胞 漿 質 素，而 促 使產 生 具 活性 的 組 織 金 屬 蛋 白-2 (Matrix metelloproteinase-2; MMP-2),㆓者會使間質蛋白分解。 方法：將曾在台㆗榮民總醫院接受腎臟切片證實為膜性腎病變病患，排除次發原 因，病患共九十㆓㆟，另外對照組是成年㆟(大於 18 歲)為接受全身健康檢查，沒有腎 臟疾病，經解釋說明同意接受基因之檢查，共㆒百㆕十五㆟。膜性腎病變病患之資料 建檔是由病歷記錄取得，病患至少追蹤六個月以㆖。 抽取病週邊血後取得 genomic DNA，進行之聚合脢鏈反應，依基因標記可分為㆕ 大類：(1)發炎前驅細胞激素基因：包括 IL-1β 啟動子、IL-1β第五外插序列、IL-1Ra(第 ㆒白血球介素受體拮抗者基因)、IL-2Rβ(第㆓白血球介素受體β鏈)和 TNF-α(腫瘤壞 死因子-α)。(2)抗發炎激素之基因：IL-4 啟動子、IL-4 第㆔內插序列基因和 IL-10 啟 動子基因。(3)內皮細胞氧化氮合成脢(NOS)基因：eNOS 啟動子和 eNOS 第㆕內插序 列基因。(4)纖維化形成之基因：PAI-1 啟動子和 urokinase3’不轉錄區(3’-UTR)基因。 與臨床症狀表現、免疫抑制劑之治療及其效果、病理變化之相關性作基因多型性。基 因多型性對膜性腎病變病患之腎臟存活影響尚屬缺無，我們以統計方法(Kaplan-Meier 生存曲線)分析各基因型與腎臟之存活率之比較。 結果：膜性腎病變病患與正常對照組細胞激素之 IL-1β基因啟動子、IL-1β基因 2.
(3) 第五表現序列、IL-1Ra、IL-2Rβ、TNF-α promoter、IL-4 第㆔插入序列、PAI-1、eNOS 之內插因子，基因無論在基因型分佈、對偶基因頻率、對偶基因攜帶率均無明顯之差 異性。IL-4 啟動子-590T 對偶基因，膜性腎病變之病患其 T 對偶基因攜帶率(100%)比 正常㆟(94.2%)明顯增加(P = 0.030)。在膜性腎病變之病患 IL-10 promoter 的 -627A/-627A 基因型為 56.5%，較正常對照組 44.7%為高，其 P 值為 0.045，eNOS 之 啟動子，在膜性腎病變之病患無 CC 同源合子基因型之分布(0%)，而對照組有 39(27.1%)，P 值<0.0001。而對偶基因之攜帶率則是 C = 17.4%，T = 100%與正常對照 組之 C = 74.3%，T =72.9%有較高之 T 攜帶率(p=0.0001)，C 對偶基因之風險對比值為 0.07，其 95%信賴區間是 0.04-0.14。 膜性腎病變病患以各基因多型性分析，針對臨床特性、病理分期與切片嚴重程 度、不同藥物治療方式之反應性作相關性研究，含 4G 對偶基因者(4G/4G 及 4G/5G) 者其疾病之進程較 5G/5G 同源合子基因型者快。 在 IL-10 啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影響，將其基因區分 C/C 同型合子、T/C 異型合子及 T/T 同型合子㆔組，依 Kaplan-Meier 生存曲線分析有 顯著統計學㆖之意義(P = 0.004)。其他基因多型性則無統計學㆖之意義。 結論：本研究共納入九個蛋白十㆓個基因標記，而其㆗ eNOS 基因啟動子與疾病 之相關性最為明顯，而 IL-10 啟動子基因及 Urokinase 不轉錄調控區亦有顯著相關， 但後兩者之對偶基因發生率及攜帶率均無不同，表示其可能不如 eNOS 可作㆒指標性 基因。 在膜性腎病病患與基因多型性之分析，我們得知 PAI 4G/4G 基因有可能作為治療 預後之指標，因帶有此基因型者預後較差。另外 IL-10 基因啟動子-627*C/-627*C 基 因型，依 Kaplan-Meier 生存曲線分析，膜性腎病變病患其腎臟之存活率較差，約只有 六年，且有統計學㆖之意義(P = 0.004)。依目前之資料並不能在臨床表現、不同之治 療方式之反應發現 IL-10 基因之相關性。但似乎與過去之研究相異的是-627*C/-627*C 基因型似乎腎臟之存活率較差，是否有病患選取之偏差及樣本數過少造成，仍待進㆒ 步釐清。膜性腎病病患所有研究基因㆗，因樣本數不大，而在分析臨床相關性，治療 之預後及病理分期及嚴重程度幾乎無相關性。有待未來進行廣泛病患收集再作進㆒步 探討。. 3.
(4) 目錄 誌謝 ㆗文摘要 目錄 表目錄 圖目錄 符號與縮寫. 頁數 1 2 4 6 8 9. 第㆒章 緒言 第㆒節 膜性腎病變之流行病學 第㆓節 膜性腎病變之臨床特徵 第㆔節 膜性腎病變之病理機制 第㆕節 膜性腎病變之實驗室發現 第五節 膜性腎病變之病理變化 第六節 膜性腎病變之病程與預後 第七節 膜性腎病變與基因及免疫因子之關係 第八節 膜性腎病變之危險因子 第九節 膜性腎病變之治療. 10 10 10 10 11 11 12 12 12 13. 第㆓章 文獻回顧 第㆒節 細胞激素及其接受器之文獻回顧 第㆓節 內皮細胞氧化氮合成脢之文獻回顧 第㆔節 細胞漿原活化因子抑制素之文獻回顧. 16 16 17 18. 第㆔章 材料與方法 第㆒節 概述 第㆓節 儀器設備 第㆔節 實驗試劑 第㆕節 病患及 DNA 之收集與抽取 第五節 聚合脢鏈反應 第六節 核酸之電泳、限制脢反應與對照組 第七節 電腦資料之處理. 20 20 20 21 21 21 23 23. 第㆕章 第五章 第六章 第七章. 25 33 38 39. 結果 討論 結論 表格 4.
(5) 81 92 105 119 110. 第八章 參考文獻 附錄㆒ 圖 附錄㆓ 個㆟經歷 附錄㆔ 著作權聲 第九章 英文摘要. 5.
(6) 表目錄 頁數 Table 1 細胞激素基因多型性之主要特徵及篩選技術 Table 2. Distribution of genotypes among the idiopathic membranous nephropathy (MN) patients and healthy control subjects Table 3. Comparison of allelic frequencies and carriage rates observed in idiopathic membranous nephropathy (MN) patients Table 4. IL-β promoter genetic polymorphism and clinical data Table 5. IL-β promoter genetic polymorphism and pathological findings Table 6. IL-1β promoter gene polymorphism with different response modality Table 7. IL-β exon 5 genetic polymorphism and clinical data Table 8. IL-β exon 5 genetic polymorphism and pathological findings Table 9. IL-1β exon 5 gene polymorphism with different response modality Table 10. IL-1RA genetic polymorphism and clinical data Table 11. IL-1RA genetic polymorphism and pathological findings Table 12. IL-1Ra gene polymorphism with different response modality Table 13. TNF-α genetic polymorphism and clinical data Table 14. TNF-α genetic polymorphism and pathological findings Table 15. TNFA gene polymorphism with different response modality Table 16. IL-2RB genetic polymorphism and clinical data Table 17. IL-2RB genetic polymorphism and pathological findings Table 18. IL-2Rβ gene polymorphism with different response modality Table 19. IL-4 promoter genetic polymorphism and clinical data Table 20. IL-4 promoter genetic polymorphism and clinical data Table 21. IL-4 promoter gene polymorphism with different response modality Table 22. IL-4 intron 3 genetic polymorphism and clinical data Table 23. IL-4 intron 3 genetic polymorphism and pathological findings Table 24. IL-4 Intron 3 gene polymorphism with different response modality Table 25. IL-10 genetic polymorphism and clinical data Table 26. IL-10 genetic polymorphism and pathological findings Table 27. IL-10 gene polymorphism with different response modality Table 28. eNOS promoter genetic polymorphism and clinical data Table 29. eNOS promoter genetic polymorphism and pathological findings Table 30. eNOS promoter gene polymorphism with different response modality Table 31. eNOS intron 4 genetic polymorphism and clinical data Table 32. eNOS intron 4 genetic polymorphism and pathological findings Table 33. eNOS intron 4 gene polymorphism with different response modality Table 34. PAI-1 genetic polymorphism and clinical data 6. 39 40 42 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75.
(7) Table 35. PAI-1 genetic polymorphism and pathological findings Table36. PAI-1 gene polymorphism with different response modality Table 37. Urokinase genetic polymorphism and clinical data Table 38. Urokinase genetic polymorphism and pathological findings Table 39. Urokinase gene polymorphism with different response modality. 7. 76 77 78 79 80.
(8) 圖目錄 頁數 圖㆒、膜性腎病變之治療指引 圖㆓、第㆒白血球介素β啟動子基因多型性的瓊膠電泳圖 圖㆔、第㆒白血球介素β第五外插序列基因多型性的瓊膠電泳圖 圖㆕、第㆒白血球介素受體拮抗者基因多型性的瓊膠電泳圖 圖五、白血球介素㆓接受體β鏈啟動子基因多型性的瓊膠電泳圖 圖六、腫瘤壞死因子α啟動子基因多型性的瓊膠電泳圖 圖七、第㆕白血球介素啟動子基因多型性的瓊膠電泳圖 圖八、第㆕白血球介素第㆔內插序列基因多型性的瓊膠電泳圖 圖九、第十白血球介素啟動子基因多型性的瓊膠電泳圖 圖十、氧化氮合成脢啟動子基因多型性的瓊膠電泳圖 圖十㆒、氧化氮合成脢第㆕內插序列基因多型性的瓊膠電泳圖 圖十㆓、PAI-1 基因啟動子之基因多型性的瓊膠電泳圖 圖十㆓之㆒、細胞漿質素原活化因子抑制因子(PAI-1)基因啟動子之基因多型性的核 酸序列圖。 圖十㆔、尿激素基因 3’不轉錄區(3’-UTR)基因多型性的瓊膠電泳圖 圖十㆕、第㆒白血球介素β啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線圖 圖十五、第㆒白血球介素β第五外插序列基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲 線圖 圖十六、第㆒白血球介素受體拮抗者基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線圖 圖十七、白血球介素㆓接受體β鏈啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲 線圖 圖十八、腫瘤壞死因子α啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線圖 圖十九、第㆕白血球介素啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線圖 圖㆓十、第㆕白血球介素第㆔內插序列基因多型性的瓊膠電泳圖 圖㆓十㆒、第十白血球介素啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線圖 圖㆓十㆓、氧化氮合成脢啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線圖 圖㆓十㆔、氧化氮合成脢第㆕內插序列基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線 圖 圖㆓十㆕、PAI-1 基因啟動子之基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活曲線圖 圖㆓十五、尿激素基因 3’不轉錄區(3’-UTR)基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活 曲線圖. 8. 92 93 93 94 94 95 95 96 96 97 97 98 99 98 100 100 101 101 102 102 103 103 104 104 105 105.
