水稻胚乳相關突變體的篩選及其定性(3/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

水稻胚乳相關突變體的篩選及其定性(3/3)

研究成果報告(完整版)

計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 95-2313-B-002-008- 執 行 期 間 ： 95 年 08 月 01 日至 96 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣大學農藝學系暨研究所 計 畫 主 持 人 ： 謝兆樞 計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理：王映皓、陳儀芳 處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 96 年 12 月 12 日

行政院國家科學委員會專題研究計畫報告

水稻胚乳相關突變體的篩選極其定性(3/3)

Screening and characterization of rice endosperm related mutants (3/3)

計畫編號：NSC 95-2313-B-002-008 執行期限：自民國95 年 8 月 1 日起至民國 96 年 7 月 31 日 主持人：謝兆樞 執行機構及單位：國立台灣大學農藝學系 一、中英文摘要 本研究主要應用TILLING 可以 快速偵測點突變特性，篩選經T-DNA 誘變的TRIM (Taiwan Rice Insertion Mutants) 品系，在臘質基因上的體細 胞變異率與變異的形式，並做相關的 探討；並以TILLING 了解台農 67 號 和Nipponbare 在臘質基因上的 SNP。 另外，台灣在北部、中部和南部陸 續挖掘到炭化稻米的考古遺址，本實 驗室使用在臺南科學工業園區和臺中 挖掘到的炭化稻米為材料，炭化稻米 年代距今約400 至 5000 年。本實驗室 將使用臺灣幾個不同文化層出土的炭 化稻米和現生稻品種，分別測量約100 粒稻米的長、寬、厚特性，來探討(1) 臺灣稻作農業的歷史，(2)稻種類的馴 化與分化、先民的選種喜好，(3)稻作 農業的起源與演進。除此之外，我們 也在這些碳化的材料上進行跟胚乳相 關的糯性及半糯性基因的研究。 關鍵詞：水稻、糯性突變體、炭化 稻米。 Abstract

We use TILLING in Waxy gene from TRIM 9Taiwan Induced Insertion Mutants) population, in order to

characterize the frequency and type of somaclonal variation. We also use TILLING to detect SNPs (single

nucleotide polymorphism) in Waxy gene between Tainung and Nipponbare

cultivars.

There are ancient rice seeds found out at several archeological sites in

South, Central and North part of Taiwan. We used the rice seeds from the

archaeological sites in the Tainan Science-based Industrial Park in Southern Taiwan and in Taichung in Central Taiwan. The estimated age of these seeds is around from 400 to 5000 years. We are planning to research on the following subjects by measuring the width, thickness, and length of hundreds of rice seeds, including the ancient seeds and seeds of several modern varieties： (1)the history of the rice agriculture in Taiwan (2)the domestication and differentiation of the rice, the favorite rice of the ancient people (3)the origin and the evolution of the rice agriculture. Besides, the research will produce the

data which might be useful for the archaeologists to find out how the ancient people developed from hunting culture to agriculture.

Keywords: Rice (Oryza sativa),

Yellow endosperm, waxy and

semi-waxy mutants, carbonized rice.

