行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
奈米級氫氧基磷灰石/幾丁聚醣-明膠藥物載體之合成
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC93-2216-E-151-005- 執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 10 月 31 日 執行單位： 國立高雄應用科技大學機械工程系 計畫主持人： 王木琴 共同主持人： 洪敏雄 報告類型： 精簡報告 報告附件： 出席國際會議研究心得報告及發表論文 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 94 年 12 月 30 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
奈米級氫氧基磷灰石/幾丁聚醣-明膠藥物載體之合成
A study on the synthesis of nano-hydroxyapatite/chitosan-gelatin drug
carrier
計畫編號：NSC 93-2216-E-151-005
執行期限：93 年 8 月 01 日至 94 年 10 月 30 日
主持人：王木琴 國立高雄應用科技大學機械工程系
email: [email protected]
共同主持人：洪敏雄 國立成功大學材料科學及工程學系
一、中文摘要 本計畫經由 75oC, 1h鹼性處理，可將 CaHPO4・2H2O (DCPD)水解合成為奈米級氫氧基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2, HAP)，並
在水解合成過程中添加介面分散劑後可成 功將HAP粉末大小減至 5-10 nm。再另行探 討以乳化法進行聚羥基丁酸(PHB)-幾丁聚 醣(CTS)微球粒藥物釋放系統之合成，並以 冷凍乾燥法收集微球粒，藉由改變酸鹼 值，成分比例以及攪拌轉速，可將微球體 尺 寸 降 至 直 徑 800 nm，並以健大霉素 (Gentamicin)為目標藥物進行釋放研究；最 後再將兩製程合而為一，以奈米級氫氧基 磷灰石為基本製作HAP/ PHB-CTS微球體 藥物釋放系統。 關鍵詞：氫氧基磷灰石、羥基丁酸(PHB)-幾丁聚醣(CTS)微球粒、乳化法、藥物釋放 系統、健大霉素。 Abstract
In this research, the nano-sized hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2, HAP) is
synthesized by hydrolysis method from CaHPO4・2H2O (DCPD). The addition of
surfactant during the hydrolysis successful decrease the particle size of HA to 5-10 nm. Drug releasing microspheres of poly(3- hydroxybutyric acid) /chitosan (PHB/CTS) with various compositions have been synthesized by emulsion methods, and collected by a freeze-drying process. In this study, gentamicin was used as an antibacterial medicine coated with PHB. The size of the PHB/CTS microspheres decreased with the PHB/CTS ratio from 1 µm for 1:1 to
800 nm for 5:1. Finally, the goal of this research is to combine the nano-sized HAP with the microspheres to form the drug deliver system.
Keywords: hydroxyapatite, PHB/CTS
microsphere, emulsion method, drug releasing, Gentamicin. 二、緣由與目的 在骨科手術方面大多以可分解吸收之 生醫材質，引導體內骨細胞重新成長，如： 氫氧基磷灰石…等為研究重點。但在手術過 後，難以避免的組織發炎及細菌感染是臨床 上最大的困擾，目前係以各式消炎抗菌藥物 的使用為常見之解決方法。但若能以體內藥 物釋放作為消炎抗菌之法，將是最為方便與 直接，因此近年來在生醫材料中含有藥物釋 放者遂成為多方研究的目標。本實驗室嘗試 發展與氫氧基磷灰石複合之藥物釋放機 制，期望在氫氧基磷灰石引導體內骨細胞重 新成長之時，能減低周圍其他因素之影響， 更期望藉由奈米效應加強此複合材質之效 果。 本計畫為「奈米級氫氧基磷灰石/幾丁 聚醣-明膠藥物載體之合成」，從奈米級氫 氧基磷灰石/幾丁聚醣-明膠之合成及導入 藥物載體方面著手，以研究此藥物載體之藥 物釋放機制並加以改善。 研究藉由濕式合成控制氫氧基磷灰石 之尺寸，並縮小其結合幾丁聚醣-明膠後之 藥物載體的大小，以提昇藥物攜帶與釋放之 面積。導入幾丁聚醣奈米球載體，研究其藥 物釋放效果，再予以改良。