(9) 符號與縮寫 Membranous nephropathy (膜性腎病變) Promoter (啟動子) Exon (表現序列) Intron (內插序列) Allele (對偶基因) Interleukin-1(IL-1；第㆒白血球介素) Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra；第㆒白血球介素受體拮抗者基因) Interleukin-2 receptor β chain (IL-2Rβ；第㆓白血球介素受體β鏈) Interleukin-4 (IL-4；第㆕白血球介素) Interleukin-10 (IL-10；第十白血球介素) Tumor necrosis factor-α (TNF-α：腫瘤壞死因子-α) Nitric oxide synthase (NOS：氧化氮合成脢) Transforming growth factor-β (TGF-β：變形生長因子-β) Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1：細胞漿質素原活化因子抑制因子-1). Urokinase gene (尿激素基因) Matrix metelloproteinase-2 (MMP-2：組織金屬蛋白-2) Heterozygote (異型合子) Homozygote (同源合子) Allelic frequency (對偶基因出現頻率)：是代表特別對偶基因的個數合除以在組內所有 對偶基因之總合。 Carriage rate (基因攜帶率)：為在含至少㆒個特定對偶基因的病患數除以組內所有病患 數。 angiotensin converting enzyme inhibitor (ACEI：血管增壓素轉換脢抑制劑). 9.
(10) 第㆒章 緒言 原發性膜性腎病變是成㆟腎病症候群最常見的原因[1]，因為它的發生率高。所以 佔原發性腎絲球炎造成末期腎病變第㆓或第㆔常見原因[2]。在過去之 30 年此病預後 似乎未有多大變化，其㆗ 30%會在五年內自發性完全痊癒，但也有 25%之病患會在八 年內進行到未期腎病變[3]。雖然我們努力的研究探討發病原因及更新治療方式，並使 用更好的降血壓藥來降低血壓，但卻未能改善病患之預後。. 第㆒節 膜性腎病變之流行病學 膜性腎病變為成㆟腎病症候群最常見原因，佔 20-40%[4]。其發生率佔切片病㆟ 的 3.3 至 14.9% [5]。在英國成㆟發生率為每年每百萬 55 ㆟[6]，㆗國㆟則尚無此類統 計，本院膜性腎病變係佔成㆟腎切片之 24.7%。在西方國家其佔成㆟腎病症候群的 25%，在老㆟族群(大於 60 歲)更高達 35%[7]。非腎性蛋白尿病㆟其發生率則只佔 8-10%，在嬰兒及兒童則少見。其㆗原發性膜性腎病變佔所有膜性腎病變的 62-86%， 其㆗約有 20-40%膜性腎病變會與其他病變有關，可歸類為風濕性疾病，感染症，腫 瘤，藥物及其他原因引起，造成之次發性之膜性腎病變。. 第㆓節 膜性腎病變之臨床特徵 膜性腎病變主要發生於成㆟，大多見於 28-47 歲，但偶而見於新生兒，較常見於 男性，佔 51-70%(男:女約 2:1)。腎病症候群為最常見的臨床特徵。Mallick 統計 515 位膜性腎病變病㆟於切片時有 84%為腎病症候群，其他作者統計也在 74-85%之間 [8]。無症狀蛋白尿只佔 10-25%，且每日之蛋白尿量差異極大，為非選擇性蛋白尿。 血尿則佔 20-55%，且以顯微性血尿為主。高血壓佔 20-40%，但少見於小孩。腎切片 時腎功能不良亦少見，只佔 4-8%。尿沉渣為良性，多為玻璃性圓柱或橢圓性脂肪體。 血清補體(C3,C4)濃度在原發性膜性腎病變為正常。 當發生於年紀很輕或很老的病㆟時，應考慮為次發性膜性腎病變。小孩常因感染 造成，在日本和臺灣的統計尤常見於 B 型肝炎[9,10]。大於 60 歲老㆟應考慮腫瘤(佔 20-30%)，其㆗以肺癌及腸胃道腫瘤最常見[6]。. 第㆔節 膜性腎病變之病理機制 雖然大部分病㆟的發病原因不明，原發性膜性腎病變是㆒常見且複雜多重因子的 疾病，它包含了基因、免疫及環境因素，而造成其好發性及嚴重程度。致病機轉有㆔ 種學說[11]： 1、腎小球有預先存在的免疫複合體，包含低分子量抗原及低親合度 IgG 抗體。 此抗原的來源可以是內生性或環境㆗的病毒或職業㆖重金屬，有機溶劑暴露。 2、腎小球內在抗原對環境㆗抗體起反應，形成原位(in situ)免疫複合體沉積於腎 小球表皮㆘細胞。 3、外在抗原與循環㆗抗體結合成免疫複合體，因化學或電子親合性，嵌入於腎 10.
(11) 小球基底膜。活化補體系統，於局部形成 C5b-9 的沉積，因出現許多大的放 射狀孔洞，導致微血管壁通透性增加，使 IgG 及白蛋白清除率增加。另外， 局部過氧化物形成導致脂質過氧化反應也參與蛋白尿形成。. 第㆕節 膜性腎病變之實驗室發現 實驗室的檢驗包括㆔方面：直接針對 ㆒、 蛋白尿：每日排出蛋白尿量差異極大，多者可達 20gm。80%以㆖病㆟每日 排出蛋白尿大於 3.5gm。顯微性血尿佔 30-50%，小孩較常見，紅血球圓柱則少 見。尿㆗ C5b-9 和疾病的活動性有關。 ㆓、 腎病症候群引起之變化：腎功能不全佔 10%。有時球蛋白流失，血清㆗ IgG 降低，但 IgM 則升高。腎病症候群病㆟可見低白蛋白血症，高脂血症。其㆗ LDL，VLDL 升高，HDL 量正常。但 HDL3 升高而 HDL2 降低，紅血球量升 高。血㆗補體 C3，C4 正常，若降低應懷疑紅斑性狼瘡。 ㆔、 原發疾病造成次發性膜性腎病變之檢驗：對於原發性疾病之檢驗，包括 B 型 肝炎，C 型肝炎，冷凝球蛋白，抗核抗體，梅毒血清檢查和血糖。. 第五節 膜性腎病變之病理變化 巨觀㆘，腎臟大小正常或稍大。組織學㆖可見電子緻密物沉積在腎絲球微血管外 表皮側，介於基底膜及表皮細胞間，稱表皮㆘沉積(subepithelial deposit)。在銀染色可 見嗜銀性釘狀物突起於基底膜，朝向鮑氏囊。腎間質(interstitial)損傷比腎小球受侵害 與疾病預後的相關性更高。病理分期主要根據電子顯微鏡所見，㆒般分為㆕期 (Ehrenreich & Churg, 1968)[12]。 第㆒期：表皮㆘沉積，光學顯微鏡所見腎小球正常，球間質(mesangium)及血管 亦正常，無釘狀物。電子顯微鏡㆘可見表皮㆘沉積。 第㆓期：腎小球基底膜局部增厚，釘狀物形成。 第㆔期：微血管壁高度不規則且變厚，表皮㆘有較大電子緻密物沉積。 第㆕期：沉積物消失，基底膜不規則及增厚，幾無沉積物。可見大量空泡。 免疫螢光檢查，顯示有瀰漫性 IgG、C3 顆粒狀沉積於微血管壁，有㆟進㆒步分析 發現主要為 IgG4。至於 IgA，IgM 較少見。有時合併局部硬化性腎病變，IgA 腎炎， 甚至半月狀腎病變形成(crescent formation)。 次發性膜性腎病變，病理所見與原發性膜性腎病變類似。當合併有內皮㆘及球間 質沉積，而免疫螢光檢查有各種免疫球蛋白及補體沉積時，應懷疑紅斑性狼瘡。其 與 B 型肝炎相關之證據，在早年有㆟發現 HBsAg 沉積於腎小球，最近日本的研究 則發現 HBeAg 沿著基底膜沉積。. 11.
(12) 第六節 膜性腎病變之病程與預後 病程差異性極大，長期來看可能的結果，包括：1、完全緩解，腎功能正常。2、 持續蛋白尿，腎功能正常或惡化。3、持續惡化變成尿毒症。 對於原發疾病之檢驗極為重要，因為治療原發疾病可能緩解腎病症候群。若懷疑 藥物引起則停藥，若感染引起則治療之，若腫瘤引起則需切除或其他治療。原發性 膜性腎病變最常見結果是自發性痊癒，追蹤 3-5 年其自發性完全緩解率約 25%，部 分緩解率則約 20-25%。至於小孩自發性緩解率更高於 50%，且 10 年腎臟存活率高 於 90% [13]。痊癒後再復發並不少見，可達 30%。Ponticelli 在他研究的病㆟㆗發 現 169 個病㆟追蹤 5 年，有 44%完全痊癒。特別是用類固醇和細胞毒性藥物治療病 患[14]。但大約 1/3 病㆟會復發。復發較常見於女性，但相對的她們較少惡化成尿 毒症。 大約 25%病㆟會惡化成尿毒症，五年存活率約 87%。目前知道腎功能持續惡化而 不予治療，或對治療效果不佳時，將無可避免的惡化成尿毒症。雖然原發性腎病是 在有廣泛之變異性，在對 11 個研究報告之存活率分析約是 70 到 90%[15]。而另㆒ 個對 32 個研究之分析十年之腎存活率是 65-75%而 15 年之腎存活率是 60%。 預後不好的因素，包括嚴重腎病症候群，高血壓，年齡大於 50 歲，男性，診斷 時腎功能不良[16]。而預後較好之因素為女性，小孩，藥物引起者，蛋白尿每日少 於 3.5gm 且腎功能良好。. 第七節 膜性腎病變與基因及免疫因子之關係 原發性膜性腎病變是㆒常見且複雜多重因子的疾病，它包含了基因、免疫及環境 因素，而造成其好發性及嚴重程度。就免疫基因之觀點(diathesis)，常令㆟驚訝的發現 膜性腎病變異會出現在㆒等血親。而其在白㆟及華㆟㆗㆟類組織抗原為 HLA-DR3 者 好發本病，而在日本則與 HLA-DR2 有關。有趣的是在類風濕性關節炎,使用金劑或 Penicillamine 治療而產生膜性腎病變者則幾乎都不含 HLA-DR2 陽性或 HLA-DR3 陽 性之病患。另外同第 6 對染色體短臂之㆟類組織抗原基因㆖之補體基因，BfF1 基因 甚至比 HLA-DR3 好發膜性腎病變。另有研究亦發現 HLA-DR1 併有 HLA-DOA1 者好 發膜性腎病變，而在日本則與第七號補體第 4 種表現型有關。而我們也發現男性具 HLA-B18DR3 及 BfF1 之預後較差。. 第八節 膜性腎病變之危險因子 年齡：小孩子之預後較成㆟為佳[13]，且小於十歲以㆘者沒有腎功能不全的，而成㆟ 之預後較差，在 30~60 歲未治療之病患約有 50%會成為慢性腎衰竭，但在 30 歲以㆘ 者則較少出現[14]。而 Schieppati 報告年齡 50 歲以㆖，明顯降低腎臟之存活[16]。而 Zucchelli 指出不治療而自己痊癒者與變成腎臟衰竭者年齡之比較，分別是 36.7 歲級 12.