二、緣由與目的 近年來，由於雜糧作物的育種 改良工作，隨著農業政策的改變而 逐漸式微，水稻成為台灣農業最不 能棄守的作物產業；水稻的研究幾 已成為農學研究水平的指標。再 者，這些年來植物基因組 (genome) 的研究在台灣已經逐漸展開，尤其 是水稻方面的研究更是投下巨大 的人力、物力，累積了大量的植物 基因的資訊與數據，帶領了熱絡的 功能性的研究。此其中，最具直接 育種價值的當數大量突變體的誘 導。這些水稻突變體族群除了日本 的反轉錄跳躍子 Tos 17 插入突變 所誘導者之外，台灣自己的研究單 位也有可以利用的族群。例如，農 業試驗所及其分所的以sodium azide 誘導突變的族群、中央研究 院與農業試驗所合作的以T-DNA knock-out 誘導的族群以及台灣大 學農藝系的以 Ac/Ds 跳躍子系統插 入突變所誘導的族群。這三個台灣 自己誘導的族群所涵蓋的突變範 圍極廣，所呈現的多樣性並不亞於 日本的族群，這些珍貴的材料除了 各單位用在功能基因體學的研究 之外，也樂意提供給外界篩選可資 利用的變異。本人的實驗室過去數 年來在國科會的支持下已進行高 粱、水稻種子胚乳的GBSS, SSS, branching enzyme, debranching enzyme, ADPG pyrophosphorylase 等的cDNA clones 選殖定序以及 有關澱粉顆粒生成的proteomics 分析，同時也有過高粱EMS 誘導 突變體分離的經驗；再者，本人承 國科會第三十七屆補助科學與技 術人員國外短期研究，於1999 年 8 月至2000 年 7 月赴英國蘇格蘭作 物研究所 (Scottish Crop Research Institute, Dundee) 進修，所作的就 是分離大麥胚乳突變體及其澱粉 顆粒結合蛋白 (starch granule associated proteins) 的蛋白質體研 究。返國後又繼續與中研院生化所 陳水田博士實驗室合作用高粱及 水稻澱粉結合蛋白進行相關的研 究。 本計畫就上述台灣現有的 sodium azide 誘導突變的族群進 行與胚乳相關的突變體的分離與 分析。我們研究的目標重點性狀包 括澱粉特性 (以 amylose / amylopectin 為指標，包括糯性與半 糯性*)、有色胚乳 (colored endosperm；以金黃色系列為主， 其他色系為輔)。 除了現生的水稻族群之外，我們 也在上一個年度收集了古生水稻的 材料。由於植物含有豐富的有機物 質，當植物死亡後，土壤中的細菌、 放線菌和真菌等微生物分解植物殘 體，使植物腐爛。但是，植物在一些 不尋常的環境中，植物殘體能夠保

存。如土壤非常乾燥，沒有足夠的水 分滿足微生物的生長，或者在含水較 多的沼澤地帶，由於缺少氧氣，微生 物也不能生長。尤其是植物炭化後， 幾乎能完全阻止化學方面和生物方 面的作用，因此，其架構特徵能清楚 地保存下來。另外，由於稻殼中含有 高矽酸鹽，具有防止昆蟲和微生物侵 害的能力，也可以保護穀粒。 臺南科學工業園區（簡稱「南科」） 原先為中央研究院歷史語言研究所接 受國科會委託在該地進行考古調查， 後續計畫自民國2003 年 10 月由臧振 華和李匡悌博士帶領的團隊挖掘。在 南科所挖掘到遺址的年代涵蓋了大坌 坑文化（5000B.P.）至西拉雅文化 （500B.P.），出土的文物和植物遺留眾 多，成果相當豐碩。本實驗室借出其 中三個文化層所挖掘到的炭化稻米作 為研究材料，分別為大坌坑文化的南 關里遺址(4800~4200B.P.)、牛稠子文化 的右先方遺址(3800~3000B.P.)和蔦松 文化的五間厝遺址(1400~1000B.P.)。 2002 年由國立臺中自然科學博物 館團隊在臺中市七期重劃區挖掘出考 古遺址，名為惠來里遺址。另外，2003 年又於臺中縣沙鹿鎮南勢里挖掘出南 勢坑遺址。兩個考古遺址皆為番仔園 文化層(2000~400B.P.)，出土許多文物 與植物遺留，以惠來里遺址挖掘到的 炭化稻米數量較多。臺中科學博物館 提供本實驗室惠來里遺址(1000B.P.)和 南勢坑遺址(400B.P.)的炭化稻米研 究。另外，此挖掘團隊還提供本實驗 室惠來里遺址含有炭化稻米的完整土 塊，讓本實驗室自土塊中挑選炭化稻 米，減少使用大量水沖清洗篩選炭化 稻米時，遭受到的外力損毀。 稻為禾本科(Gramineae)、稻屬 (Oryza)之植物。亞洲栽培稻學名 Oryza sativa L.，可分為秈稻(indica)、稉稻 (japonica; sinica)及爪哇稻(javanica)或 稱熱帶稉稻三類群。本實驗室從國家 種原中心申請取得數種現代國內外現 生秈稉稻品種，以及日據時代前期及 清朝時臺灣的在地品系(均為秈稻)，包 括現在栽培之稉稻：臺農67 號、臺稉 8 號、臺農 71 號，和臺中 191 號;秈稻： 臺中在來1 號和臺中秈 10 號，國外栽 培之義大利的OS4 和 IR64，以及低腳 烏尖(低腳烏尖為 100 年前由烏尖突變 而成，於明末清初時漢人帶來臺灣)、 菜園種(400 年前臺灣當地已有種植的 品種)，和陸稻雷槌、饒腰、林芒、白 殼早仔、烏殼，分別測量100~300 粒 有殼與無殼稻米其長、寬、厚。本實 驗室藉現生稻米和炭化稻米比較，用 於探討當初由植物演變為作物馴化過 程中，先民的選拔觀念、喜好和成效、 與臺灣早期陸稻品種是否相似等。 三 、 結 果 與 討 論 應用 TILLING 檢視 TRIM-DNA 誘變 水稻族群 本研究主要應用TILLING (Targeting Induced Local Leision In Genomes) 可以快速偵測點突變特 性，篩選經T-DNA 誘變的 TRIM (Taiwan Rice Insertion Mutants) 品 系，在臘質基因上的體細胞變異率與 變異的形式，並做相關的探討；並以 TILLING 了解台農 67 號和