三、結果與討論 Fig.1 顯 示 雙 水 磷 酸 氫 鈣 (DCPD) 於 75oC經氫氧化鈉鹼性處理一小時後，可完 全 轉 化 成 氫 氧 基 磷 灰 石 相(HAP, JCPDS card No. 9-432)，且具有(0 0 2n)之優化取 向，亦即HA六方晶結構之c軸向[1]。而後 於製程中加入不同濃度之陽離子型界面分 散劑CTAB後，仍可獲得相同的HAP相，且 (002n)之優化取向並未消失，為了解實際產 生之變化，本研究中分別計算了晶格常數 的變化以及晶體尺寸的變化。 20 25 30 35 40 45 50 55 00 4 00 2 21 3 (f) (e) (d) (b) (a) Intensity (a.u.) 2θ (c)
Fig.1 XRD patterns of the HA powders from
DCPD in 2.5 M NaOH(aq) with various
CTAB concentrations, (a)none, (b) 1 × 10-4
M, (c) 3 × 10-4 M, (d) 1 × 10-3 M, (e) 3 × 10-3 M and (f)1 × 10-2 M, at 75 oC for 1h. (●, HA; ■, Si) 於Fig.2 中顯示於添加不同濃度CTAB後 合成的HAP所得的晶格常數，可發現添加 微量CTAB時，a軸向的晶格常數與JCPDS card上相近(a (= b) = 9.418 Å and c= 6.884 Å)，但c軸向較長，顯示在水解製程中Na+離 子嵌入c軸向中造成晶格常數上升；而在 CTAB濃度增加後a軸向的晶格常數隨之下 降，在3 x 10-3 M達到最小值9.353 Å，但c 軸向則維持於6.892 Å，顯示CTAB的添加 會影響a軸變化，一般而言，針狀HAP的a 軸向帶微量正電，因此可推論陽離子型的 CTAB具有排斥壓縮a軸向的作用。 1E-4 1E-3 0.01 9.30 9.35 9.40 9.45 6.88 6.90 6.92 6.94 6.96 3E-4 3E-3 Lat tice pa ra me ter a ( n m ) Concentration of CTAB (M) Latt ice paramet e r c (nm )
Fig.2 Lattice parameters of the synthetic HA with various CTAB concentrations. (□ a with CTAB, ○ a of JCPDs, ▲ c with CTAB, ▼ c of JCPDs) 由Fig.1中的寬化繞射峰顯示合成之 HAP 晶 粒 尺 寸 為 次 微 米 至 奈 米 ， 再 由 Scherrer’s formula [2]： x = 0.9λ / βs cos θs (1) 計算得其晶粒大小，結果如Fig.3所示，晶 粒尺寸隨CTAB添加濃度而下降，在1 x 10-3 M時達到最小值17.3 nm，而後再上升。晶 格常數與晶粒大小達到最小值時的濃度差 異顯示CTAB對於HAP合成型態影響較為 迅速而直接。 1E-4 1E-3 0.01 17 18 19 20 21 22 23 3E-3 3E-4 C ry s tall ine si ze (nm ) Concentration of CTAB (M)
Fig.3 Crystallite sizes of the synthetic HA with various CTAB concentrations (■ with CTAB, ▲ without CTAB)
再由TEM觀察所合成HAP之外觀型 態，可發現當未添加CTAB時(Fig.4(a))， HAP微晶約為50nm寬100長，而在添加3 x 10-3 M CTAB後晶粒縮小為20nm寬50長 (Fig.4(b)) ， 再 由 圈 選 處 放 大 觀 察 得 Fig.4(c)，從圖中可知每個晶粒都有很好的 排 列 ， 但 軸 向 不 一 ， 如 圖 中 的(202) 與
(200)，而於電子繞設圖樣可證實其為六方 晶系結構之HAP。
Fig.4 TEM images of the HA powders from DCPD in 2.5 M NaOH(aq) at 75 oC for
1h for (a) BF image of HA without CTAB, (b) BF image of HA with 3 x 10-3 M, (c) enlarged BF image of (b), (d) ED pattern of (c). 以上實驗成果已經整理發表於 2004 年 國際會議中[3]，並已轉發表於 2004 年國 際期刊[4]。 本年度計畫中另使用單乳化法(SEP)與 雙乳化法(DEP)分別製備聚羥基丁酸(PHB)-幾丁聚醣(CTS)微球粒藥物釋放系統(PHB/ CTS)，所合成之微球如Fig.5所示。於Fig. 5(a) 觀察到若以單乳化法製備PHB/CTS=1:1之 微球粒，可得到直徑約為1 µm之多邊形微 粒，其直徑隨PHB/CTS比例增加，在5:1時 可達到2 µm (Fig. 5(b))。而以雙乳化法製備 時，於Fig.5(c)中發現PHB/CTS=1:1時可得 到表面平滑的微球體，直徑亦約為1 µm， 但其直徑隨PHB/CTS比例下降，於Fig.5(d) 中觀察知PHB/CTS =1:5時可降至800nm。此 部 分 結 果 並 已 發 表 於2005年國際會議中 [5]。
Fig. 5 SEM images of the PHB/CTS
microspheres with various composition, (a) 1:1, (b) 5:1 by SEP, and (c) 1:1, (d) 5:1 by DEP.