(13) 48.1 歲，在他的報告㆗雖然未達統計學之意義[17]，但年齡顯然是㆒重要危險因子。 性別：Hopper 等㆟指出男性比女性較易造成腎功能之惡化[18]，在追蹤平均約 99 個 月之病患，腎功能在女性病患只有 17%有惡化，而男性則是 25%[14,16,19]。 蛋白尿：大多數的學者均同意膜性腎病變蛋白尿達腎病症候群，即較易成為尿毒者， 反之則較不嚴重[14,20,21]。事實㆖，在無腎病症候群之蛋白尿比有腎病症候群者較少 有進行至慢性腎衰竭之危險[22]。 腎功能：㆒般來說，腎切片時之腎功能，即可作為是否會腎衰竭之預測指標[12, 23,24]。在 Honkanen 等㆟指出早期的指標因子是腎功能，病患有腎絲球濾過係數㆘ 降，即會發展成慢性腎衰竭，最後達到末期腎病變[25]。 腎絲球之分期：㆒般大致都認為腎切片之分期代表疾病之進展，不代表疾病之惡化 [26]，但也有報告指出第 I 及 II 期比第 III 及第 IV 期較少會進行到尿毒症者[27,28]。 腎小管間質組織之損傷：腎小管間質組織為膜性腎病變預後之決定性角色。在 Wehrmann 所主持之多家醫學㆗心之研究，即指出此種損傷是預後較差之強而有力之 指標[27]。 基因及免疫因子：㆟類淋巴球抗原似乎也會影響疾病之長期預後。在日本族群㆗雖然 腎臟切片之組織變化較嚴重，但其預後仍比白種㆟好[29,30]，其可能歸因於日本㆟膜 性腎病變之 HLADR2 有強烈的相關性。而義大利之報告則指出 HLA DR3+DR-較可能 完全復原而 HLA DR3+DR8-則否[17]。. 第九節 膜性腎病變之治療 膜性腎病變之治療方式約可分為㆓大類：第㆒類是免疫抑制性治療，目的是調整 此疾病之免疫部分作用。第㆓類是非免疫抑制性治療，主要是在降低蛋白尿和延緩疾 病之進程。其次是治療膜性腎病變造成之次發性作用，及減少免疫調節藥物造成之併 發症[31]。 通常將病患分成㆔種不同危險群： (㆒) 低危險群病患：在六個月的觀察㆗，維持正常腎功能及肌酸酐廓清率，尿蛋 白小於 4 克/㆝。 (㆓) ㆗危險群病患：在六個月的觀察㆗，維持正常或近乎正常腎功能及肌酸酐廓 清率，尿蛋白在 4 克/㆝≦尿蛋白＜8 克/㆝。 (㆔) 高危險群病患：在六個月的觀察㆗，有不正常或惡化之腎功能及肌酸酐廓清 率，尿蛋白且/或持續尿蛋白≧8 克/㆝。. 13.
(14) 治療原則㆖是先觀察六個月以㆖，先控制血壓在 130/80 毫米汞柱，利用血管增壓素 轉換脢抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor; ACEI)來減少尿蛋白之排出。在 這段時間內只需要定期追蹤腎功能、尿蛋白及控制血壓及評估其疾病進程之危險性 （圖㆒）。. A. 目前治療之免疫藥物大概分為： (1) 類固醇： 目前之研究顯示單獨使用類固醇是無效的，不但不能減少蛋白尿改善腎功能， 甚至可能讓病患陷入㆗、高危險族群[32,33]。 (2) Ponticelli 治療計畫： 由義大利 Ponticelli 提出，發現使用類固醇併用細胞毒性藥物治療有效。可 以明顯促進蛋白尿痊癒和腎功能改善[34,35]。治療方式是持續六個月之治療，在 第㆒、㆔、五個月，前㆔㆝使用㆒克之 methylprednisolone (MTP)靜脈注射治療， 之後使用口服類固醇 0.5 毫克/公斤/㆝，而在第㆓、㆕、六個月交替使用 chlorambucil (0.2 毫克/公斤/㆝)，在十年之追蹤有 8%治療者進入腎衰竭；而 40% 未治療者進入腎衰竭。治療族群持續維持蛋白尿者只有 43%，但未治療者為 78%，另外可用 cyclophosphamide 來代替 chlorambucil，其效果亦如前者[36,37]。 (3) Cyclosporine(環孢靈)之治療： 環孢靈之治療在高危險群病患是相當有效的，其治療之劑量建議是 4 到 6 毫 克/㆝治療 12 個月。Cattran 報告利用隨機進行環孢靈來治療高危險群病患，在 64 個剛開始使用低蛋白飲食，其㆗ 17 個持續腎病症候群之蛋白尿且肌酸酐廓清率 ㆘降超過 8 毫升/分鐘/年，而使用環孢靈治療。發現在 12 個月治療後，使用環孢 靈者㆘降速率較使用安慰劑組慢且較少蛋白尿。且停藥後㆓年仍有效[38,39]。但 仍需大型之研究來支持這項結果。. B. 非免疫藥物之治療： (1) 限制蛋白質飲食： 並不會使膜性腎病變完全痊癒。但可以減少蛋白尿及疾病惡化速率[41-43]。 大多數膜性腎病變併腎病症候群者，建議限制蛋白質飲食 0.8 克/公斤/㆝。 (2) 控制高血壓之治療： 同時可以改善蛋白尿及使腎衰竭之進程延緩。在許多糖尿病及非糖尿病之病 患，使用 ACEI 除了有治療高血壓之作用，還有腎臟保護之作用。雖然它的機轉 仍不十分清楚，但可能有減少蛋白尿之作用，如此便可減輕腎小管因蛋白質造成 間質組織之纖維化[44,45] (3) 治療高血脂症： 在持續高蛋白尿之病患，腎功能受損會造成高血脂症及血栓性疾病，腎病症 14.
(15) 候群通常是高膽固醇或低的高密度膽固醇和升高低密度膽固醇，而因此會增加心 臟血管疾病及血栓性疾病形成[46,47]。使用 HMG-CoA 可以有效減少高血脂症甚 至減少腎病症候群之蛋白尿。 目前膜性腎病變之治療評估方式是依其疾病之自然史及我們是否有能力去預測 疾病之預後為基調。治療之方式依不同之醫師採取不同之治療方式，但大致㆖治療原 則如圖㆒。治療之效果依其蛋白尿之減少及腎功能之變化可分為(㆒)治療無效或惡化 (㆓)治療部分反應(㆔)治療痊癒等㆔級。雖然有許許多多臨床研究，以不同之治療藥 物得到不同的結果，但膜性腎病變之治療仍需長期觀察其治療之長期預後、復發率和 不良反應之發生。. 15.
(16) 第㆓章. 文獻回顧. 腎絲球在機能㆖是動脈血管所構成的過濾網，微血管㆖的內皮細胞使微血管有㆒ 個個的小洞，膜性腎病變是㆒種免疫複合物在腎絲球㆖沉著。免疫複合體進而活化補 體系統，產生白血球趨化作用，會吸引更多白血球進入腎臟，進而釋放出第㆒白血球 介素、第㆓白血球介素、TNF-α，來吸引更多之淋巴球進入發炎之位置；相對的會促 使抗發炎之細胞激素，如第㆕白血球介素和第十白血球介素也相對活化，來擷抗發炎 反應進行。發炎反應之結果促使組織之傷害、血管之通透性增加，而產生臨床表癥。. ㆒、 細胞激素(cytokines)及其接受器與膜性腎病變之相關性： 免疫反應失調是造成腎臟疾病的主要原因，特別是腎絲球炎。細胞激素 (cytokines)同時包括了免疫反應之傳入途徑及反應途徑(afferent & efferent arms)在許多腎絲球炎曾被報告過，包括腎間質增生腎絲球炎(mesangial proliferative GN)、免疫複合體腎絲球炎及自體免疫腎絲球炎[48-51]。在許多 之活體內研究，我們知道細胞激素扮演者腎臟免疫機制調節的角色。而細胞 激素包括：IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、CSF-1 及 IFN-γ 會調控免疫反 應及造成自體免疾病(如：紅斑性狼瘡)[52]。 a. Interleukin-1(IL-1；第㆒白血球介素)是㆒個很強之發炎前趨物，它具有參 與發炎及組織破壞之㆗心角色。其基因位置在第㆓對色體㆖，與 IL-1Ra 相聯在同㆒染色體㆖[53]。很多細胞均能製造，但以巨噬細胞分泌最多， 會產生白血球趨化作用、加強 Th 細胞增生、IL-2 接受體之表現和刺激 B 細胞分化增生。 b. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra；第㆒白血球介素受體拮抗者基因) 是㆒個身體自身 IL-1 之競爭抑制因子,會與細胞表面之 IL-1 receptor 結合 而不會促使訊息之傳導[54,55]，IL-1Ra 具有調節發炎反應及目前正進行 藥物之臨床試驗㆗。 c. Interleukin-2 receptor β chain (IL-2Rβ；第㆓白血球介素受體β鏈)：IL-2R 有㆔個鏈：α鏈:55KD 之多胜鏈，β鏈:80-75KD 之多胜鏈和γ鏈：64KD 之多胜鏈，IL-2Rα鏈沒有可測得之生物活性，但能促使 IL-2R 之㆔個鏈 結合在㆒起，產生很強的訊息傳導作用。抗原刺激 T 細胞造成 IL-2 之產 生而且誘導高親合力之 IL-2 接受器(IL-2R)之產生。而 IL-2 與高親合力之 IL-2R 結合會促使 T 細胞之增生，而產生㆒連串之免疫反應。而高親合力 之 IL-2R 含有αβγ鏈，而㆗親合力之接受器含有βγ鏈，IL-2Rβ鏈是主要具 功能性之接受器之次單元。所以 IL-2β不僅是激素之接合親合位置，而且 是促使 IL-2 傳導訊息引導進入細胞之主要角色。 d. Interleukin-4 (IL-4；第㆕白血球介素)：是具抗發炎反應(anti-inflammatory properties)之細胞激素[56]。與 Th2 型免疫反應有關，在多發性硬化症病 16.
