行政院國家科學委員會專題研究計畫期中報告
NO 自 由 基 對 軟 骨 機 械 性 質 及 基 質 重 組 之 影 響(2/3) The Effect of Nitric Oxide on the Mechanical Properties and Matrix Turnover ofCartilage(2/3)
計畫編號：NSC89-2314-B002-539
執行期限：88年8月1日至91年7月31日
主持人：蔡清霖 國立臺灣大學醫學院骨科
一、 中文摘要 關節炎是台灣地區常見的疾病之 一，為了解決軟骨病變，除了積極發 展軟骨的修復技術之外，也需要較基 礎的研究配合以瞭解軟骨病發生的機 制從而預防或做更有效的治療。而本 研究將進行體外測試軟骨細胞載是否 會引發軟骨產生誘發性NO酵素，檢測 機械性質及軟骨基質中蛋白聚醣和膠 原蛋白裂解程度的變化。 關鍵詞：軟骨細胞載體、機械性質、 蛋白聚醣、膠原蛋白 AbstractArthritis is the common rheumatologic disease, afflicting many senior citizens in Taiwan. In order to develop an effective cure for such disease, we have to not only advance the cartilage repair technique, but also promote the basic research concerning the pathological mechanism so that it can be understood. We investigated the effect of chondrocyte scaffolds induced iNOS synthesis and detect mechanical properties the degradation of proteoglycans and collagen.
Keywords ： chondrocyte scaffolds 、
mechanical properties 、 proteoglycans、collagen 二、計畫緣由與目的 骨關節炎是老年人口三大疾病之 一，在臨床上的表徵為兩關節表面無 法自由移動，失去關節的穩定度並產 生疼痛，這些現象皆與關節軟骨的磨 損有密切關係。為了解決關節軟骨病 變，除了要積極發展受傷軟骨的修復 技術之外(例如發展軟骨之細胞載體以 做為修復之橋樑)，另一方面也需要有 與軟骨組織相關的基礎研究的配合， 才能瞭解軟骨病變發生的機制，從而 預防或做更有效的治療[1]。 軟骨是由少數軟骨細胞分散於佔 決大部份的胞外基質中。其胞外基質是 由水、膠原蛋白(collagen)和蛋白聚糖 (proteoglycan， PG)等構成[2]。大部份 的collagen是屬於type Ⅱ。自由基( free radical )是指具有不成對電子的原子、 原子團、或是分子，如O2-、 OH 等， 它們具有很強的氧化性，在人體內會攻 擊細胞和組織，而造成病變[3];一般而 言，人體雖會不斷的產生這一類的物 質 ， 但 人 體 也 會 產 生 酵 素 SOD ( superoxide dismutase )，它會和自由基 反應來維持平衡，以免自由基生成多而 使人體受到傷害[4];但當自由基大量 聚集時，人體組織會出現發炎現象，因 此而造成嚴重的傷害。
研究指，出軟骨病變是由於軟骨成 分受到自由基的攻擊產生降解所造成 的，特別是膠原蛋白纖維透明質酸和蛋 白聚醣[5];當關節軟骨受到 H2O2 的 攻擊時，蛋白聚醣分子便減低了和透明 質酸鍵結的能力，造成了蛋白質和透明 質酸分枝鏈的殘缺不堪[6];透明質酸 是關節滑液保持黏稠度的重要物質，所 以受傷關節軟骨的關節滑液中，不但黏 稠度降低，而且被發現含有降解的透明 質酸[7];膠原蛋白同時也會因為自由 基的攻擊而降解。 NO 自由基對關節軟骨的影響比 其他自由基重要，因為它不僅是會攻擊 胞外基質，也對軟骨細胞的多種生化反 應參予調節，但是已有的研究卻未探討 它對軟骨機械性質的巨觀影響，故本年 度將於體外測試軟骨細胞載體是否會 引發軟骨細胞內誘發性NO酵素生成， 進而產生NO。並以外加 NO donor 產 生 NO ，將軟骨細胞載進行一連串的 生化試驗及檢測其機械性質的改變，以 研究 NO 對關節軟骨的機械性質與基 質重組的影響，進而瞭解 NO 在關節 炎中所扮演的角色。 三、步驟與方法 1. 軟骨取得及培養: 取健康未離乳小豬(約3kg左右)的 關節軟骨，除去了非軟骨組織，於無菌 操作台內將軟骨切成小碎片，再加入多 種酵素將細胞分離出來，將細胞植入載 體內，再將載體置於24well培養皿中以 DMEM 培 養 液 ( 含 10% 胎 牛 血 清 ) 培 養，並置於37℃ / 0.5% CO2培養箱中 培養。 