以化學法製備銅奈米薄膜及其螢光增強特性分析

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文 Department of Chemistry National Taiwan Normal University Master Thesis. 以化學法製備銅奈米薄膜及其螢光增強特性分析 Fabrication copper films by wetting method and analysis of its fluorescence enhancement. 研究生：蘇千華 ( Chien-Hua Su ) 指導教授：陳家俊教授. 中華民國 107 年 7 月 July 2018.

(2) 謝誌在碩班兩年的求學過程中，我學習到許多的實驗技巧也閱讀了許多文獻，學習將想法實做在研究中，雖然在實驗過程遇到許多的瓶頸，但在經過努力後得到的成果，會得到許多寶貴的實做經驗及更多研究的動力，使我的化學生涯中有著莫大的幫助。首先，我要先感謝我的指導教授，陳家俊老師，提供了非常豐富的資源及舒適的實驗環境，讓我在實驗之餘無後顧之憂。接著要感謝的是顏宏吉學長在我碩班期間給予我在實驗上的建言。另外，我要再感謝口試委員陳俊維老師及王迪彥老師能撥冗出席，蒞臨指導學生的碩士論文，有您們的專業意見會使得這論文更加的完整。這兩年的實驗研究期間，特別感謝學長浩康在我實驗初期給予我的幫助，也很感謝其他學長姐孟儒、冠蘭、仲恩、資浩、彥廷、詠瑜、旻龍在實驗方面的幫助及鼓勵，讓我學到很多東西。還有感謝同學士堯、柏均、威志、鉦傑、信仲、子琳、珈穎、信仲、弘毅、俊堯、理軒兩年的陪伴與鼓勵。同時也感謝學弟妹們洧正、福利、祐丞、御宸、敏慧、逸修、珮瑜、啟盤使實驗室的生活多采多姿。最後，謝謝我的家人，在生活及精神上給予我相當大的支持，讓我能順利的取得碩士學位，碩士生涯即將告一段落，再次對上述等人獻上真誠的謝意，謝謝大家。.

(3) 摘要. 金屬奈米粒子具有獨特的螢光增強特性，當螢光物質與金屬之間隔有一定距離時，螢光物質受到金屬奈米粒子電場影響，螢光物質會有較多的電子躍遷至激發態，之後回到基態的電子數也增多，進一步增強其放光量，此現象稱為金屬螢光增強 (Metal Enhanced Fluorescence , MEF)。此研究是以無電鍍的方式在水溶液中製備出銅薄膜，以乙醛酸 (Glyoxylic acid solution)做為還原劑，並用硫醇修飾其表面，使銅片表面不易與空氣直接接觸，且在後面步驟中 TEOS 可以更易修飾上，在過去的文獻中發現，銅的局部表面電漿共振 (Localized Surface Plasmon Resonance , LSPR)未受到太大的重視，因為表面有氧化的問題，因此本實驗為了改善其問題，在銅片表面修飾上二氧化矽，且利用改變銅製備時間的長短，觀察螢光強度對銅厚度的結果，將本材料與對照組相比有明顯的染劑螢光強度增強，由此方法可增加整體的螢光增強極限，當銅片的厚度在 100 奈米左右時，對 Streptavidin-IR800 有最大的螢光增強，最大值接近 60 倍。關鍵字：金屬螢光增強、局部表面電漿共振、銅奈米顆粒 I.

(4) Abstract. Metallic nanoparticles possess specific properties called metal enhanced fluorescence (MEF), which plays a crucial role in this study. The concept of MEF is that there will be more electrons transitioned to the excited state from the ground state when the fluorescent substance and metallic nanoparticles are in a certain distance owing to the electric field effect. In addition, there will be more electrons released back to the ground state, which can enhance the emission of the light. The method of preparing copper films in aqueous solution without plating was investigated in this study. Instead of plating method to generate the copper films, glyoxylic acid solution was used as the reducing agent to reduce the copper surface. After. the. reducing. process,. the. copper. surface. was. modified. by. (3-. Mercaptopropyl)trimethoxysilane to stably remain the films in reduced state. In previous study, the localized surface plasmon resonance (LSPR) of copper was not emphasized in the research due to the problem of oxidation of the material surface. Therefore, as to improve the previous method, the surface of copper was modified by SiO2. In addition, the method in this study to control the time of preparing copper films was shown to have obviously enhancement of the fluorescence of Streptavidin-IR800 according to its results. This method was investigated to promote the overall limit of the enhancement of fluorescence. The copper films with around 100 nm thickness were reported to have the optimal fluorescence enhancement approximately 60 times compared to the previous method.. Keywords：Metal Enhanced Fluorescence、Localized Surface Plasmon Resonance、Copper nanoparticle II.

(5) 目錄摘要................................................................................................................................ I 目錄.............................................................................................................................. III 表目錄........................................................................................................................ VII 第一章緒論.................................................................................................................. 1 1-1 奈米的發展起源 ............................................................................................. 1 1-2 奈米材料特性 ................................................................................................. 2 1-3 奈米材料運用 ................................................................................................. 4 1-3-1 奈米與生物科技 .................................................................................. 4 1-3-2 奈米與醫學 .......................................................................................... 5 1-3-3 奈米金屬 .............................................................................................. 6 1-4 研究目的 ........................................................................................................ 7 第二章文獻回顧.......................................................................................................... 8 2-1 金屬增強螢光(Metal-Enhanced Fluorescence , MEF) ................................... 8 2-2 SPR 和 LSPR 的介紹.................................................................................... 10 2-2-1 表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance , SPR) .......................... 10 2-2-2 局部表面電漿共振(Localized Surface Plasmon Resonance , LSPR) ...................................................................................................................... 11 2-2-3 SPR 和 LSPR 的區別 ........................................................................ 12 2-3 緩衝溶液(Buffer Solution)............................................................................ 13 第三章實驗藥品及步驟............................................................................................ 15 3-1 實驗藥品 ....................................................................................................... 15 3-2 實驗儀器介紹 ............................................................................................... 18 3-2-1 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM) ............ 18 III.