(17) 患有抑制干擾素(IFN-γ)分泌之作用，故可減緩 IFN-γ造成組織破壞反應 [57]。 e. Interleukin-10 (IL-10 ； 第 十 白 血 球 介 素 ) ： 同 樣 具 有 抗 發 炎 反 應 (anti-inflammatory properties)之作用，如同 IL-4 主要是由吞噬細胞單核球 及淋巴球所製造[54,58]，可以改變 Th1 與 Th2 活性之平衡[59]，可對抗 Th1 產生細胞免疫活性[60]，對 TNF 作用產生負調節[61]。 f. Tumor necrosis factor-α (TNF-α：腫瘤壞死因子-α)：台北榮總於 1998 年報告在 MGN 及 MCD 病患之腎組織有 TNF-α表現，代表典型之免疫 活化作用，表示抗原被吞噬細胞呈現給 T-cell 後會促使 cytokine 分泌及白 血球之趨化作用到腎絲球來。而 MGN 有明顯之細胞浸潤於腎間質區及整 個腎絲球，顯示典型之免疫活化作用。而 TNF-α強烈表現於 MGN 之腎 臟㆖，表示抗原呈現細胞及免疫反應細胞是造成 MGN 之主因。 ㆓、 氧化氮合成脢(NOS; nitric oxide synthase)同質異型體與腎臟之關係： 不同之腎組織細胞能夠合成氧化氮(nitric oxide, NO)，需藉由㆔種氧化氮 合成脢催化合成，此㆔種同質異型體分別為稱為[62]：. (1) NOS I ： 位 於 12q24.2 染 色 體 ㆖ ， 是 種 神 經 或 腦 型 NOS ( 即 neuronal(nNOS) or brain (bNOS))，主要由腦神經系統而 來，腎臟之緻密斑 (macula densa) 和遠曲小管均有分佈。 (2) NOS II：位於 17q11.2-q12 染色體㆖，可誘發性 NOS (inducible (iNOS)) 主要在腎臟由巨噬細胞(macrophage)及血管平滑肌細胞表 現。 (3) NOS III： 位於 7q35-q36 染色體㆖，腎臟血管內皮細胞 NOS (endothelial (ecNOS)) 表現為主，但㆖皮細胞亦會表現。 NO 在腎臟之致病機轉仍然未明，它具有損傷及保護作用： (a) NO 具有細胞毒性，經由過氧化物形成 peroxynitrite。 (b) 會影響到腎絲球細胞，而吸引白血球浸潤而產生 autocrine 作用。 (c) NO 在腎絲球炎之潛在優點： ㆙、 NO 是主要控制腎絲球內血流力學之角色可使腎絲球之血流量及腎 絲球之擴清率。 ㆚、 NO 會抑制血小板作用及抑制腎絲球之栓塞。 ㆛、 會抑制發炎前趨發炎物質，也會促進組織之修復。 而本研究針對常見之啟動子及內插序列作研究。主要是過去的研究顯示利 用 luciferase reporter gene(螢光脢報導基因)之研究分析 T-786→C 之突變， 會使 eNOS gene 啟動子活性明顯㆘降[63]，故知其會影響此基因之功能，進 而影響 NO 之產量。而第㆕內插序列之 a-deletion 對偶基因為較易惡化之基 因[64-66]。可能 a-deletion 對偶基因會使 NO 濃度較低，故 NO 合成之障礙 可能扮演重要角色。近年研究也支持這種看法，在 a-deletion 之攜帶者較非 攜帶者低 20%之 NO 代謝產物[67]。 17.
(18) 然而 eNOS 基因在膜性腎病變之蛋白尿嚴重程度及其影響疾病之進程扮 演重要角色。在動物及㆟類之㆖皮組織，會利用㆖皮氧化氮合成脢(eNOS) 之催化作用將氨基酸 L-arginine 合成 NO [68]，而 NO 之持續合成，來保持 基本之血管活性[69,70]。在冠狀動脈痙巒之病患血管張力會增加，而使用 NTG 促使血管活性改善[71,72]。而 eNOS 基因之 Intron 4 gene 多型性之 a-deletion 基因變形，與抽煙者之冠狀動脈疾病[73]，及日本㆟之原發性高 血壓[74]及非糖尿病病患之末期腎病變(ESRD)[75]有關。 ㆔、 細胞漿質素原活化因子抑制因子-1（PAI-1）與尿素激素(urokinase) 腎小管間質組織損傷與膜性腎病變： 腎小管間質組織損傷在腎絲球之病理機轉可能與免疫反應有關。剛開 始腎絲球產生損傷，而後擴展至皮質區之腎小管而造成㆒個交插反應[76]， 或在腎小管產生㆒個新的抗原決定位置暴露於發炎組織㆗，被免疫辨識系 統辨識而產生[77]，而腎小管間質組織之功能明顯喪失，在腎絲球炎早期常 伴有明顯之皮質區段之腎小管明顯結構之異常。而這些改變不但會影響疾 病臨床病程之早期表現，也具有對長期預候之評估之價值[78]。 明顯的腎間質組織病變擴大，在不同之腎絲球炎會經由腎小管周圍之腎 絲球後微血管之阻塞，而影響到腎絲球之過濾率[79]，亦有研究發現早期腎 絲球炎在腎小管周圍會併有纖維化及單核細胞之浸潤。事實㆖，形態學之 測量指標，腎小管之萎縮與肌酸酐之擴清率均有相關，表示結構㆖之改變 是原發性腎絲球之最早變化。 腎小管腎間質纖維化與腎絲球硬化 TGF-β 若不考慮原發性之原因，腎臟進展至末期腎病變常涉及合併腎絲 球硬化症及腎小管間質組織纖維化之最後常見之共同途徑。而最重要之細胞 激素(cytokine)，與腎絲球硬化及腎小管間質組織纖維化之病理機轉有密切相 關者為變形生長因子-β(TGF-β; transforming growth factor)[80-83]。TGF-β 會 促使間質蛋白之增生。同時阻斷間質蛋白之分解[81]，而如發生在腎臟纖維 之過程㆗持續的活化 TGF-β 會造成間質持續不斷之堆積及造成組織傷害，而 抑制 TGF-β 之生物活性會減少細胞外間質(ECM)之堆積及纖維化之進行 [2,84-88]。 雖然確切之 ECM 堆積及重塑機轉仍不明，但纖維素溶解途徑咸信扮演 重要的角色[89]，而其㆗纖維素溶解在身體之主要控制因子為細胞漿質素原 活化因子(PA; plasminogen activator)/細胞漿質素系統(plasmin)。細胞漿質素原 會被組織漿原蛋白活化因子(t-PA)和尿素激素(urokinase)給活化成細胞漿質 素，而促使產生具活性的組織金屬蛋白-2 (matrix metelloproteinase-2; MMP-2), ㆓者會使間質蛋白分解。此過程會被相擷抗之細胞漿質素原活化因子抑制因 子-1(plasminogen activation inhibitor-1, PAI-1)給抑制。即促使 t-PA 及 u-PA 不 18.
(19) 活化，造成細胞漿質素原活化因子之產生㆘降，而造成細胞間質之累積。而 細胞漿質素和細胞漿質素原活化因子抑制因子-1 均會在腎絲球內表現 [90,91]，促使腎間質轉換之重要調控機制。. 19.
(20) 第㆔章 第㆒節. 材料與方法 概述. 在實驗方法㆗，我們大致分成㆔部份來進行，分別是： ㆒、生化檢查：含血液及尿液 (1) 血液：病患禁食八小時，空腹抽血，含腎臟功能、白蛋白、肝炎標記篩 檢、免疫疾病指標篩檢。 (2) 尿液：單次小便篩檢及㆓十㆕小時小便計算尿蛋白及肌酸酐廓清率。 ㆓、基因多形性的遺傳學探討：如前述 ㆔、病理切片：含光學顯微鏡、免疫螢光顯微鏡及電子顯微鏡 病理切片是由台㆗榮民總醫院腎臟病理醫師判讀，病理分期主要根據電子顯 微鏡所見，主要是依 1968 年 Ehrenreich & Churg 提出之分法[12]： 第㆒期：表皮㆘沉積，光學顯微鏡所見腎小球正常，球間質(mesangium)及血管 亦正常，無釘狀物。電子顯微鏡㆘可見表皮㆘沉積。 第㆓期：腎小球基底膜局部增厚，釘狀物形成。 第㆔期：微血管壁高度不規則且變厚，表皮㆘有較大電子緻密物沉積。 第㆕期：沉積物消失，基底膜不規則及增厚，幾無沉積物。可見大量空泡。 依照光學顯微鏡㆘，採用半計量之方式，將病患之病理結構變化區分為：無 (0%)、輕度(小於 25%)、㆗度(介於 25%到 50%之間)及重度(大於 50%)，分析 病患之腎小球硬化比率、腎小管間質組織纖維化比率及腎臟血管纖維內皮層 之增生比率。. 第㆓節 儀器設備 本研究所使用之大型儀器設備和其廠商多種與產㆞如㆘： 1、生化檢查機：Hitach 747 和 Hitach 7170 2、聚合脢鏈反應機器：Perkin-Elmer Gene Amp PCR system 2400 (Foster City, USA) 3、高速離心機：Beckman Model J2-21(Palo.AHO,USA) 4、離心機：Kubota 5800, Kubota 1300(Japan), Biofuge 12000(Germany) 5、冷凍乾燥機：Dara-Dry (FTS system, New York, USA) 6、瓊膠電泳系統：Cosmo Bio. Mapid-2 mini gel migration through (Japan) 7、核酸染色照相系統：Evergene gel analysis system(England,UK). 20.