2. 細胞載體製作: (a).PLLA溶液配製:取0.12g的PLLA固 體 溶 於 12ml 的 dioxane 中 ， 形 成 1 ﹪ （w/v）的高分子溶液。 (b).blend-B 溶 液 配 製 : 取 0.32g 的 PLGA50/50(BPI) 及 0.08g 的 PLLA 溶 於 12ml的dioxane中，形成3.3﹪的高分子 溶液。 (c).blend-P溶液配製:PLLA:PLGA重量 比1:6(2.3﹪)。 將配製好的溶液12ml倒入鍍有四氟乙 烯的5㎝圓形鐵盤中，置於4℃冰箱預冷 3min，再放入液態氮中急速冷凍30min 後，進行冷凍乾燥48小時。 3.NO釋放的定量: 鑑測釋放量以培養液中NO2-累積 量計算，利用 Griess反應，以 sodium nitrite做標準曲線。收集每日更換的培 養液，500μl的培養液與500μl的反應 液 (1%sulfanilamide,0.1%N-1-naphthylethy lenediamidedihydrochloride)溶解於25% H3PO4) 在 室 溫 下 反 應 5 分 鐘 ， 以 microplate reader測波長550nm的O.D. 值[8]，而實驗組則於培養液中每日加 入1000uM的NO donor，並收集培養液 測定。 4.蛋白聚醣的裂解速率: 收集每日更換的培養液，行冷凍 乾燥，再加入分解溶液，於60℃下反 應24小時，所得之樣品液再加入1， 9-dimethyl-methylene blue染劑，測量波 長525nm的O.D.值[9]。 5. 膠原蛋白釋放定量: 利 用 hydroxyproline 做 為 標 準 曲 線 ， 分 析 每 日 更 換 的 培 養 液 中
白裂解的程度。並收集每日更換的培 養液及軟骨組織塊，進行冷凍軟燥，
加入分解液於60°C下反應24小時，加
入等量6N HCL 110°C反應24小時，再 將酸化的樣品抽乾，加入Isopropanol, Oxidant solution, Ehrlich’s reagent solution ， 於 室 溫 下 反 應 17 小 時 ， 以 microplate reader測定550nm O.D.值。 6.DNA測定： 將 軟 骨 細 胞 載 體 行 凍 乾 燥 24 小 時 ， 再 以 分 解 液 於 60°C 下 反 應 24 小 時，再加入螢光梁劑，利用螢光光譜 儀測定吸收度(光源365nm，偵測波長 458nm)。 四、結果與討論 本年度的研究重點著重於體外測 試軟骨細胞載體是否會引發軟骨細胞 內誘發性NO酵素生成，進而產生NO。 軟骨細胞載體材料是選用本實驗室所 製備的合成材料分別為PLLA、blend -B、blend-P、blend-P + Collagen。所使 用的軟骨細胞為小豬關節軟骨細胞， 將分離出來的初代軟骨細胞植入足量 的細胞密度於細胞載體內，將細胞載 體培養於24 well中，每日更換培養液， 並將每日更換的培養液收集起來做生 化分析，整個實驗共觀察兩週。 圖一為將細胞載體培養於培養液 中，並從每日更換掉的培養液中測量 培養液中NO2- 的含量作為NO產量的 指示，比較四種材料間NO每日釋放 量，四種材料每天的釋放除了Blend –P 的釋放量較呈一平穩狀態其他三種材 料在第五、七、九天都有較大量的釋 放。 圖一NO每日釋放量 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 DAY uM PLLA b-B b-P P+C 表一、兩週後培養液中NO總累積量 uM std PLLA 39.92 ±20.6 Blend-B 47.27 ±6.2 Blend-P 42.29 ±7 Blend-P+Collagen 50.63 ±11 比較兩週後四種材料NO釋放的總 累積量(表一)發現以blend-P + Collagen 的總累積量是最多，顯示細胞在這個 材料的外來物反應會較大，使得細胞 內的誘發性NO酵素顯現進而釋放稍多 的NO。 而在基質中蛋白聚醣測試中，是測 量每日更換的培養基中細胞所釋放的 GAG量，比較四種材料每日的釋放量 呈一平穩狀態四種材料之間的差異性 並不大。 圖二、GAG每日釋放量 0 5 10 15 20 0 5 10 15 day ug/ml PLLA b-B b-P P+C 在collagen的釋放方面(圖三)也有 相似的結果，四種材料每天的釋放也 呈現一個平穩狀態，彼此之間的差異 性不大。