(6) 3-2-2 穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，TEM) ..... 20 3-2-3 紫外-可見分光儀(Ultraviolet-Visible Spectroscopy，UV-Vis) ....... 21 3-2-4 酸鹼度測定儀(pH meter) .................................................................. 21 3-2-5 MidaScan ............................................................................................ 22 3-2-6 孔盤成長室(FAST slide incubation chambers) ................................. 24 3-2-7 X 射線光電子能譜儀(X-ray Photoelectron Spectroscopy，XPS) ... 24 3-2-8 迴轉式震盪恆溫水槽(Orbital Shaking Baths).................................. 25 3-2-9 能量散射 X 射線光譜(Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy，EDS) ...................................................................................................................... 25 3-3 實驗步驟 ....................................................................................................... 26 3-3-1 玻片清洗 & 玻片修飾 Succinic anhydride ..................................... 26 3-3-2 一次長晶法-製備金的晶種(seed) .................................................... 26 3-3-3 二次長晶法-將銅長在玻片上，形成 Cu/Au nano film .................. 28 3-3-4 奈米銅薄膜表面修飾 ........................................................................ 29 3-3-5 奈米銅薄膜修飾上螢光分子 ............................................................ 30 第四章研究過程與結果討論.................................................................................... 31 4-1 無電鍍銅-還原劑選擇 .................................................................................. 31 4-2 Buffer Solution 選擇 .................................................................................... 32 4-3 實驗過程 SEM 及 TEM 圖.......................................................................... 34 4-3-1 Au seed top view ................................................................................ 34 4-3-2 Au 75 µM nanoparticle top view ........................................................ 35 4-3-3 還原劑選擇 ........................................................................................ 36 4-3-4 乙醛酸成長過程 ................................................................................ 41 4-3-5 Glyoxylic Acid - Modified by SiO2.................................................... 43 4-4 還原劑與螢光強度的關係 .......................................................................... 44 IV.

(7) 4-5 Streptavidin-IR800 反應時間與螢光強度的關係 ....................................... 45 4-6 UV 圖 ............................................................................................................ 46 4-6-1 Glyoxylic acid .................................................................................... 46 4-6-2 Glyoxal ............................................................................................... 46 4-7 XPS 圖譜 ....................................................................................................... 47 4-7-1 S-的 XPS ............................................................................................ 47 4-7-2 Cu-的 XPS.......................................................................................... 48 4-8 EDS ................................................................................................................ 49 4-9 螢光增強測試 ............................................................................................... 51 第五章結論與未來展望............................................................................................ 52 第六章參考文獻........................................................................................................ 53. 圖次圖 1-1 量子限域效應[5] ................................................................................. 2 圖 1-2 Size-dependent PL colors of semiconductor QDs.[6] .......................... 3 圖 1-3 磁性奈米微粒之細胞分離法 ............................................................ 4 圖 1-4 奈米科技運用在醫學上[8] ................................................................. 5 圖 1-5 微脂粒 ................................................................................................ 5 圖 1-6 奈米生物標記 .................................................................................... 6 圖 2-1 MEF 三種機制[20]............................................................................... 8 圖 2-2 Jablonski diagram[21]........................................................................... 9 圖 2-3 當有金屬在螢光物質旁邊時會提升螢光放光[20] ............................ 9 圖 2-4 SPR 機制圖[22].................................................................................. 10 圖 2-5 局部表面電漿共振示意圖[27] .......................................................... 11 圖 2-6 SPR 與 LSPR 示意圖[35] .................................................................. 12 V.

(8) 圖 3-1 台大思亮館 SEM (Hitachi S4800) .................................................. 18 圖 3-2 電子束打到樣品後以多種形式射出 .............................................. 19 圖 3-3 TEM 與 SEM 差異........................................................................... 19 圖 3-4 台大思亮館 TEM (Hitachi H-7100) ................................................ 20 圖 3-5 紫外-可見分光儀 ............................................................................. 21 圖 3-6 pH meter ........................................................................................... 21 圖 3-7 MidaScan .......................................................................................... 22 圖 3-8 MidaScan 介面 ................................................................................ 23 圖 3-9 孔盤成長室 ...................................................................................... 24 圖 3-10 XPS 原理圖 .................................................................................... 24 圖 3-11 迴轉式震盪恆溫水槽 .................................................................... 25 圖 4-1 Au seed ............................................................................................ 34 圖 4-2 Au 75 µM nanoparticle .................................................................... 35 圖 4-3 還原劑-乙二醛銅片 ........................................................................ 36 圖 4-4 還原劑-乙醛酸銅片 ........................................................................ 37 圖 4-5 還原法-熱蒸鍍銅片 ....................................................................... 39 圖 4-6 TEM-還原劑乙二醛及乙醛酸 ....................................................... 40 圖 4-7 SEM-乙醛酸銅片生長過程 ............................................................ 42 圖 4-8 銅片修飾 SiO2................................................................................ 43 圖 4-9 不同還原劑比較螢光強度 ............................................................ 44 圖 4-10 比較染劑與銅片反應時間-螢光強度測試 ................................. 45 圖 4-11 銅片生長時間 UV 圖譜............................................................... 46 圖 4-12 銅片 XPS 鑑定-SH ...................................................................... 47 圖 4-13 銅片 XPS 鑑定-Cu ....................................................................... 48 圖 4-14 銅片 EDS 鑑定 ............................................................................. 49 VI.

(9) 圖 4-15 螢光增強測試 .............................................................................. 51. 表目錄圖表 1 不同金屬緩衝液之間的複合強度[37] .......................................... 14 圖表 2 還原劑比較表................................................................................ 31. VII.

(10) 第一章緒論 1-1 奈米的發展起源「奈米」是長度單位，原稱毫微米，用 nm 表示(1nm =10-9 nm)，一個奈米大概是 3~4 個原子連接的長度，奈米材料的定義是指材料特徵長度，此長度可以是粒子直徑、晶體尺寸、鍍層厚度等，具有與一般物質不一樣性質的材料。 1861 年，隨著膠體化學的建立，科學家針對直徑 1~100 nm 的粒子進行研究，隨後，奈米的研究範圍不斷擴大，不論是理論或實際應用都進展快速，人們關注奈米顆粒的尺寸、原子團簇、奈米棒、奈米管、奈米組裝系統等等。1990 年在美國巴爾地摩召開了第一屆奈米科技會議，統一奈米的概念。從微米進入奈米，綜觀奈米科技發展的歷史，可以分為三個階段: I.主要是在實驗室裡製備各種奈米顆粒體粉或將粉體製成薄膜，比較與一般材料的差異，由於研究侷限在單一材料，所以國際上通常以奈米晶或奈米相 (nanocrystalline or nanophase)材料來稱呼這類奈米。 II.人們開始著重奈米材料的物理、化學和力學性能，設計在奈米複合材料上面，在這個階段，奈米材料研究已成為主要的研究方向。 III.奈米自組裝或人工合成的奈米結構越來越受重視，它的原理是以奈米顆粒為基本單位在一維、二維和三維空間組裝排列成具有奈米結構的體系。統整可以說是第一、二階段的研究在某些程度上是具有隨機性的，但第三階段是指有規則的設計、組裝。. 1.