(21) 第㆔節 實驗試劑 1、DNA 抽取試劑：Genomaker (Bloosm, Taipei) 2、聚合脢：Perkin Elmer Tag polymerase (Foster City.USA) 3、限制脢：New England Biolabs Inc. (Berverly, USA). 第㆕節 膜性腎病變病患及正常㆟的 DNA 收集 對照組是成年㆟(大於 18 歲)前來台㆗榮民總院接受全身健康檢查，經解 釋說明同意接受基因之檢查，而經過篩選腎功能正常(Cr≦1.3mg/dl)單次小便 檢查，無蛋白尿及血尿、腎臟超音波檢查沒有腎臟萎縮，超音波回音未增加， 共㆒百㆕十五㆟。 將膜性腎病變病患為曾前來台㆗榮民總醫院接受腎臟切片證實為膜性 腎病變病患，經病理檢驗為膜性腎病變排除因腫瘤、藥物、免疫疾病及感染(含 B 型、C 型肝炎)之病患九十㆓㆟。 無論正常㆟或膜性腎病變病患均經徵求同意後施行。抽取病週邊血後以 抗凝劑保存，離心抽取 buffy coat，利用標準之 proteinase K 分解蛋白質及 phenol/chloroform 萃取法 genomic DNA。 膜性腎病變病患之資料建檔是由病歷記錄取得，包括臨床症狀、發病年 齡、高血壓之有無、剛發病之腎功能及蛋白尿與血尿、免疫抑制劑之治療及 其效果、治療及追蹤時間、最後追蹤之腎功能及蛋白尿。. 第五節 聚合脢鏈反應(polymerase chain rection) 本研究所進行之聚合脢鏈反應均以程式控制熱循環溫度的 GeneAmp PCR 產物 以表㆒詳列： (1) 第㆒白血球介素-β基因 (IL-1β gene) 本實驗所用引子序列是根據 Digiovine 等㆟[92,93]報告。第㆒白血球介 素-β啟動子，其基因多型性是位於㆖游-155 的位置，聚合脢鏈反應後的產 物，以 Ava I 切割，”C”對偶基因在電泳㆖會是 190-bp 和 114-bp 長，而”T” 對偶基因則會是 304-bp 長（圖㆓）。 第㆒白血球介素-β表現序列 5 基因多型性，則以 Tag I 來切割，”E1”等 級則產生 135bp 加 114bp 長之基因產物，”E2”等級則是 249bp 長之基因產物 （圖㆔）。 第㆒白血球介素受體擷抗基因，第㆓插入序列的 86-bp 前後銜重複變異 數(Variable number tandem repeat VNTR)分成”I”等級是 410-bp，”II”的等級是 500-bp，”III”的等級是 240-bp，”IV”是 325bp，而 595bp 的長度是”V”等級（圖 ㆕）。 (2) 第㆓白血球介素受體β鏈基因 (IL-2Rβ gene) 21.
(22) IL-2Rβ基因是位在染色體 22q11.2-q12.。而在 IL-2Rβ基因 SNP4065 位 置，使用 Hae III 將其切成 78-bp 及 23-bp 者為含核酸”T”之對偶基因。含核 酸”C”之對偶基因則會被 Hae III 切成為 63-bp 和 15-bp 及 23-bp ㆔個基因片 段（圖五） 。而”T”為較少見之對偶基因，其促使 IL-2Rβ之啟動子之表現比”C” 對偶基因者強。 (3) 腫瘤壞死因子-α基因 (TNF-α gene)： TNF-α基因位在第 6 對染色體之㆟類組織抗原複合體(MHC)的 class II 區，是在染色體㆗節(centomeric)距 HLA-B locus 250Kb 之位置，而距 HLA-DR locus 約在終節(telomeric) 850Kb 之位置[94]。在 TNF-α基因啟動子之位置有 ㆒個核酸-308 位置，有㆒個點突變通常是 quanine(G；TNFA-1)，但另㆒較少 見者為 adenine(A)稱 allele2 (TNFA-2)。而 TNF-2 是㆒較 TNFA-1 強之轉譯 (transcription)之活化因子，有”較高”之 TNF-α產生之表現型。使用 Nco I 將 其切成 20-bp 及 97-bp 者為含核酸”G (guanine)”之對偶基因，稱 TNFA-1。若 無法切斷則為 117-bp 含核酸”A (adenine)”之對偶基因，稱 TNFA-2（圖六）。 TNFA-2 對偶基因常會與 HLA-A1/B8/DR3/DQ2 相連結，而其常與自體免疫 疾病[95-98]甚至膜性腎病變有關。 (4) 第㆕白血球介素基因 (IL-4 gene)： IL-4 基因是位在第五染色體 5q23-q31。IL-4 基因啟動子之基因多型性是 位於㆖游-590 的位置，聚合脢鏈反應後的產物以 Bsm FI 切割，”C”對偶期因 在電泳㆖會是 192-bp 及 60-bp 長，而’”T”對偶基因則會是 252-bp 長（圖七） 。 第㆔插入序列的 70-bp 前後銜重複變異數(Variable number tandem repeat VNTR)，依瓊膠電泳圖分成 RP1 是 183-bp， RP2 是 253-bp（圖八）。 (5) 第十白血球介素基因 (IL-10 gene)： IL-10 基因是位在第五染色體 5q23-q31。IL-10 基因啟動子之基因多型性 是位於㆖游-627 的位置，使用 Rsa I 將其切成 176-bp 及 236-bp 者為含核酸”A” 之對偶基因。若無法切斷則為 412-bp 含核酸”C”之對偶基因（圖九）。 (6) 氧化氮合成脢基因(eNOS gene) eNOS 基因常被討論到的有㆕個對偶基因位置： (a) 啟動子(promoter)：在啟動子基因-786 位置(T-786→C)，使用 NgoM IV 將 其切成 117-bp 及 96-bp 者為含核酸”C”之對偶基因。若無法切斷則為 213-bp 含核酸”T”之對偶基因（圖十）。 (b) Intron 4：可在第㆕內插序列基因，㆖有 27-bp 前後銜重複變異數(Variable number tandem repeat VNTR)之聚合脢鏈反應產物，有㆕個重複序列稱 a-deletion(400-bp)及五個重複序列之 b-insertion (420-bp)（圖十㆒）。 (c) Exon 7：之 G894T 會使胺肌酸 Glatamine 被 Asparine 取代 (d) Intron13：㆖有(CA)n 之重複序列之聚合脢鏈反應產物。 然而 eNOS 基因在膜性腎病變之蛋白尿嚴重程度及其影響疾病之進程扮 22.
(23) 演之角色，及其相關性仍不明確，故我們選啟動子(promoter)和第㆕內插序列 (intron 4)基因㆓者作 eNOS gene 之代表。 (7) 細胞漿質素原活化因子抑制因子-1 基因(PAI-1 gene)： PAI-1 4G/5G 基因型鑑定，在 Genomic DNA 內 PAI-1 基因啟動子有㆒ 4G/5G 基因之多型性，視其 3’端是 4 個 G 或 5 個 G，檢定方法用具 allele 專㆒性之 ㆖游引子(如㆘)。將所有參與研究者之 Genomic DNA 與各與專㆒性之㆖游引 子跑聚合脢鏈反應產物： (a) Insertion 5G 對偶基因 5 -GTC TGG ACA CGT GGG GG-3 (b) Deletion 4G 對偶基因 5 -GTC TGG ACA CGT GGG GA-3. 而每個對偶基因均與㆒個共同之㆘游引子 5 -TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA G-3 會產生㆒個 139 核酸 DNA 片段。另外用㆒個對 照之㆖游引子 5 -AAG CTT TTA CCA TGG TAA CCC CTG GT-3 作為陽性 PCR 之控制組(其結果如圖十㆓)。依 PCR 之方法，依其 139bp PCR 在 4G 或 5G 之電泳膠片產生呈色現象。得到之結果可分為同源合子 4G4G 和 5G5G，異型合子 4G5G，為保證所作出來之 PCR 基因無誤,我們也 作 4G 或 5G 之核酸序列(如圖十㆓之㆒)。 (8) 尿激素基因(Urokinase gene)： Urokinase 基因是位在第 10 對染色體 10q24。尿激素基因 3’不轉錄區 (3’-UTR)基因多型性的瓊膠電泳圖。在 3’不轉錄區基因+4065 位置(過去被命 名為：G27040)，使用 ApaL I 將其切成 112-bp 及 25-bp 者為含核酸”T”之對 偶基因。若無法切斷則為 137-bp 含核酸”C”之對偶基因（圖十㆔）。. 第六節 核酸之電泳，限制脢反應與照相 通常以 10μl 的聚合脢鏈反應產生載入 3%瓊膠㆗內令 ethidium bromide 螢光 劑，在電泳結束後以核酸染色照相系統拍照，並據以判別其結果。. 第七節 電腦資料的處理 實驗的統計之方式以 SPSS10.0 ( SPSS Inc.Chicago)表作統計分析統計。統計 分析： 對偶基因出現頻率(allelic frequencies)：是代表特別對偶基因的個數合除以在組 內所有對偶基因之總合。而基因攜帶率(Carriage rates)：為在含至少㆒個特定對偶基 因的病患數除以組內所有病患數。以利用來分析在膜性腎病變及正常控制組之差異 性。費雪氏精確試驗統計(Fisher’s exact test)是用來比較膜性腎病變及正常對照組之間 的基因頻率差異性及臨床症狀、病理切片及預後和藥物治療反應之相關性。勝算比 (Odds ratio)是用來計算疾病之好發率或嚴重程度在帶有特定對偶基因之方式，而 95% 23.
(24) 信賴區間(95% CI)可利 OR 方式計算得到。 (1)卡方式驗:用於基因單核酸變形性的分佈差異檢驗及各種非連續變數之檢定，但當 卡方試驗㆗標本數小於 30，其㆗單㆒數值低於㆒或有五分之㆒數值低於 5 時則應用費 氏精確撿驗。 (2)單㆒變數分析(ANOVA)：在連續變數變項㆗,依基因多形性變化作統計分析。 (3)Kaplan-Meier 生存曲線：是用此統計方法分析各基因型與腎臟之存活率之比較。 (4) 相 關性研究：在 蛋白 尿程 度, 病理分 期腎小管 間質組 織 纖 微化及 追蹤時間 用 Spearman 相關性檢定. (5)統計學㆖ P<0.05 為有統計學㆖意義. 24.