Nipponbare 在臘質基因上的

應用TILLING 尋找台農 67 號和 Nipponbare 在臘質基因上的 SNP，結 果兩品種在此基因上，並沒有多型 性。應用TILLING 在 200 個 TRIM T-DNA 水稻品系中，篩選臘質基因 (6297bp)上的體細胞變異，共有五個突 變品係再臘質基因序列上有變億，都 是屬於核苷酸置換 (substitution)，五個 突變都位在啟動子和5’-UTR，對於基 因並不會造成嚴重影響。本研究在200 品系 x 15 單株 x 臘質基因 6297 bp =18,891,000 bp 找到 5 個突變，突變 率為2.6 x 10 -7。 碳化古米樣品的初步觀察 由中研院史語所於南科出土牛綢 子文化遺址挖掘到水稻炭化種子，取 得第一批約三千多年前牛綢子文化遺 址出土的二十顆炭化稻榖，其稻殼幾 乎已無殘留。使用光學顯微鏡初步觀 察穀粒外觀形狀大小，無法分辨稻穀 間的差異。利用水稻 Japonica 及 Indica 質體連鎖基因上rpl16 與 rpl14 之間序 列約100bp 中，有一片段具核苷酸 CA 重複作為PS-ID（Plastid subtype identity）。Japonica 具有 6C7A、7C6A 序列片段，Indica 具有 7C7A 、8C8A、 9C7A 序列片段。而且 63% Indica 葉綠 體DNA（cpDNAs）在 Pst-12 片段 ORF-100 位置有缺失 69bp 序列，但是 所有 Japonica 葉綠體 DNA 在 Pst-12 片段ORF-100 位置沒有缺失 69bp 序 列。利用此兩種不同序列特徵可以作 為區分依據。先抽取炭化穀粒及對照 組的現生水稻品種（含秈稻與稉稻） 之質體DNA，設計引子，使用聚合酵 素鏈鎖反應（PCR）方法，進行將 rpl16 和rpl14 基因之間片段序列與放大， PCR 產物用 agarose gel 進行電泳，結 果現生水稻品種序列可以清楚看到條 帶，但是炭化穀稻沒有條帶產生，再 跑第二次PCR 結果也相同。再用 PCR 方法將Pst-12 片段 ORF-100 區域放 大，PCR 產物用 agarose gel 進行電泳， 結果亦相同。猜測可能沒有抽到炭化 穀稻之DNA，但是之後再重新進行抽 取DNA，進行 PCR，電泳結果仍然只 能看到現生水稻DNA 的條帶。 第二批取得約五千年前牛綢子文 化遺址出土的九百八十顆炭化稻穀， 重複使用PCR 的方法，仍然沒有得到 結果，猜測可能是殘留下來DNA 含量 很少或是已無遺留。使用光學顯微鏡 觀察估計約有三分之一數量的穀粒仍 有殘留稻殼。使用掃描式電子顯微鏡 觀察部分仍有殘留稻殼之炭化稻榖， 發現稻殼表面可以觀察到雙峰乳突， 欲使用「水稻雙峰乳突鑑定法」進行 判別，利用水稻雙峰乳突具有峰 （peak）、峽（col）、凹（depression）、 谷（valley）和副突（attached papilla） 等特徵，其可測量的數量性狀有雙峰 距（BPD）、峽深（CD）、距/深比 （BPD/CD）、峰角度（PA）、峽角度 （CA）以及乳突縱距（VD）、和基部 橫寬（HW）等，再利用判別函數公式 G（X）＝44.4788－0.4308（BPD）－ 0.4263（PA）＋0.075（BPD/CD）進行 判別。G（X）得正值為 A 型（Acute type） 雙峰乳突，多數為秈稻品種屬之；G （X）得正值為 O 型（Obtuse type）雙 峰乳突，多數為稉稻品種屬之。判別 準確率可達95.58％。同時以判別函數 的後驗概率（Posterior probability）作 雙峰乳突演化程度指標，可將兩種雙