(11) 1-2 奈米材料特性材料在縮小至奈米尺寸後，比表面積增大，暴露於表面及界面的原子數增多，表面位能急速提高，粒子表面活性大幅改變，許多特性因奈米化而出現[1-3] : i. 小尺寸效應：當顆粒變小時所引起的性質變化，稱為「小尺寸效應」，當微粒尺寸與光波波長相當或更小時，粒子表面的原子密度下降，導致光、聲、電、磁、熱等物性發生變化。. ii.量子尺寸效應：奈米粒子所含的原子數有限，各原子受到鄰近原子的影響減小，形成非連續的電子能階，產生量子限域效應(quantum confinement)[4]，另一方面，最高電子佔據分子軌道與最低電子未佔據分子軌道的能階差(稱為能隙)，會因奈米化而變寬，這種電子能階呈非連續化及能隙變寬的現象，稱為「量子尺寸效應」。圖 1-1 量子限域效應[5]. 圖 1-1 量子限域效應[5]. 2.

(12) iii.奈米光學性質：粒子奈米化後，光與微波的吸收度均顯著提升。奈米化的金屬不反射可見光，故失去金屬光澤而呈現黑色，奈米粒子的量子效應使能隙變寬，使激發光譜與發光光譜趨向短波長，產生藍移的現象。圖 1-2 Size-dependent PL colors of semiconductor QDs.[6] 利用此一特性，可以以粒子尺寸自由改變發光波長，應用在光電元件與生物標記上。. 圖 1-2 Size-dependent PL colors of semiconductor QDs.[6]. iv.奈米化學性質：當材料奈米化後，由於量子尺寸效應，加上結構變化、表面鍵結及表面張力的差異，影響其化學反應活性。當粒子粒徑變小，因表面張力及表面位能增大，為了平衡與周圍環境的界面位能差，奈米粉體的吸附能力遠大於大顆粒物體，易參與化學反應。 3.

(13) 1-3 奈米材料運用 1-3-1 奈米與生物科技生物分離 : 在進行生物分析時，經常需要分離單一細胞、抗體或酵素，將目標細胞(例如紅血球、白血球、癌細胞)的抗體附著在有磁性的奈米微粒上，當施加磁場時，磁性奈米細胞會將目標細胞固定住，而不要的細胞則會被沖走。圖 1-3 磁性奈米微粒之細胞分離法. 圖 1-3 磁性奈米微粒之細胞分離法. 4.

(14) 1-3-2 奈米與醫學檢測與診斷：目前已成功開發出具有鐵磁性的氧化鐵奈米顆粒作為顯影劑，能加強影像的明暗對比，使臨床判讀上更正確。另外[7]傳統的檢查無法偵測到少量的癌細胞，如果將特定癌細胞的抗體皆在半導體奈米晶體(量子點)上，然後注射到體內，晶體即會自動尋找癌細胞並與之結合，由於量子點在光源激發下會發螢光，因此可以用儀器輕易的找到癌細胞的位置。下圖為磁性奈米粒子模擬藥物(螢光劑)從儲存器釋放，作為膜厚度對藥物的傳質速率。. 圖 1-4 奈米科技運用在醫學上[8]. 藥物傳輸：目前奈米藥物的研究以癌症治療為主，科學家將抗癌藥物包裹在 100 奈米左右的微脂粒中，此大小的微粒可穿透癌細胞旁的微血管，並進入癌細胞釋放出藥物，但無法穿越正常細胞的微血管(孔隙在 80 奈米以下)，故不會對正常細胞產生毒素。. 圖 1-5 微脂粒 5.

(15) 1-3-3 奈米金屬 1962 年，日本教授證明，金屬粒子奈米化後，隨著顆粒直徑變小，比表面積顯著增加，促使表面能迅速提升，量子效應使能階產生變化，連續式的電子能階會變成獨立式分散能階。應用在吸波材料：奈米金屬粉體對電磁波有特殊吸波效應，由於奈米鐵或鈷具有吸收紅外線的功能，因此可以作為軍用隱形塗料。應用在生物標記材料：部分奈米金屬粒子(如金或銀)尺寸遠小於光波長時，其可見光散射光譜會有明顯的共振現象，稱為「表面電漿共振」。其共振頻率與粒子大小、形狀、材料及鄰近物質有關，把特定抗體鍵結在奈米金屬粒子上，當抗體和特定抗原結合後，這些金屬粒子相互聚集靠近，而使金屬粒子顏色改變[9]。可以製成生物標記材料、生物感測器及免疫分析探針等元件。圖 1-6 奈米生物標記. 圖 1-6 奈米生物標記. 6.

(16) 1-4 研究目的螢光檢測是醫療診斷和生物技術中有用的工具，雖然螢光是一種靈敏的技術，但檢測受限於螢光團的產率及光穩定性。在這方面，研究上已證實螢光團的光學性質可以透過相鄰的金屬奈米結構來修飾[10]，螢光-金屬相互作用的使用被稱為金屬增強螢光(Metal-Enhanced Fluorescence , MEF)。金屬螢光增強現象與金屬奈米顆粒的局部表面等離子共振(Localized Surface Plasmon Resonance , LSPR)有關，當光與金屬奈米結構的電子相互作用時，LSPR 現象被激發，導致集體激發振盪，奈米粒子的局部電磁場增強，又因 LSPR 現象需在特定的波長條件下激發，才可產生共振，因此 LSPR 被廣泛應用在生物化學的感測上。由一些貴金屬(即金和銀)組成的奈米結構，在可見光的波長範圍有強烈的局部電場，但金、銀相對於銅的成本較高，銅的導電性高、成本低、在電子應用中使用最多的金屬，集成電子，光子，化學或生物特徵的小型化奈米器件的發展，對未來的電子和傳感器件非常重要，再加上銅有易於回收且典型球形銅納米顆粒在可見光區域內有 LSPR 發生的優點[11]，但因為銅有氧化的問題，所以銅的 LSPR 未受太大的關注，因此將銅做為本論文研究的材料。在許多文獻中，作者大多都是利用熱蒸鍍的方式製備銅薄膜[12-14]，但此實驗方法費時且不具創新力，因此在本研究中是以無電鍍的方式製備銅薄膜，此方法具有快速且便利的優點，藉由控制實驗過程的時間及 pH 值改善銅薄膜的生長形貌及速度，本材料與控制組相比有明顯的螢光增強，對 Streptavidin-IR800 的螢光增強最大值接近 60 倍。. 7.