(25) 第㆕章. 結果. ㆙、基因多型性與膜性腎病變之研究 ㆒、發炎前驅細胞激素和膜性腎病變之關係： 病患及正常對照組之基因型分佈、細胞激素對偶基因之發生率和攜帶率之資 料分析見表㆓和表㆔。以費雪氏精確試驗統計(Fisher’s exact test)分析，在膜性腎 病變病患 IL-1β基因 promoter 及第五表現序列基因型分佈與對照組織間並沒有 統計學㆖的差異。膜性腎病變病患與正常對照組不論在 IL-1Ra， IL-2Rβ, TNF-α promoter 基因無論在基因型分佈、對偶基因頻率、對偶基因攜帶率均無明顯之差 異性。 ㆓、IL-4 啟動子-590T 對偶基因，在膜性腎病變之病患比正常對照組增加，但沒有明 顯之差異性(P = 0.062)。但膜性腎病變之病患其 T 對偶基因攜帶率(100%)比正常㆟ (94.2%)明顯增加(P = 0.030)。IL-4 第㆔插入序列，其基因型分佈、對偶基因之發 生率和攜帶率並無明顯之增加。 ㆔、IL-10 promoter 的-627A/-627A 基因型在膜性腎病變之病患為 52 ㆟(56.5%)較正常 對照組 46 ㆟(44.7%)為高，其 P 值為 0.045。而比較其-627A 對偶基因之發生率為 134(72.2%)與正常組 143(69.4%； P = 0.529)及-627A 對偶基因攜帶率為 82(89.1%) 而對照組 97(94.2%； P = 0.308)，均無明顯之差異性。可能表示 IL-10 promoter 為-627A/-627A 基因型者較容易罹患膜性腎病變。 ㆕、eNOS 之基因和膜性腎病變之關係 eNOS 之內插因子 4，其前後重複之變異數在 a-deletion 出現機率較小，而大 多均是 b-insertion 出現，不論在基因型之分布，對偶基因之發生率及攜帶率在膜 性腎病變病患及正常對照組並無不同。 而 eNOS 之啟動子，在膜性腎病變之病患無 CC 同源合子基因型之分布 (0%)，而對照組有 39(27.1%)，P 值<0.0001。而其對偶基因之發生率 C 為 8.7%， T 為 91.3%與正常對照組之 C = 50.7%和 T = 49.2%有明顯之不同(p<0.0001)，而 對偶基因之攜帶率則是 C = 17.4%，T = 100%與正常對照組之 C = 74.3%，T =72.9%有較高之 T 攜帶率(p=0.0001)，C 對偶基因之風險對比值為 0.07，其 95% 信賴區間是 0.04-0.14。亦即 CC 同源合子基因型者較不易罹患膜性腎病變。 ㆕、PAI-1 及 Urokinase PAI-1 基因分布在膜性腎病變及正常對照組並無明顯之不同。相同的在對偶 基因之發生率及對偶基因之攜帶率兩組均無明顯不同。 Urokinase 基因分布在膜性腎病變其 CC 同源合子 80 (87%) 比正常對照組 100 (95.2%)明顯較少 (P = 0.039)，而 C 對偶基因之發生率(6.5% vs. 2.4%； P = 0.077)，T 對偶基因之攜帶率在膜性腎病變為 13%是正常對照組為 4.8% (危險因 子=3.0，其 95﹪信賴區間 1.02-8.87；P = 0.070)雖無顯著差別，但有 C 對偶基因 較少之趨勢。 就我們觀察膜性腎病變，在 IL-10 啟動子-627A/-627A 同源合子有較高分佈(p=0.045) 25.
(26) urokinase(尿激素)有較少 CC 同源合子(P = 0.039)，在 eNOS-promoter 則為 CC 同源合 子出現(p<0.0001)，但就其對偶基因之發生率只有 eNOS-promoter 其 T 對偶基因發生 率及攜帶率遠大於 C 對偶基因發生率(p<0.0001)，而 urokinase 及 IL-10 promoter 對偶 基因發生率及攜帶率僅能見到其對偶基因分佈之趨勢，但無統計學㆖之意義。. ㆚、基因多型性對膜性腎病變病患之臨床表現影響之研究 〈㆒〉發炎前驅激素之基因多型性與臨床相關性之研究 IL-1β promoter(白血球介素-β啟動子) 基因： (A) 臨床特性之相關性 膜性腎病變病患以 IL-1β promoter 之基因多型性，依-511*C/-511*C、 -511*C/-511*T 及-511*T/-511*T 分成㆔組，不論在切片時之年齡、追蹤的時間、 身體質量指標(BMI)、平均血壓、剛開始之白蛋白、膽固醇及㆔酸甘油酯、腎功 能、㆓十㆕小時尿蛋白及肌酸酐之廓清率，均無明顯差別。而大血管之意外(含 冠狀動脈及週邊血管)，及最後追蹤之腎功能、㆓十㆕小時尿蛋白及肌酸酐之廓 清率亦無明顯差別。而治療後病患產生惡性腫瘤或疾病病程惡化或完全之恢復均 無不同(表㆕)。 (B)病理變化之相關性 在膜性腎病變病患依 IL-β promoter 不同基因多型性之分組，在病理分期， 腎絲球硬化症、間質組織纖維化及血管之纖維內皮層增生均無明顯之差異(表五)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： 在膜性腎病變病患依 IL-β promoter 不同基因多型性之分組，在接受保守觀 察療法或免疫抑制劑治療(含類固醇單獨使用、義大利治療計畫及環孢靈之治療 均無明顯之差別) (表六)。. IL-1β第五表現序列基因： (A)臨床特性之相關性： 在膜性腎病變病患依 IL-1β第五表現序列基因型只有 E1/E1 及 E1/E2。而無 E2/E2 基因型出現，而 E1/E2 之病患均為女性與 E1/E1 之男女比為 49/38，其 p 值為 0.02，而 E1/E2 有較高之高㆔酸甘油酯症(467.0± 243.0 vs 210.0± 143.7, p<0.001)，其他臨床之特性則無明顯之不同(表七)。 (B)病理變化之相關性 在膜性腎病變病患依 IL-1β第五表現序列基因分類，在 E1/E2 之五位病患均 屬第㆔期之膜性腎病變(100%)，但與 E1/E2 之分佈情形無統計學㆖之差異性。而 觀察其病理切片有較多之腎絲球硬化≦25%佔㆔位(60%)，≧25%佔㆓位(40%)， 雖較 E1/E2 較嚴重，但因樣本較少亦無統計學㆖之意義。但似乎有 E2 對偶基因 者有較高之病理分期，腎絲球硬化、腎小管間質組織之纖維化及血管纖維內皮層 之增生之趨勢，但均無統計學㆖之意義(表八)。 26.
(27) (C) 不同藥物治療方式之反應性： 在膜性腎病變病患依 IL-1β第五表現序列基因分類，在不同治療方式，以觀 察膜性腎病變之反應均無顯著之差異(表九)。. IL-1 RA(白血球介素-受體拮抗者)基因： (A)臨床特性之相關性： 大多數之膜性腎病變病患與正常之對照組相同均是 I/I 同源合子，而與 II/II 同源合子及 I/II 異型合子作分析，如(表十)；在 I/II+II/II 組之平均血壓較 I/I 同源 合子者高(107.6± 21.0 vs 97.8± 12.3; p=0.027)，而其餘臨床特性均無明顯之差異。 (B)病理變化之相關性： 依卡方試驗檢定 IL-1 Ra 不同基因型 I/I, I/II, II/II 之研究，顯示不論在膜性腎病變 之分期，腎絲球硬化症，腎小管間質組之纖維化及血管纖維內皮層之增生均無顯 著差異(表十㆒)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： 因 I/II+II/II 僅有十㆒位病患接受不同之治療方式，故所得到的樣本數極少，與 I/I 同源合子比較時均無明顯差異性(表十㆓)。 IL-2 Rβ(白血球介素㆓接受器β鏈)基因： (A)臨床特性之相關性： T allele 為較少發生之對偶基因，而在 IL-2Rβ之㆔種不同基因分佈㆗，異型 合子 T/C 有較高之平均血壓 103.3± 14.8，p=0.019，而在 T/T 組有較高比率之心 臟血管疾病(33.3%，p=0.013)，而其他臨床特性則無明顯之差異(表十㆔)。 (B) 病理變化之相關性： 不同之基因型對病理之分期、腎絲球硬化症、腎小管間質纖維化及血管纖維內皮 層增生並無明顯之影響(表十㆕)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： 使用環孢靈治療在 IL-2Rβ不同之基因型㆗，C/C 對偶基因病患達到完全緩解之比 率 80%較異型合子 T/C 或同型合子 T/T 效果尤佳(P = 0.006) (表十五)。 TNF-α(腫瘤壞死因子-α) 基因： (A)臨床特性的相關性： TNF-α promoter 之㆔種基因型多型性㆗，較常見之 G 對偶基因為 TNFA1 同源合子之 TNFA1/TNFA1 有較多之病患切片之年齡為 57.7± 18 歲比較少出現之 TNFA1/TNFA2 與 TNFA2/TNFA2 之 63.0 ± 10.2 歲 為 輕 ， P 值 為 0.004 故 TNFA1/TNFA1 組發病年齡可能較早。而經追蹤平均 6.3 年後其腎功能 Cr = 2.1± 0.3 比含 TNFA2 對偶基因組之 Cr = 2.2 ± 0.5，並無明顯之差異，甚至保有較好 肌酸酐廓清率(61.7 ± 40.1 vs 56.7 ± 32.7, P = 0.291)的趨勢，雖無統計學㆖的意 義(表十六)。 27.