圖三、collagen每日釋放量 0 100 200 300 400 0 5 10 15 DAY ug PLLA b-B b-P P+C 將培養兩週後的軟骨細胞載體取 出進行消化預做基質含量的測試，表 二為載體內的GAG總含量，由表可看 出兩週中載體內GAG的含量非常少但 四 種 材 料 載體 內的GAG含量相差 不 多。 表二、兩週後載體內GAG總含量 ug std PLLA 12.25 ±1.5 Blend-B 9.83 ±1.1 Blend-P 8.22 ±2.2 Blend-P+Collagen 9.51 ±1.1 而載體內collagen的總含量(表三) 情形與GAG相似，四種材料的collagen 含量皆相差不多，blend-P+collagen因 載體有加collagen所以其值會較高，但 若扣掉所塗佈的collagen量，其載體內 所生成的collagen量應會與其他載體相 似。 表三、兩週後載體內collagen總含量 ug std PLLA 32.35 ±33.2 Blend-B 30.03 ±18.2 Blend-P 36.65 ±19.0 Blend-P+Collagen 90.62 ±46.23 表四是培養兩週後的載體消化後 測載體內的細胞量，細胞載體植入的 細胞初始密度為2x106cell，但培養兩週 後 的 載 體 細 胞 增 殖 的 量 並 不 高 且 blend-P+collagen的細胞量有減少的趨 勢。 表四、兩週後載體內細胞量 cell×104 std PLLA 219.01 ±113.5 Blend-B 226.51 ±59.8 Blend-P 221.18 ±13.7 Blend-P+Collagen 186.88 ±20.6 綜合以上的一些結果，其實四種 材料間在短時的培養似乎不能很明顯 看出好壞及NO對基質的影響，可能是 細胞量太少所以一些生理生化的變化 並 不 明 顯 ， 但 重 複 了 兩 次 實 驗 在 blend-P+collagen這個材料，它的NO值 會比其它材料稍高且細胞量、基質會 長得較少，兩次實驗皆有此一趨勢， 可能是此材料的某些成份會刺激軟骨 細胞內誘發性NO酵素生成進而使得 NO產量較高，所以目前在材料的選擇 會選定blend-P+collagen及其未改質的 材料blend-P，因為blend-P+collagen的 內生性NO會稍高，所以接下來的實驗 中可以減少添加外生性NO的量。 材料選定後接培養及測定方式 皆如上述，另外再以外加NO donor的 方式，觀察基質及機械性質的變化。 圖四 NO二週釋放總量 0 200 400 600 800 cartilage b-P+NO b-P P+C+NO P+C uM 圖四為兩週後的NO總量，經處理 NO donor的載體其NO量會明顯的提高 許多，而在未處理donor的部分，以正 常軟骨的NO值會最高。 表五、兩週後載體內GAG含量 ug stdev b-P+NO donor 422.01 5.036289 b-P 453.06 21.71677 P+C+NO donor 421.77 2.286685 P+C 428.06 6.569488 545.48 15.8303
表六、兩週後載體內細胞量 cell*10^4 stdev b-P+NO donor 107.87 16.09762 b-P 142.12 13.80884 P+C+NO donor 129.01 20.43599 P+C 138.05 30.5646 Cartilage 902.09 122.2198 在基質部份GAG的總量以及載體 內細胞量皆以正常軟骨最高，而在載 體之間GAG量及細胞量並沒有很顯著 的差異性，但在處理過NO donor的載 體其GAG量及細胞量皆會比未處理過 的載體稍差。 圖五 載體機械性質 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 cartilage b-P+NO b-P P+C+NO P+C
storage modulus (Mpa)
在機械性質中以正常的軟骨的機械 性質會最好，而在載體部份雖然標準 差 很 大 但 大 體 上 皆 是 以 處 理 過 NO donor 的載體其機械性質會比較差，因 為 軟 骨 基 質 與 機 械 性 質有很大的 關 係 ， 而 這 次 實驗 只 收集 到GAG的數 據， 並未 測collagen的量但推測應與 GAG有相似的趨勢，會以未處理NO donor較佳，而這次的結果雖皆沒有非 常顯著性的差異，可能處理時間或量 不夠，才會不明顯，但大致上可以看 出處理過NO donor的載體其基質、細 胞及機械性質皆會比未處理過的載體 差。 五、參考文獻
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