(17) 第二章文獻回顧 2-1 金屬增強螢光(Metal-Enhanced Fluorescence , MEF) 1980 年代後，金屬表面和粒子的螢光增強理論已經發展起來，發現 MEF 至少有三種已知的機制引起。圖 2-1 MEF 三種機制[20] Ⅰ.第一種機制是 Energy Quenching , km，能量傳遞淬火，和金屬顆粒的偶極震盪衰減有關。 Ⅱ第二種機制是使金屬增加螢光團上的入射場,Em，發射強度增強，此效應被觀察到金屬上被稱為“Lightening Rod Effect”[15-17]，這種增強是因金屬顆粒集中局部電場後隨即增加激發速率。 Ⅲ第三種機制是金屬顆粒可以增加螢光團的輻射衰減率,Γm，也就是螢光團發射光子的速率[18, 19]，為了更好理解此概念，可以看螢光團的 Jablonski 圖和接近金屬顆粒的改良型式。圖 2-2 Jablonski diagram[21] 光子的吸收將螢光團激發至第一單重態，接著激發的分子可以用 Γ 的速度將發射光子，或是利用非輻射衰變過程回到基態，速率為 Knr，另外，也要考慮金屬淬火速率，Kq，因此最後的量子產率 Q0 的公式 : 𝑄0 =. 圖 2-1 MEF 三種機制[20] 8. 𝛤 𝛤+𝛫𝑛𝑟 +𝛫𝑞. [20].

(18) 圖 2-2 Jablonski diagram[21]. 金屬顆粒可以藉由改變表面的空間條件，從增加或減少螢光團的入射電場、輻射衰減速率, Em、Γm，這些影響可以用光子模式增加密度的變化來描述，有學者發現將螢光物質放在金屬表面附近，會增加螢光物質的放光，當螢光物質與金屬之間隔有一定的距離，螢光物質受到金屬奈米粒子局域性電場的影響，螢光材料激態的電子受到電子躍遷至激發態，之後回到基態電子也增多，進一步增強其放光亮。圖 2-3 當有金屬在螢光物質旁邊時會提升螢光放光[20]. 圖 2-3 當有金屬在螢光物質旁邊時會提升螢光放光[20]. 9.

(19) 2-2 SPR 和 LSPR 的介紹 2-2-1 表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance , SPR) 當入射光大於全內反射角(TIR)，光從金屬薄膜反射時發生 SPR，通過觀察生物分子結合金屬表面時，SPR 共振角發生變化，可以提高化學反應的性能、準確檢驗目標分子結合的全反應[13-17]。SPR 的增強機制包括電磁場增強和化學增強，前者是由 Surface Plasmon 所引起，可以在較大的頻率範圍上增加光譜，後者是可以選擇性地增強金屬表面上被吸收分子的拉曼訊號。而實際上，測量樣品要考慮的因素很多，例如 : 當入射光撞擊到金屬膜時，雖然光子從界面反射，但電磁場的分量會穿透並產生電磁場分量。. 圖 2-4 SPR 機制圖[22]. 在可見光或紅外光波段，金屬真實的介電常數為負的，是因為電磁場的色散關係，而介電常數的虛部，指的是電磁波的吸收，色散公式如下，從色散關係來看，Surface Plasmon 必須與入射光的角頻率相匹，使得發生集體振盪，轉化為高能電磁波導致電磁增強。. 10.

(20) 色散公式： 𝛽𝑠𝑝 =. 𝜔 𝑐. 𝜀𝑑 𝜀𝑚. √𝜀. 𝑑 +𝜀𝑚. =. 2𝜋 𝜆. 𝜀𝑑 𝜀𝑚. √𝜀. 𝑑 +𝜀𝑚. 𝛽𝑠𝑝 : 金屬和介電質之間的表面電漿激元的傳播常數 ω : 角頻率 c : 光速 λ : 入射光在真空中的波長 𝜀𝑑 ∶ 電介質的介電常數 𝜀𝑚 : 金屬的介電常數. 2-2-2 局部表面電漿共振(Localized Surface Plasmon Resonance ,. LSPR) 當入射光子的頻率與金屬奈米粒子的導帶電子振盪相匹時，會發生 LSPR，圖 2-5 局部表面電漿共振示意圖[27]，由於金屬奈米粒子在紫外-可見光範圍有獨特的光學性質，因此金屬奈米粒子已用在 LSPR 上，另外在文獻中發現，LSPR 的強度和奈米顆粒的大小、形狀、粒子間距、介電常數有高度相關[23-26]。. 圖 2-5 局部表面電漿共振示意圖[27]. 11.

(21) 金屬產生 LSPR 的特點是有一個很大的負實數和小的虛介電函數，有許多金屬(例如:鋰、鈉、鋁、銦、鎵、銅)都有符合此標準，然而，這些金屬有些不穩定有些表面易氧化(例如:銅)[28]，在文獻中有將銅浸泡在酸性溶液中除去氧化銅 [29-32]. ，但螢光效果沒有很好，因此本實驗參考其他文獻利用二氧化矽隔絕空氣[33,. 34]. ，將銅的表面氧化問題解決為本實驗的研究之一。. 2-2-3 SPR 和 LSPR 的區別 SPR 是表面電漿激元在金屬薄膜上傳遞，LSPR 是電漿激元在金屬奈米粒子表面上傳遞。圖 2-6 SPR 與 LSPR 示意圖[35]. 圖 2-6 SPR 與 LSPR 示意圖[35]. 12.

(22) 2-3 緩衝溶液(Buffer Solution) 在生物中，pH 值是十分重要的參數，pH 值影響酶的速率，因此保持溶液中質子濃度不干擾酶是非常重要的。在生物體中，改變周圍溶液的 pH 值，蛋白質可能在形狀上會發生變化，這是由於存在羧基和胺基官能基，pH 值變化後，使得胺基酸官能基間產生靜電相互作用，改變了蛋白質的結構(形狀)，由於蛋白質的功能取決於結構，因此會導致結構變性、破壞和功能的失效。. 在實驗中，通常會在系統中添加適當的緩衝溶液來控制 pH 值。1996 年 Good 等學家研究了用在生物學上的 pH 緩衝溶液[36]，他提出了幾項標準 : Ⅰ溫度、離子強度、濃度對緩衝液的 pKa 影響要最小。 Ⅱ緩衝液不可與陽離子形成錯合物。 Ⅲ緩衝液應穩定、不可代謝。 Ⅳ緩衝液不可吸收波長 240 nm 以上的光，特別是要測定的範圍。 Ⅴ緩衝液應很容易準備且便宜。緩衝溶液在沒有金屬干擾下會有最佳的狀態，因為當有金屬存在時，可能會形成弱配合體，因此在文獻中[37]，學者將金屬元素進行分析，並整理為表格，使之後的研究中可參照圖表，減少錯合物的產生。. 13.

(23) 圖表 1 不同金屬緩衝液之間的複合強度[37]. 14.