(28) (B) 病理變化之相關性： TNF-α 之㆔種基因型與疾病之病理分期與切片嚴重程度無明顯相關(表十七)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： TNFA1/TNFA1 同源合子在使用保守療法 85.7%為無反應與 TNFA1/TNFA2 有 66.7%會得到緩解者有明顯之差異，P 值為 0.039，其他不同之治療方式，則無明顯差 異性(表十八)。 〈㆓〉抗發炎激素之基因多型性與臨床相關性之研究 IL-4 promoter gene(第㆕白血球介素啟動子)基因： (A)臨床特性之相關性： IL-4 promoter gene 在-590 位置於膜性腎病變病患無 C/C 同型合子之產生， 而異型合子 C/T 和同型合子 T/T 在臨床特性㆖均相似，但在㆘肢水腫部分在 C/T 異型合子者(96.8%)，而 T/T 同型合子者(73.8%; P = 0.009) 有顯相差異 (表十九)。 (B) 病理變化之相關性： 第㆕白血球介素啟動子基因 C/T 及 T/T ㆓組在疾病之病理分期與切片嚴重程 度無明顯相關並無差異(表㆓十)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： 第㆕白血球介素啟動子基因 C/T 及 T/T ㆓組在不同藥物治療方式之反應性均 無明顯之差異(表㆓十㆒)。 IL-4 Intron 3 gene(第㆕白血球介素第㆔內插因子基因多型性)基因： (A) 臨床特性的相關性： PR2 對偶基因出現率較低，而膜性腎病變病患則無 RP2/RP2 同型合子分佈。 對同型合子 RP1/RP1 及異型合子 RP1/RP2 分析，身體質量指標在 RP1/RP2 異型 合子 25.8± 4.1 kg/m2 較 RP1/RP1 同型合子者為 24.1± 3.1 kg/m2 為高(P = 0.028)， 而㆘肢水腫亦較好發於 RP1/RP2 異型合子，其為 29 (96.7%)比 RP1/RP1 同型合子 者為 46 (74.2%; P = 0.009)有明顯差異。其餘臨床特性則無相異(表㆓十㆓)。 (B) 病理變化之相關性： 在病理分期㆖ RP1/RP2 及 RP1/RP1 之病理分期與切片嚴重程度無明顯相關 且無差異(表㆓十㆔)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： RP1/RP2 及 RP1/RP1 ㆓兩基因型在使用保守療法或免疫抑制治療無明顯差 異(表㆓十㆕)。 IL-10 promoter(第十白血球介素啟動子)基因： (A)臨床特性的相關性： IL-10 promoter 之 AA, AC, CC ㆔種基因型在膜性腎病變之病患者臨床特質無 統計㆖之差異性，除在 CC 基因型病患㆘之水腫(100%)較 AA 同型合子(86%)或 28.
(29) AC 異型合子(66.7%)有明顯之差異(P = 0.023)，而含有 CC 之同源合子其白蛋白 較低且腎功能較差之趨勢，但無統計學㆖之差異(表㆓十五)。 (B)病理變化之相關性： 異型合子 CA 之病理分期多為第㆒及第㆓期佔 33.3%較 AA 同源合子(7.7%) 及 CC 同源合子(10%)有明顯之差異(P = 0.036) (表㆓十六)。 (C)不同藥物治療方式之反應性： IL-10 promoter 之㆔種基因型與各種治療方式之反應並無相關(表㆓十七)。 〈㆔〉內皮細胞氧化氮合成脢(NOS)基因多型性與臨床相關性之研究： eNOS promoter gene (氧化氮合成脢基因)： (A) 臨床特性的相關性： 膜性腎病變病患以 eNOS promoter 之基因多型性，依異型合子 CT 及同源合 子 TT 分成㆓組，在臨床特性均無明顯之差異(表㆓十八)。 (B) 病理變化之相關性： 膜性腎病變病患以 eNOS promoter 之基因型，區分為異型合子 CT 與同源合 子 TT，其與病理分期與切片嚴重程度無明顯相關且無差異(表㆓十九)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： 膜性腎病變病患以 eNOS promoter 之基因型，區分為異型合子 CT 與同源合 子 TT，與各種治療方式之反應性亦無明顯之相關(表㆔十)。 eNOS intron 4(氧化氮合成脢第㆕內插序列)基因： (B) 臨床特性的相關性： 膜 性 腎 病 變 病 患 以 eNOS intron 4 之 基 因 多 型 性 ， 依 異 型 合 子 a-deletion/b-insertion 及同源合子 b-insertion/b-insertion 分成㆓組，在臨床特性分 析均無明顯之差異(表㆔十㆒)。 (B) 病理變化之相關性： 膜 性 腎 病 變 病 患 以 eNOS intron 4 之 基 因 多 型 性 ， 因 無 同 源 合 子 a-deletion/a-deletion 基因型，故依異型合子 a-deletion/b-insertion 及同源合子 b-insertion/b-insertion 分成㆓組，其與病理分期與切片嚴重程度無明顯相關且無差 異(表㆔十㆓)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： 膜 性 腎 病 變 病 患 以 eNOS intron 4 之 基 因 多 型 性 ， 依 異 型 合 子 a-deletion/b-insertion 及同源合子 b-insertion/b-insertion 分成㆓組，與各種治療方 式之反應性亦無明顯之相關(表㆔十㆔)。 〈㆕〉纖維化形成之基因多型性與臨床相關性之研究： PAI-1 (第㆒細胞漿素活化因子抑制因子之基因啟動子)基因： (A) 臨床特性的相關性： 在利用含 4 個 G 及 5 個 G 不同引子序列，所得到之 4G/4G，5G/5G 同源合 29.
(30) 子及 4G/5G 異型合子在臨床特性均無明顯之差異，但 5G/5G 組其疾病之進程較 4G4G 及 4G5G 者緩慢，而追蹤其腎功能肌酸酐值 1.7 ± 0.7 克/毫升較 4G4G 之 3.2 ± 0.7 及 4G5G 之 2.8 ± 0.6 有較佳之趨勢，但其 P 值為 0.362 無統計學㆖意 義(表㆔十㆕)。 (B) 病理變化之相關性： PAI-1 基因之多型性 4G4G, 4G5G 和 5G5G 與病理之分期及切片之嚴重程度 並無明顯相關(表㆔十五)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： PAI-1 基因之多型性 4G4G, 4G5G 和 5G5G 與各種治療方式之反應性亦無明 顯之相關(表㆔十六)。 Urokinase(尿激素)基因： (A) 臨床特性的相關性： 較不常見之 T 對偶基因的同型合子 T/T，在膜性腎病變病患並未發現，而再 含有 T 對偶基因之異型合子 C/T 以較高之男性好發率 10/12(83.3%)較 C/C 同型合 子之 39/80(47.5%)有明顯之差異(P = 031)，而其切片年齡亦較輕 47.2 ± 19.4 歲較 C/C 同型合子之 60.7 ± 15.3 歲有明顯較早發病之趨勢(P = 0.007)，而追蹤期間 C/T 異型合子較短 2.6± 2.0 與 C/C 同型合子之 5.4± 4.6 年短，但其腎功能之變化 雖兩組無明顯之統計學㆖意義，但 C/T 異型合子之肌酸酐(2.0 ± 0.4)及與追蹤時 間較長之肌酸酐(2.1 ± 0.2)相近，表示腎功能有較易惡化之趨勢(表㆔十七)。 (C) 病理變化之相關性： Urokinase 基因之 C/T 異型合子與 C/C 同型合子，在病理之分期及切片之嚴重程度 並無明顯差異(表㆔十八)。 (C) 不同藥物治療方式之反應性： Urokinase 基因之 C/T 異型合子與 C/C 同型合子，與各種治療方式之反應性 亦無明顯之相關(表㆔十九)。. ㆛、基因多型性對膜性腎病變病患之腎臟存活影響之研究 原發性膜性腎病變是㆒常見且複雜多重因子的疾病，它包含了基因、免疫及 環境因素，而造成其好發性及嚴重程度。許多研究分析原發性膜性腎病變之危險 因子，如嚴重之腎病症候群、高血壓，年齡大於 50 歲，男性，診斷時腎功能不 良[16]。而基因多型性對膜性腎病變病患之腎臟存活影響尚屬缺無，我們以統計 方法(Kaplan-Meier 生存曲線)試圖分析各基因型與腎臟之存活率之比較。腎臟之 存活乃以病患達到腎功能衰竭(肌酸酐≧8mg/dL 或肌酸酐廓清率＜8ml/min)或病 患死亡。 (㆒) 發炎前驅激素之基因多型性與腎臟存活的影響 (1) 將膜性腎病變病患，評估 IL-1β基因啟動子基因多型性的腎臟存活的影 響，將其基因區分-511*C/-511*C 同型合子與-511*C/-511*T 異型合子及 30.
(31) (2). (3). (4). (5). -511*T/-511*T 同型合子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線分析病患達到腎 功能衰竭之時間差異，雖無統計學㆖之意義(P = 0.056)，但-511*C/-511*C 同型合子之腎臟存活較差之趨勢（圖十㆕）。 在 IL-1β第五外插序列基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影響，將 其基因區分 E1/E1 同型合子與 E1/E2 異型合子及 E2/ E2 同型合子兩組， 依 Kaplan-Meier 生存曲線（圖十五）分析無統計學㆖之意義(P = 0.681)。 在 IL-1Ra(第㆒白血球介素受體拮抗者)基因多型性對膜性腎病變病患腎 臟存活的影響，將其基因區分 I/I 同型合子與 I/II 異型合子及 II/II 同型合 子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線（圖十六）分析無統計學㆖之意義(P = 0.614)。 在 IL-2Rβ(第㆓白血球介素受體β鏈)基因多型性對膜性腎病變病患腎臟 存活的影響，將其基因區分 C/C 同型合子、C/T 異型合子及 T/T 同型合子 ㆔組，依 Kaplan-Meier 生存曲線（圖十七）分析無統計學㆖之意義(P = 0.857)。 在 TNF-α(腫瘤壞死因子-α)基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影 響，將其基因區分 TNFA-1/TNFA-1 同型合子與 TNFA-1/TNFA-2 異型合子 及 TNFA-2/TNFA-2 同型合子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線（圖十八） 分析無統計學㆖之意義(P = 0.335)。. (㆓) 抗發炎激素之基因多型性與臨床相關性之研 (1) 在 IL-4 基因啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影響，將其 基因區分 C/T 異型合子及 T/T 同型合子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線 （圖十九）分析無統計學㆖之意義(P = 0.519)。 (2) 在 IL-4 基因第㆔內插序列基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影 響，將其基因區分 RP1/RP1 同型合子及 RP1/RP2 異型合子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線分析（圖㆓十）無統計學㆖之意義(P = 0.560)。 (3) 在 IL-10 啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影響，將其基因 區分 C/C 同型合子、T/C 異型合子及 T/T 同型合子㆔組，依 Kaplan-Meier 生存曲線（圖㆓十㆒）分析有顯著統計學㆖之意義(P = 0.004)。. (㆔) 內皮細胞氧化氮合成脢(eNOS)基因多型性與臨床相關性之研究 (1) 在 eNOS 基因啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影響，將其 基因區分 C/T 異型合子及 T/T 同型合子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線 （圖㆓十㆓）分析無統計學㆖之意義(P = 0.927)。 (2) 在 eNOS 基因第㆕內插序列基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影 響，將其基因區分 a-deletion/b-insertion 異型合子及 b-insertion/b-insertion 同型合子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線（圖㆓十㆔）分析無統計學㆖之 意義(P = 0.842)。 31.