在分別探討玩奈米級氫氧基磷灰石以 及PHB/ CTS的合成之後，本研究期望更進 一步結合兩方面製程，製作HA/PHB/CTS 微球粒藥物釋放系統，如Fig.6所示。
Fig.6 The SEM images of (a) HAP/CTS/GEL prepared by water mixed, and (b) HAP /PHB/CTS prepared by double emulsion method.
Fig.6(a) 顯 示 了 直 接 由 水 溶 液 混 合 nano-HAP, CTS, GEL(Geletin, 明膠)三種 溶液後，冷凍乾燥收集所得之產物，可發 現直接混合後之產物為片狀的網絡結構， 並且HAP 並單獨無聚集析出之現象，表示 三者均勻分散，已然達成計畫中所提及可 供給適當環境給骨細胞繁殖與成長，及提 供空隙做為藥物攜帶之目的，但本計畫亦 期望能研發其他之用途。Fig.6(b)為改良過 後 之 製 程 所 獲 得 的 結 果 ， 將 HAP 於 PHB/CTS 之第一道乳化製程中加入，再進 行第二道乳化製程鞏固整體球型，可成功 得到直徑約1µm 之表面平滑球體，此一球 體可用於藥物承載，並可更為直接的用於 特定目標組織或器官之藥物治療。 四、計畫成果自評 本計畫原訂藉由濕式鹼性環境合成奈 米級氫氧基磷灰石，並期望將氫氧基磷灰石 之尺寸減小到極限，以探討因奈米量子效應 禪產生的性質，此部分已藉由表面分散劑的 添加加上鹼性處理後100%達成目標，並此 部分成果已被整理發表[3-4]。 本研究計劃亦期望以幾丁聚醣-明膠結 合形成之網狀結構作為骨架，以提供適當環 境給骨細胞繁殖與成長，及提供空隙做為藥 物攜帶之用，並經由氫氧基磷灰石增加整體 架構之骨生長引導性。由報告中可知此部分 目標雖以成功達成且，但由於未能及時完成 藥物釋放測試以及細胞反應評估，無法進一 步改善性質而達成最佳化，但整體而言已完 成95％以上年度目標，並仍有許多後續空間 可供研究改進。 五、參考文獻\
[1] de Groot K. Bioceramics of calcium
phosphate. Boca Raton, FL: CRC Press, 1983. pp. 11
[2] B.D. Cullity, Elements of X-ray
Diffraction, 2nd Edition, Addison-Wesley Publishing Company,
Reading, MA, 1978, pp. 87.
[3] W.J. Shih, M.C. Wang and M.H. Hon, J.
Crystal Growth, 275(2005)e2339-e2344.
[4] W.J. Shih, M.C. Wang and M.H. Hon,
The Fourteenth Intenational Conference of
Crystal Growth, ICCG14, August 9-13 2004 (Grenoble, France)
[5] Y.H. Chen, W.J. Shih, C.J. Shih, M.H.
Hon and M.C. Wang, 12th International Symposium on Metastable and Nano Materials, ISMANAM05, July 3-7, 2005 (Paris, France).