(24) 第三章實驗藥品及步驟 3-1 實驗藥品. CAS Number. 藥品名. 廠牌 Thermo. 免疫載玻片 Polysine 硼氫化鈉. 16940-66-2. ACROS. 5470-11-1. Alfa Aesar. 16961-25-4. ACROS. 1336-21-6. Sigma-Aldrich. 7758-99-7. ACROS. 60-00-4. ACROS. Sodium borohydride，NaBH4 鹽酸羥胺 Hydroxylamine hydrochloride， H3NO·HCl 四氯化金酸 Hydeogen tetrachloroaurate (III) trihydrate，HAuCl 4·3H2O 氨水 Ammonium hydroxide，NH4OH 硫酸銅 Copper(II) sulfate pentahydrate， CuSO4 乙二胺四乙酸 (EDTA) Ethylenediaminetetraacetic acid， C10H16N2O8. 15.

(25) 乙醛酸. 298-12-4. Sigma-Aldrich. 107-22-2. ACROS. 1310-73-2. Fisher. 4420-74-0. ACROS. 78-10-4. ACROS. 13822-56-5. ACROS. 108-88-3. Fisher. 6066-82-6. Aldrich. 108-30-5. Alfa Aesar. 538-75-0. Alfa Aesar. 7087-68-5. ACROS. Glyoxylic acid solution，C2H2O3 乙二醛 Glyoxal，C2H2O2 氫氧化鈉 Sodium hydroxide，NaOH (3-巯基丙基)三甲氧基硅烷 (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane， C9H23NO3Si 四乙氧基矽烷 (TEOS) Tetraethyl orthosilicate，SiC8H20O4 3-氨基丙基三乙氧基矽烷 (APTES) (3-Aminopropyl) trimethoxysilane， C9H23NO3Si 甲苯 Toluene，C7H8 N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) N-Hydroxysuccinimide，C4H5NO3 丁二酸酐 Succinic anhydride，C4H4O3 二環己基碳二亞胺 (DCC) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide， C13H22N2 N,N-二異丙基乙基胺 (DIPEA) N,N-Diisopropylethylamine，C8H19N 16.

(26) 二甲基甲醯胺 (DMF). 68-12-2. Fisher. 58-85-5. Sigma-Aldrich. 25322-68-3. JenKem Technology. Dimethylformamide，C3H7NO 生物素 Biotin，C10H16N2O3S 八臂聚乙二醇氨 8arm-PEG10K-NH2,-10K. 17.

(27) 3-2 實驗儀器介紹 3-2-1 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM) 型號：台大思亮館 Hitachi S4800 原理：掃描式電子顯微鏡是用來觀察物體的表面型態，解析度可達奈米尺度。利用電子槍產生電子束之後，以約 0.2~40kV 電壓予以加壓，聚焦於試片表面，當電子束撞擊試片表面時，會產生向後散射的電子(背射電子)及自材料中被激發射出的二次電子。這些電子產生的狀態與材料表面的凹凸、物質種類及電位有關，將這些訊號利用檢測器接收後放大，再送到顯示螢幕予以成像。[38]. 圖 3-1 台大思亮館 SEM (Hitachi S4800). 18.

(28) 圖 3-2 電子束打到樣品後以多種形式射出. 圖 3-3 TEM 與 SEM 差異. 19.

(29) 3-2-2 穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy，. TEM) 型號：台大思亮館 Hitachi H-7100 原理：利用高能電子束(100 KeV~1MeV)撞擊小於 100 nm 的樣品，電子與樣品中的原子因產生碰撞而改變方向，發生不同程度的散射，發生散射後依照樣品的厚度及密度會產生不同大小的散射角，電子束經透鏡組合放大、聚焦，最後形成明暗對比的影像，這些明暗對比的影像藉由螢光板呈現。. 圖 3-4 台大思亮館 TEM (Hitachi H-7100). 20.

(30) 3-2-3 紫外-可見分光儀(Ultraviolet-Visible Spectroscopy，UV-Vis) 型號：Hawlett-packard 8453 原理：依據光電效應當物質受到光線的照射時，不同的光線能量會造成不同的電子躍遷，而若吸收的光線在紫外光/可見光的範圍，即形成 UV/VIS 光譜。由於不同官能基，會有不同的吸收波長，因此藉由分析物質之 UV/VIS 光譜，可以對物質之含有的官能基進行檢測。. 圖 3-5 紫外-可見分光儀. 3-2-4 酸鹼度測定儀(pH meter) 型號：LENON E-1312 工業用電極 原理：此儀器可以隨時得知實驗反應過程的酸鹼值，讓參數更加準確，增加實驗的再現性，使用溫度在-5~100℃，且此儀器設計具有耐高汙染、不易阻塞、易清洗的優點，適合運用在金屬水溶液的實驗中。. 圖 3-6 pH meter 21.

(31) 3-2-5 MidaScan 型號：NIRMIDAS Biotech 原理：此儀器同時有 647 nm 與 780 nm 兩種波長的激發光源，主要用以掃描帶有螢光物質的玻片樣品，可以做定量及定性的分析。利用十六孔盤成長室將不同濃度的染劑與樣品玻片反應後，放入機器中偵測，即可得一系列的增強螢光強度。. 圖 3-7 MidaScan. 22.

(32) 由圖 3-8 MidaScan 介面左側，設定激發光源波長、掃描速度、明暗對比強度、單顆點的螢光強度顯示及選取局部掃描的範圍等功能。. 圖 3-8 MidaScan 介面. 23.

(33) 3-2-6 孔盤成長室(FAST slide incubation chambers) 此孔盤為面積 75 × 25 mm 玻片的反應槽，可將玻片分隔成十六區塊，每個區塊進行不同的實驗條件，可以在同一時間下嘗試更多的實驗參數，達到一片多用的目的。. 圖 3-9 孔盤成長室. 3-2-7 X 射線光電子能譜儀(X-ray Photoelectron Spectroscopy，. XPS) Thermo Scientific，Theta Probe 原理：用已知固定波長(即固定能量)的 X 射線轟擊樣品，把樣品中原子裡的電子推出來，然後測量撞出電子的動能及動能值的電子束。. 圖 3-10 XPS 原理圖 24.

(34) 3-2-8 迴轉式震盪恆溫水槽(Orbital Shaking Baths) 可設定水浴溫度及左右搖晃速度，使實驗能在定溫下均勻進行，調整搖晃速度也可以促使反應加速進行。. 圖 3-11 迴轉式震盪恆溫水槽. 3-2-9 能量散射 X 射線光譜 (Energy-Dispersive X-ray. Spectroscopy，EDS) EDS 用高能電子轟擊樣品，樣品內基態電子吸收能量後激發到激發態，由於處於激態的電子不穩定，因此會回到基態釋出能量，這種能量是以 X 射線出現，因為原子核外電子的基態和激發態所對應的能量都是分立的能級，所以它們的能量差也就是釋放的 X 射線的能量，是個特定的能量值，這些 X 射線是特徵 X 射線。 EDS 是一種可以與 SEM、TEM 配合使用的分析技術，當 EDS 和這些影像工具結合時，可以提供直徑小至 nm 的區域進行元素分析，電子束對樣品的撞擊會產生樣品元素的特性 X-射線，EDS 分析可用於確定單點的元素成分。. 25.