峰乳突類型分為混沌態（Ⅰ型）、分化 態（Ⅱ型）和穩定態（Ⅲ型）等三種 演化狀態。但是所挑選出的稻穀之稻 殼上雙峰乳突大部份磨損嚴重，效果 不盡理想，難以精確測量，仍需進一 步觀察是否有完整的雙峰乳突可以利 用。 測量具有較完整外形之 586 粒炭 化稻穀，平均粒長4.01mm、粒寬 2.12mm、粒厚 1.57mm。長寬比 1.90mm （變異係數9.17％），其粒型為短圓 形。形狀變異幅度較大，粒長在 2.2mm─4.47mm 之間，粒寬在 1.45mm─2.65mm 之間，粒厚在 1.09mm─2.43mm 之間，長寬比在 1.18mm－2.62mm 之間。由穀粒形狀初 步判別大部份可能為稉稻。 各文化層中炭化稻米的粒型特徵值 由測量結果可知南科的南關里遺 址和右先方遺址的炭化稻米粒形較相 似，短圓型居多，粒形整齊度高，推 測當時先民可能已經有選種觀念。五 間厝遺址稻粒的粒形變異大，粒形也 較大、較厚，與爪哇稻相似，但是與 南關里遺址和右先方遺址比較，則粒 形差別很大，依照年代順序觀察粒形 變化，呈現不連續性，推測蔦松文化 時期的先民可能有遷移或交流貿易行 為。臺中挖掘的惠來里遺址和南勢坑 遺址的炭化稻米粒形整齊度相當高， 推測當時先民已有選種觀念。 比較炭化稻米與現生稻米的測量 結果，所有年層的炭化稻米粒形都較 現生稻米小，並且大部份炭化稻米粒 形與現生稉稻較為相似，為短圓形居 多。 本實驗室使用解剖顯微鏡觀察炭 化稻米，大部份的稻殼與胚已無殘 留。蔦松文化尚有少許炭化稻米有稻 殼遺留，但是使用掃描式電子顯微鏡 觀察稻殼上的雙峰乳突特徵，磨損很 嚴重。另外，本實驗室取得惠來里遺 址中的土塊，從土塊中自行挑出的炭 化稻米，由於少了人為洗選過程的外 力破壞，炭化稻米表面特徵保存較為 完整。挑出的炭化稻米使用掃描式電 子顯微鏡觀察，稻殼表面上有少數完 整的雙峰乳突特徵可供觀察。使用雙 峰乳突鑒定法判別目前所觀察到的雙 峰乳突，推測惠來里遺址可能是稉稻 品種。 目前只有初步的結果﹐還需繼續 增加觀察與測量炭化稻米的數量，以 增加準確度。日後還可由土壤中所殘 留的稻桿、花粉和矽酸體等進行較多 的生物實驗與化學分析，歸納出比較 可信的結論來進行探討，以了解先民 於幾千年前是否已開始著手選拔工 作。藉此可推測植物漸漸轉變為作物 之馴化過程，並將考古與農業領域之 學術研究作密切的結合。 古生材料的相關胚乳特性將繼續 分析探討。 四、計畫成果自評 本計畫原定的進度都在正常進行，古 生材料的部分，成果之一已發表於「94 年臺灣考古工作會報」，應用TILLING 檢視TRIM-DNA 誘變水稻族群的結果 也已完成，預計寫出一至二篇文章， 投到國外的雜誌。 五、參考文獻