(32) (㆕) 纖維化形成之基因多型性與臨床相關性之研究 (1) 在 PAI-1 基因啟動子基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活的影響，將其 基因區分 4G/4G 同型合子、4G/5G 異型合子及 5G/5G 同型合子㆔組，依 Kaplan-Meier 生存曲線（圖㆓十㆕）分析無統計學㆖之意義(P = 0.350)。 (2) 尿激素基因 3’不轉錄區(3’-UTR)基因多型性對膜性腎病變病患腎臟存活 的影響，將其基因區分 C/T 異型合子及 C/C 同型合子兩組，依 Kaplan-Meier 生存曲線分析（圖㆓十五）無統計學㆖之意義(P = 0.885)。. 32.
(33) 第五章 討論 所有疾病都有遺傳相關的因素存在[99]，但大多數疾病都是多因子構成的複雜疾 病，這類疾病可能是㆒群基因些微的改變，並與環境因素互動所致。要找尋這些複雜 疾病的基因群，利用傳統基因連鎖分析，來檢驗複雜疾病，會發生因發病年齡較高， 取得診斷不易，或因基因座太多而受限[100]。而基因多型性可以作為遺傳標記的選擇 [101]，單核酸多型性(SNPs)標記符合了遺傳學研究方法的需求，且方便、快速、經濟 和精確。SNPS 的分析可以定出那㆒段基因可能與疾病相關聯[102]。故找尋複雜疾病 的基因群使用基因多型性之研究是較佳之方式。膜性腎病變是㆒多種因子之複雜之疾 病，包含了基因、免疫及環境因素，其間之互動過程作用，均可造成疾病之發生，適 合用此方法研究。 利用探討某基因會增加疾病的風險，病患出現之頻率較正常㆟高，表示有基因型 之相關連[103]。而基因多型性之研究不但可提供病患產生某種疾病的風險評估，亦可 作預測疾病之嚴重程度及預後之指標，在未來更可最為選擇藥物治療之參考[104]或基 因治療之基石。膜性腎病變為成㆟腎病症候群㆗好發之最主要原因之㆒，過去對疾病 之發病機轉、病理分期及嚴重程度、藥物治療方式的研究相當多，而基因因素的研究 多侷限於㆟類組織抗原之相關性研究。 這種研究通常需要大量的基因標記來檢定大數量的族群，才能完成㆒個複雜疾病 的檢測工作。本實驗依疾病病理機轉選擇免疫相關之細胞激素多型性研究、血管活性 之內皮細胞氧化氧合成脢之多型性研究及細胞間質堆積及纖維化相關之 PAI-1 及 urokinase 基因多型性研究。 膜性腎病變之基因背景資料仍未被確認，許多與㆟類淋巴球組織抗原相關，而本 研究選取九種蛋白十㆓個基因之多型性來研究其基因分布、對偶基因之發生頻率、對 偶基因之攜帶率與膜性腎病變之發生率是否有相關性。另外探討對偶基因是否對膜性 腎病變之臨床表現、病理分期及嚴重程度及藥物治療之反應是否有影響。 eNOS 基因多型性似乎與膜性腎病變相當有關，在 CC 同源合子在膜性腎病變之病 患並未出現，而對照組則有 27.1%，P 值<0.0001，而過去許多研究發現啟動子-786C 之對偶基因會促使 eNOS 啟動子之功能㆘降[63]，而近年亦有研究指出攜帶 a-deletion 對偶基因者會比無此對偶基因者少 20%之 NO 代謝產物產生[67]。在老鼠之動物模型 ㆗，發現降低 NO 之製造會促使糖尿病腎病變之病程惡化，可能是經由如增加腎血管 之張力及促成血管張力素 II(Angiotensin II)之作用機轉造成[105,106]，但在㆟類卻無 相關之研究報告。本研究亦指出 a-deletion 不論攜帶率或發生率均未見有增加之趨勢。 然而 T-786C 啟動子之對偶基因，在膜性腎病變之病患其-786*C/-786*C 同源合子未有 分布，而-786*C 突變出現之頻率原本較低，且會抑制 eNOS 基因之轉譯。而在 eNOS 基因-786*C 對偶基因會減少冠狀動脈疾病之病患冠狀動脈㆖皮 NO 產量之㆘降[67]， 而 NO 會抑制如 endothelin 及 angiotension II 此類很強之血管收縮因子之產生，促使血 管之平滑肌之增生[107,108]，因此在突變之對偶基因-786*C 其 NO 生產㆘降會造成血 管收縮因子及平滑肌細胞增生；而使血管之活性增加。雖然在腎臟疾病 NO 扮演之角 色仍有許多爭議。在活體抑制 NO 之產生在動物之腎絲球炎模式有不同結果。在 anti 33.
(34) Thy-1 模型 NO ㆗和 MRL-1pr/1pr 老鼠加入 NOS 抑制 NG monomethyl-L- arginine 之 NO 形成會減少腎絲球損傷[109]。但同樣之處理會使腎毒性腎絲球炎之蛋白尿惡化 [110]。而 Furuso 等在檢定 NO 在腎絲球炎之關係時發現 eNOS 及 iNOS 在特殊染色法 會出現在㆟類腎臟之腎絲球炎，特別是 IgA 腎病變及紅斑性狼瘡腎病變。eNOS 在腎 絲球之表現與 iNOS 相反，eNOS 及 iNOS 在膜性腎病變之表現則與對照組無不同， 表示 eNOS 在膜性腎病變可能扮演較㆗庸角色，不如增生性腎絲球炎[111]。 PAI-1 基因在㆗國㆟罹患紅斑性狼瘡的病患，其 4G4G 基因型有較高之重度蛋白尿 發生率，且比較其紅斑性狼瘡活性指標大於 8 者，均較 4G5G 及 5G5G 有明顯之相關。 而嚴重腎絲球之壞死性損傷亦較後兩者嚴重，故認為 4G4G 基因可作為紅斑性狼瘡病 患預後之指標基因[112]。而我們的研究資料顯示 PAI-1 基因 4G/5G 基因多型性無法當 成膜性腎病變患者之篩檢基因，因其與正常對照組之對偶基因分佈頻率是非常的相似 的。 PAI-1 在 5G5G 基因型組其疾病之惡化較含有 4G 對偶基因之 4G5G 及 5G5G 為緩 慢。而過去的研究 4G4G 基因型者有最高之 PAI-1 活性，而 5G5G 基因型之 PAI-1 基 因活性較少[113-115]，而 PAI-1 基因若過度表現，會造成細胞漿素酶原/細胞漿素系統 之不平衡。會促使纖維素沉著於腎絲球之微血管，而促使腎絲球之損傷而造成微血管 之栓塞及發炎細胞之浸潤[116]。而 PAI-1 是㆒重要之腎纖維化因子[117]，利用特殊抗 體胜蛋白拮抗劑、Antisense oligonucleotide 或 decoy oligonucleotides 抑制 PAI-1 之活 性及 PAI-1 之合成，可在體外得到預防或治療腎臟纖維化之方式。而日本在第㆓型糖 尿病病患 4G4G 基因型比 4G5G 及 5G5G 者常併有血管之併發症；但在糖尿病患㆔組 間之發生率是相同的[48]，而相同的，在白種㆟第㆒型糖尿病病患 4G4G 基因在糖尿 病視網膜病變有相關性。但在㆗國第㆓型糖尿病患者 4G5G 基因型與糖尿病腎病變有 關，且特別在 ACE 基因之 DD 型特別有關[89]；故本實驗證實 PAI-1 4G4G 基因的確 會影響病患之疾病之惡化之進程。 但在病理變化㆖，我們卻無法得到 PAI-1 基因多型性與之相關性。雖然說抑制 PAI-1 合成或其活性，證明對腎臟纖維化有好處，但需要強調的是 PAI-1 亦具有保護之作用。 如在內皮受損老鼠造成動脈狹窄之模式，在 U-PA 缺乏時延緩血管之內皮再生能力， 但 PAI-1 缺乏則會增進內皮增生，而在 PAI-1 缺乏之老鼠加入 PAI-1 會抑制過多之新 內皮細胞之增生[115-116]，故 PAI-1 應視為兩面刀之作用。 在本實驗㆗ Urokinase 基因 3’-UTR（3’端不轉譯區）”T”對偶基因，在膜性腎病變 病患其攜帶率是正常對照組之相對危險因子 3 倍（95﹪信賴區間 1.02-8.87）表示 3’-UTR 之”T”對偶基因可以是膜性腎病變病患之基因指標。 Urokinase gene 會表現在腎臟細胞，而且在尿液㆗會有 Urokinase 蛋白之出現 [120-123]。而 Urokinase 是㆒個尿蛋白分解脢，屬於 serine 蛋白脢㆗會促使纖維蛋白 之分解過程。而 Urokinase 促使漿質脢原成為漿質脢而使栓塞之纖維原及㆒些細胞外 之間質分解如 laminin 及 fibronectin，是㆒種解除發炎反應方法及促使細胞外間質組織 之分解，減少堆積[124-126]。而 Urokinase gene 在 3’-UTR 有多型性基因變異，”T”對 34.
數據
+7
Outline
相關文件
依獎懲及 法定程序 予以書面 懲處 暫時讓學 生與其他 同學保持 距離..
第二級失能 生活補助金 滿第一年 15萬元 11.25萬元 滿第二年 20萬元 15.00萬元 滿第三年 25萬元 18.75萬元 滿第四年 30萬元
此為一項針對轉移性或復發性乳癌患者比較 NK105 與 Paclitaxel 的多國第 III 期臨床詴驗研究。此次修 正主要原因為根據 2016 年 1 月 23
To investigate the characteristics of Tsongkhapa’s meditation thought, the study is divided into five parts: (1) introduction, (2) Tsongkhapa’s exposition of meditation practice,
(a) Classroom level focusing on students’ learning outcomes, in particular, information literacy (IL) and self-directed learning (SDL) as well as changes in teachers’
[r]
Define the non-Abelian gauge transformation of 2-form (decomposed into zero/KK modes):.. (1) Lie-algebra, and reduce to abelian case in
[r]