(35) 3-3 實驗步驟 3-3-1 玻片清洗 & 玻片修飾 Succinic anhydride 1. 清洗玻片：將玻片分別放入丙酮、甲醇、二度水中，在超音震盪池內清洗各五分鐘。. 2. Succinic anhydride 修飾：將五片玻片放入 Dish 中，加入 0.45 g 的 Succinic anhydride、25 mL 的 DMF、606 µL 的 DIPEA，在室溫下反應 18 小時，玻片上的-NH2 置換成-COOH，使後面長晶實驗的反應速度不會太快，粒子尺寸可以較為一致。. 3-3-2 一次長晶法-製備金的晶種(seed) 1. 將恆溫水槽溫度設定為 10 ℃，在水槽中放入玻璃器皿，並放入八片玻片在玻璃器皿中，加入 43 mL 的去離子水、1 mL 的氨水、6 mL 的四氯金酸，轉速調為 60 rpm，反應十五分鐘。. 26.

(36) 2. 用去離子水將玻片表面上未吸附的錯合物洗去，將恆溫水槽溫度設定為 10 ℃，在水槽中放入玻璃器皿，倒入 1 mM 的硼氫化鈉溶液，轉速調為 60 rpm，反應五分鐘。. 3. 用去離子水將玻片表面上殘留的溶液洗去，將恆溫水槽溫度設定為 10 ℃，在水槽中放入玻璃器皿，倒入 75 µM 的四氯金酸溶液，轉速調為 60 rpm，搖晃五分鐘後再靜置十分鐘。. 27.

(37) 3-3-3 二次長晶法-將銅長在玻片上，形成 Cu/Au nano film 1. 配置二次長晶法的溶液：取 27 mL 的二次水、20 mL 的 0.1M 硫酸銅溶液、 50 mL 的 0.1M 乙二胺四乙酸溶液、3 mL 的乙醛酸，搖晃均勻後加入氫氧化鈉溶液至將 pH 調至 11.50。. 2. 將恆溫水槽溫度設定為 47.5 ℃，在水槽中放入玻璃器皿，並在玻璃器皿中放入一片玻片，倒入所配置好的二次長晶溶液，將轉速設為 47 rpm 搖晃五分鐘，即製備出 Cu/Au nano film。. 28.

(38) 3-3-4 奈米銅薄膜表面修飾 1. 取 20 µL 的(3-Aminopropyl) triethoxysilane 溶於 100 mL 酒精中，將銅片浸泡在此溶液中 12 小時，使銅片的表面吸附上硫醇基，減少銅片表面與氧氣的接觸，亦可使後面的修飾更加容易。. 2. 銅片浸泡在 150 µL 的 TEOS 與 50 mL 酒精相混的溶液中，在 50 ℃ 下反應 1 小時，將銅片用二度水及酒精沖洗後甩乾；接著再將銅片浸泡在 400 µL 的 APTES 與 100 mL 甲苯相混的溶液中，在 70 ℃ 下反應 1 小時，將銅片用二度水及酒精沖洗後甩乾即可，此時銅片的表面有二氧化矽保護，使其不易與空氣接觸而氧化。. 3. 將修飾上二氧化矽的銅片，利用先前 Succinic anhydride 修飾實驗，將表面的 -NH2 置換成-COOH。. 4. 取 28 mg 的 NHS + 51 mg 的 DCC 溶於 25 mL 的 DMF 中，將銅片浸泡在此溶液中反應 30 分鐘，此步驟為 DCC/NHS 活化銅片上的-COOH。接著倒入 52 mg 的 8arm-PEG10K-NH2 + 174.29 µL 的 DIPEA + 10 mL 的 DMF 溶液，以轉速 40 rpm 搖晃 2 小時，此步驟可以使得-COOH 與-NH2 連接在一起。. 5. 取 61 mg 的 Biotin + 174.29 µL 的 DIPEA + 28 mg 的 NHS + 51 mg 的 DCC 溶於 25mL 的 DMF 中，以轉速 40 rpm 搖晃 12 小時，此步驟可以使得-COOH 與-NH2 連接在一起，讓之後的 Streptavidin-IR800 的修飾更加容易。. 29.

(39) 3-3-5 奈米銅薄膜修飾上螢光分子 Streptavidin-IR800 以 NaHCO3 作為溶劑，配置不同濃度的 Streptavidin-IR800，分別為 1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 µg/mL，在 16 孔盤中各濃度分別滴入 100 µL，以轉速 40 rpm 搖晃 30 分鐘後將染劑倒掉，接著用溶劑 NaHCO3 150 µL 滴入每個孔洞中，以轉速 40 rpm 搖晃 5 分鐘，此步驟重複三次，用玻片離心機將玻片殘留的溶液甩乾，最後用 MidaScan 測試螢光強度。. 30.

(40) 第四章研究過程與結果討論 4-1 無電鍍銅-還原劑選擇圖表 2 還原劑比較表維他命 C. 乙二醛. 乙醛酸. Ascorbic acid (AA). Glyoxal. Glyoxylic acid. 實驗藥品. H2O+CuSO4. H2O+CuSO4+EDTA. H2O+CuSO4+EDTA. 實驗溫度. 50℃. 60℃. 48℃. pH 值. ---. Unstable. Stable. (decrease pH:12 to 9). (pH:11.5). 表面形貌. Uniform. Uniform. Uniform. 螢光強度. ---. < 10. 60↑. 經實驗後將參數整理為上表，由表可以得知用乙醛酸當作還原劑時，添加氫氧化鈉調整 pH 值，溶液中的 pH 值穩定，不會隨時間有很大的變化，使得所製備出的銅片表面形貌均勻，經過螢光測試後，銅片和對照組相比，螢光強度增強 60 倍左右。. 31.

(41) 32. ( 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid). MES. (Phosphate-buffered saline). PBS. (Sodium bicarbonate). NaHCO3. oxide. disappear. constant. disappear. BTP. (Bis-tris propane). Result. Buffer Solution. 70 min. 70 min. 70 min. 70 min. Time. 7.3. 7.0. 8.62. 10.36. pH. 0.01 M. 0.01 M. 0.01 M. 0.01 M. Concentration. 4-2 Buffer Solution 選擇.