Beyer, Peter , Salim Al-Babili, Xudong Ye, Paola Lucca, Patrick

Schaub, Ralf Welsch and Ingo Potrykus . 2002. Golden rice: Introducing the

β-carotene biosynthesis pathway into rice endosperm by genetic engineering to defeat vitamin A deficiency1. J. Nutr. 132: 506S–510S

Cheng C, Motohashi R, Tsuchimoto S, Fukuta Y, Ohtsubo H,and Ohtsubo E. 2003. Polyphyletic origin of cultivated rice: based on the interspersion pattern of SINEs. Mol Biol Evol 20:67-75.

Chen, W-B., Nakamura,I., Sato,Y-I., and Nakai,N. 1994. Indica-Japonica

differentiation in Chinese rice landraces. Euphytica 74: 195-201.

Guiderdoni, E., G.. An, S. M. Yu, Y. I. Hsing and C. Wu 2007. T-DNA insertion mutants as a resource for rice functional genomics. Rice Functional

Genomics:181-221.

Ishikawa R, Nakamura I, Nishihara T, Kikuchi M, Senda M, Akada S, Harada T,and Niizeki M. 2002. Origin of cytoplasm substituted rice cultivars found in Japan. Theor Appl Genet 105:608-613.

Ishikawa R, Sato I, Tang T,and Nakamura I 2002. Different maternal origins of Japanese lowland and upland rice populations. Theor Appl Genet 104:976-980.

Ye, X., Al-Babili, S., Klo¨ ti, A., Zhang, J., Lucca, P., Beyer, P. & Potrykus, I. (2000) Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287: 303–305. 張德慈等.1988.水稻對人類文明和人 口增長的影響.農業考古.1988/1 張居中等.2004.淮河中游地區稻作農 業考古調查報告.農業考古.2004/3 浘山 胜.1991.試論長江下游新石器時 代的稻作和旱作.農業考古.1991/1 游修齡等. 1995.河姆渡稻穀研究進展 及展望.農業考古.1995/1 劉軍.1991.河姆渡稻穀的啟示.農業考 古.1991/1 嚴文明.1982.中國稻作農業的起源.農 業考古.1982/1 河南省文物考古研究所.1999. 舞陽賈 湖科學出版社 胡兆華.2000.人類發展的過去現在及 未來-農耕、文化、生態.國立中興大學 文教基金會出版社 龍虬莊遺址考古隊編著.1999.龍虬莊: 江淮東部新石器時代遺址發掘報告.科 學出版社