(42) 本研究將 NaHCO3 作為螢光物質 Streptavidin-IR800 的溶劑，以下各種緩衝溶液對照上頁表格，將其適合/不適合之處依序解釋說明。. I. BTP 溶液因 pH 值過高，在銅片上反應 70 分鐘後，銅片被緩衝溶液蝕刻掉，且從圖表 1 不同金屬緩衝液之間的複合強度[37]中，可以發現銅與 BTP 反應後會有錯合物產生，因此在本實驗中不適合當螢光物質的緩衝溶液。. II. PBS 和 MES 溶液雖 pH 值為中性，將其兩種溶液與銅片反應 70 分鐘後，發現滴加 PBS 的銅片被緩衝溶液蝕刻掉，由此可以得知 pH 值為 7.0 對於銅片而言還是太過於酸性；另外滴加 MES 的銅片表面有明顯的氧化現象，因此在本實驗中皆不適合當螢光物質的緩衝溶液。. III. NaHCO3 在水溶液中呈弱鹼性，將緩衝溶液滴加在銅片上，銅片表面經 70 分鐘後不會有氧化或是蝕刻的情況，因此將 NaHCO3 作為本實驗螢光物質的緩衝溶液。. 33.

(43) 4-3 實驗過程 SEM 及 TEM 圖 4-3-1 Au seed top view. 圖 4-1 Au seed. 34.

(44) 4-3-2 Au 75 µM nanoparticle top view. 圖 4-2 Au 75 µM nanoparticle. 35.

(45) 4-3-3 還原劑選擇由於乙醛酸及乙二醛兩種還原劑製備的銅片，表面皆為均勻光亮，因此在選擇適當的銅片前，做了一連串的鑑定及測試。從 SEM 開始鑑定，可以看出兩種銅片顆粒均勻重疊，由斷面也可以看出厚度相近，約 100 nm 左右。. 圖 4-3 還原劑-乙二醛銅片. 36.

(46) 乙醛酸(Glyoxylic acid). 圖 4-4 還原劑-乙醛酸銅片. 37.

(47) 文獻中[39]有提到，小顆的奈米粒子對光會有較多的吸收，適合運用在熱轉換的光熱應用[40]，若為較大顆的奈米粒子則會對光有較多的散射，適合運用在生物標記上，包括金屬螢光增強[41]及表面增強光譜。SEM 經 Image J 程式計算後，得知從長晶開始顆粒逐漸增大，最後還原劑為乙醛酸製備的奈米銅薄膜顆粒尺寸最大，從後面的實驗結果證實，乙醛酸(顆粒較大者)螢光增強較好，與文獻結果相符。. Particle size (nm) Au seed. 7.974. Au particle. 14.056. (75 µM of AuHCl4) Copper nanoparticle. 40.78. (Thermal evaporation) Copper nanoparticle. 56.834. (Glyoxal) Copper nanoparticle (Glyoxylic acid). 38. 82.

(48) 另外，有利用蒸鍍機製備銅奈米薄膜，但因實驗花費時間多且不具創新力，因此在後面實驗沒有再使用熱蒸鍍 (Thermal Evaporation)方式的銅薄膜。. 圖 4-5 還原法-熱蒸鍍銅片. 39.

(49) 接著，再利用 TEM 鑑定顆粒表面氧化的程度，當還原劑為乙二醛時，銅片的氧化層範圍很大，製備出的銅幾乎都會氧化為氧化銅；當還原劑為乙醛酸時，銅顆粒表面形成氧化銅之後，範圍不會繼續擴大，氧化層可以作為銅的保護層，使內部的銅不會繼續氧化。可以得知，利用乙二醛當作還原劑的銅片，氧化層比例較高，因此在後續的螢光強度增強實驗中，選擇用乙醛酸當作還原劑製備銅奈米薄膜。乙二醛 (Glyoxal). 乙醛酸 (Glyoxylic acid). 圖 4-6 TEM-還原劑乙二醛及乙醛酸. 40.

(50) 4-3-4 乙醛酸成長過程. Glyoxylic Acid (Top view & Cross sectional view) 本研究將乙醛酸作為還原劑，利用 SEM 記錄其顆粒形貌和銅片厚度，從圖片中可以看出銅奈米粒子隨著反應時間的增長，顆粒形狀越來越清楚明顯，且厚度也會隨之增加，經由實驗也發現到，當銅片到達一定厚度(大約 100 nm)時，銅奈米薄膜會因厚度過厚而隨之剝落，因此本研究在後續的螢光增強實驗中，銅片的厚度以反應時間 5 分鐘(大約 100 nm)為主。. Growth time : 2 min. 41.

(51) Growth time : 3 min. Growth time : 4 min. Growth time : 5 min. 圖 4-7 SEM-乙醛酸銅片生長過程 42.

(52) 4-3-5 Glyoxylic Acid - Modified by SiO2. No rotation - top view & cross sectional view. Rotation - top view & cross sectional view. 圖 4-8 銅片修飾 SiO2. 因銅片與空氣接觸後易形成氧化銅，進而影響螢光增強效果，因此利用 TEOS 和 APTES 在銅表面修飾二氧化矽，減少銅片與空氣接觸的機會。由 SEM 圖可以看出，在反應的過程中，若溶液沒有均勻搖晃，銅片在螢光增強的實驗步驟中，會因二氧化矽顆粒大小不均，進而影響螢光強度，因此在修飾的過程中，會將溶液搖晃均勻，使修飾在銅片上的二氧化矽顆粒大小較為均勻，由 SEM 也可以清楚的看出，經搖晃後二氧化矽的顆粒均勻度有明顯的改善。 43.

(53) 4-4 還原劑與螢光強度的關係經螢光增強測試後，由下表可以看出由乙醛酸還原劑製備的銅片，增強倍率最高約為 60 倍左右，與乙二醛(不到 10 倍)相比，增強倍率相差甚多。. 圖 4-9 不同還原劑比較螢光強度. 44.

(54) 4-5 Streptavidin-IR800 反應時間與螢光強度的關係經下表的實驗結果得知，當螢光染劑 Streptavidin-IR800 與銅片反應時間越久時，螢光強度會隨之下降。在實驗中發現，修飾在銅片上的二氧化矽厚度若是過大，螢光分子和銅奈米粒子會因間距太大無法相互作用，而使螢光強度下降，因此二氧化矽在銅片上的厚度，介於銅片不易氧化且螢光分子和銅奈米粒子間距不會過大的中間值，所以當銅片與螢光染劑反應時間過久時，銅片會有少許部分被氧化，而使螢光強度下降，最後確定染劑分子與銅片最佳反應時間為 30 分鐘。. 圖 4-10 比較染劑與銅片反應時間-螢光強度測試. 45.

(55) 4-6 UV 圖 4-6-1 Glyoxylic acid. 2.2 2.0 1.8. Abs (a.u.). 1.6. 5 min 4 min 3 min 2 min 1 min. 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 400. 500. 600. 700. 800. 900. 1000. Wavelength (nm). Abs (a.u.). 4-6-2 Glyoxal. 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 300. 5 min 4 min 3 min 2 min 1 min. 400. 500. 600. 700. 800. 900. 1000. Wavelength (nm). 圖 4-11 銅片生長時間 UV 圖譜. I. 由圖譜中得知隨著反應時間增加，UV 吸收會隨之增加，進而證實銅片會隨著反應的時間增加而增厚。 II. 從圖譜中看出銅的 LSPR peak 和 IR800 的放光波長有重疊，且較窄的間隙會使金屬的局部電磁場增強，進而證實銅奈米粒子會有螢光增強的現象產生。 46.

(56) 4-7 XPS 圖譜 4-7-1 S-的 XPS (A) 90. S-H (163.35 eV). S2p S-Cu S-H S-S. 80. % 26.6 64.5 8.8. Counts. 70 S-Cu (161.9 eV) 60 S-S (164.85 eV). 50 40 160. 162. 164. 166. 168. Binging Energy (eV). (B). 圖 4-12 銅片 XPS 鑑定-SH. 利用水溶液法製備出銅片後，會先將其放入硫醇的酒精溶液中反應 24 小時，以防銅片與空氣直接接觸，也使後續實驗二氧化矽可以均勻的修飾在銅片上，圖(A) 為本實驗的銅片 XPS 圖譜，將銅片經過硫醇(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 修飾後，圖譜中的 161.9 及 163.35 峰，經對照文獻資料圖(B)[42]後，分別為 S-Cu 及 S-H 的特徵峰，確定銅片有修飾上硫醇。 47.

(57) 4-7-2 Cu-的 XPS (A). 4000 3500. Cu2p3/2 (932.25 eV). 3000. Counts. 2500. Cu 2p. %. S-Cu. 4.43. Cu. 91.30. CuO. 4.26. Cu2p1/2 (952.05 eV). 2000 1500 1000. Cu2p3/2 (933.25 eV). 500 Cu2p (931.1 eV) 0 925 930 935. 940. 945. 950. 955. 960. Binding Energy (eV). (B). 圖 4-13 銅片 XPS 鑑定-Cu. 將製備的銅片測 XPS 後，圖(A)為實驗圖，圖譜中 932.25 eV 及 933.25 eV 峰，經對照文獻資料[43]，圖(B)後，可以得知為 Cu2p3/2 的特徵峰，另外圖譜中有 952.05 eV 峰，從文獻中可以得知是 Cu2p1/2 的特徵峰。 48.

(58) 4-8 EDS. Element. At. NO. Mass Norm (%). Atom (%). Copper. 29. 57.25. 80.59. Gold. 79. 42.75. 19.41. 100.00. 100.00. Sum. Element. At. NO. Mass Norm (%). Atom (%). Copper. 29. 95.39. 98.46. Gold. 79. 4.61. 1.54. 100.00. 100.00. Sum. 圖 4-14 銅片 EDS 鑑定 49.

(59) 因要確定在後續的螢光增強測試中，造成螢光增強的金屬為元素銅，而非其他元素，因此將所製備出的薄膜做 EDS 鑑定，由上表可以看出當實驗反應五分鐘時，薄膜表面的銅元素高達 98.46 %、金元素為 1.54 %。從實驗步驟得知，玻片在長銅薄膜前有經過金 seed 的前處理，SEM 中可以看出銅片表面顆粒有細窄的間隙，因此有少量的金元素，從 EDS 結果證實在後續的螢光增強實驗中，影響螢光增強效果的為元素銅。. 50.

(60) 4-9 螢光增強測試. 圖 4-15 螢光增強測試. 本實驗製備的銅片與空白玻片對照，因奈米金屬銅片對螢光染劑會有金屬螢光增強(Metal-Enhanced Fluorescence , MEF)的現象，藉由儀器 MidaScan 測試後，螢光強度增強最高倍率大約 60 倍左右。. 51.

(61) 第五章結論與未來展望. 本實驗在水溶液中以無電鍍方式，藉由調控反應溫度、pH 值、搖晃速率等參數，利用乙醛酸當作還原劑製備銅奈米薄膜(Nano copper films)。銅片表面用硫醇及二氧化矽的修飾後，銅薄膜因與空氣接觸面積大幅下降，使得氧化現象趨緩，表面滴加上螢光染劑 Streptavidin-IR800，實驗後發現螢光分子與銅片反應為半小時的螢光強度最佳，經儀器 MidaScan 測試後，得到螢光強度增強約 60 倍左右。. 未來期許利用此實驗方式製備的銅奈米薄膜，進行酵素連結免疫吸附檢測(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)，進一步探討對於生醫檢測方面的潛能，利用螢光增強的現象，觀察標記腫瘤細胞，能加強影像的明暗對比，使臨床判讀上更加正確，在得病初期給予妥善治療，期許未來能應用於更多的疾病檢測上。. 52.

(62) 第六章參考文獻 1. 牟中原、陳家俊，科學發展 2000，28 (4)，281-288。 2. 張立德，奈米材料 2002。 3. 曹茂盛、關長斌、徐甲強，奈米材料導論 2002。 4. Wang, Y.； Herron, N.；et al. The Journal of Physical Chemistry, 1991, 95, 525532. 5. Berends, A.； Donega, C.；et al.The Journal of Physical Chemistry Letters, 2017, 8, 4077-4090. 6. Mirzaei, J.； Reznikov, M.； Hegmann, T.；et al.Journal of Materials Chemical, 2012, 22, 22350-22365. 7. 周家慶，以超順磁粒子純化溶菌酶，2008。 8. Thevenot, J.；et al.Chemical Society Reviews, 2013, 42, 7099-7116. 9. Cao, Y.； Jin, R. Mirkin, C.；et al. Journal of the American Chemical Society, 2001, 123, 7961-7962. 10. Aslan, K.；et al.Journal of the American Chemical Society, 2007, 129, 15241525. 11. Wang, Y.； Asefa, T.；et al.Langmuir, 2010, 26, 7469-7474. 12. Zhang, K. Nanotechnology, 2007, 18, 275607. 13. Sugawa, K.；et al. ACS nano, 2013, 7, 9997-10010. 14. Sugawa, k.；et al. ACS applied materials & interfaces, 2017, 9, 750-762. 15. Sokolov, K.； Chumanov, G.；et al. Cotton, T. Analyical Chemistry, 1998, 70, 3898-3905. 16. Hayakawa, K.；Selvan, S.； Nogami, M. Applied Physics Letters, 1999, 74, 1513-1515. 53.

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