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行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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亞硫酸基轉移酵素之反應機制：
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※ 酚亞硫酸基轉移酵素之分子模擬、 ※
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化學變性與定點突變
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計畫類別：
個別型計畫
計畫編號：
NSC 89-2113-M-009-009
執行期間： 88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日
計畫主持人：楊裕雄
執行單位：
國立交通大學 生物科技學系
中 華 民 國 89 年 10 月 31 日
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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
亞硫酸基轉移酵素之反應機制：
酚亞硫酸基轉移酵素之分子模擬、化學變性與定點突變
Mechanism of Sulfuryl Group Transfer: Molecular Modeling, Chemical Modification and Site-Directed Mutagenesis of Phenol Sulfotransferase
計畫編號：NSC 89-2113-M-009-009 執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 7 月 31 日 主持人：楊裕雄 國立交通大學 生物科技學系 E-mail:ysyang@cc.nctu.edu.tw 計畫參與人員：陳正偉(研究生兼任助理) 國立交通大學 生物科技學系 中文摘要： 本實驗使用類比法 (Homology) 來模 擬酚亞硫酸基轉移酵素的蛋白質結構，其 骨架則是依據動情激素亞硫酸基轉移酵素 (Estrogen sulfotransferase)的 X-ray 單晶繞 射結構(1aqu of PDB )。我們可利用模擬出 的酚亞硫酸基轉移酵素結構來解釋突變種 酚亞硫酸基轉移酵素(K65ER68G)的獨特 活性，並說明胺基酸 C66，C82 和 C232 之 間的相互關係與功能。由結構中我們發現 環狀區胺基酸序列區 64~69 是位於受質結 合區的開口區附近而且可能作為控制受質 進出的活動閘門。經過胺基酸序列的分析 以及相關已解出結構的亞硫酸基轉移酵素 所提供給我們的資訊皆指出此環狀區是屬 於易滑動的。由前人所做的實驗數據以及 我們所做的模擬結構中，我們可以說明此 環狀區域位於酵素活性區的通路上，對於 調控產物的釋出是非常重要的。主要的關 鍵在於，C66 和 C82 或是 C66 和 C232 所形成的雙硫鍵能夠固定住此易滑動的環 狀區域，並且防止它阻礙到受質的結合或 是產物的放出。另外由模擬的結構我們可 以發現序列 K65 與 R68 的正電荷對於環狀 區與酵素的活性區進出口之間的相互關係 也是很重要的。這個發現也可以用來解釋 為什麼突變種(K65ER68G)酵素只包含β 型(無受質 PAP)：此原因為突變後形成的 負電荷使得原本可以擋住受質進出口的滑 動環狀區遠離，同樣的也可以解釋為何突 變種(K65ER68G)酵素的生理反應活性可 以不需經由氧化就能達到與野生種酵素氧 化後得到的活性一樣。 關鍵詞：硫酸化；核甘酸；亞硫酸基轉移 酵素酵素；酵素反應機制。 Abstr act
The structure of phenol sulfotransferase (PST) is build by the method of Homology (Insight II) from the crystal structure of estrogen sulfotransferase (1aqu of PDB). The modeled PST structure is used to explain the unique activity of a mutant (K65ER68G) and to elucidate the function of and interaction among C66, C82 and C232. The loop region 64-69 is found outside of the substrate-binding site and may serve as a door of the entrance or exit of the active site. Data analysis of the amino acid sequence and information from known structure of sulfotransferases all indicate that this region is very flexible. From the previous experimental data and our modeling study, we are able to demonstrate that this region is in the way of the enzyme active site and is important for the regulation of the release of products. Formation of disulfide bonds between C66 and C82 or C66 and C232 immobilizes this flexible region and prevents it from hindering substrate binding or product release. The modeled PST structure also shows that positive charges at K65 and R68 are important for the interaction of the loop region with PST active site. This
observation explains why only β form (PAP
free) of K65ER68G is obtained for the flexible loop region is no longer available as a cover after being mutated to contain a negative charge. The same reason explains the physiological activity of K65ER68G is obtained without oxidation, which is required by wild type PST.
Keywor ds: Sulfation; Nucleotide;
3’-3
Phospho Adenosine 5’-Phosphate (PAP); 3’-Phospho Adenosine 5’-3’-Phosphosulfate (PAPS). 緣由與目的 酚 亞 硫 酸 基 轉 移 酵 素 (Phenol Sulfotransferase ， PST) 或 稱 (Aryl Sulfotansferase,AST)(EC 2.8.2.9)。其在人體 內的主要功能是將亞硫酸基自 PAPS 催化 轉移至酚類的受質上，可使外來的酚類有 機物質形成易溶於水的化合物，而有利於 將其排出體外，達到解毒的效果，所以 我們可將其歸類為解毒酵素。 我們所研究的酚亞硫酸基轉移酵素 是由鼠肝中所找到的鼠肝第四型酚亞硫酸 基轉移酵素(PST IV)，我們以轉移反應以 及生理反應來表示以及測量此酵素的活 性。轉移反應是利用 p-Nitrophenyl sulfate、 β−Naphthol 當反應物，PAP 當輔因子，利 用酵素反應所產生的 p-Nitrophenol 來測 定酵素的反應活性。[1] 不過當我們將此酵素之 cDNA 轉錄在 大腸桿菌中表達時，我們可發現兩種型式 的酵素，分別為 α型及 β型，其差別在於 β 型酵素其結構內不包含受質 PAP，而也由 於其不含受質 PAP 所以 β型酵素的三級 結構以及穩定性會和 α型有所不同。[1] 另外我們所純化出的突變種酚亞硫酸基轉 移酵素(K65ER68G)，其所表達的酵素幾乎 全為 β型酵素，對於突變後所造成的影響 也無法解釋。[1] 本實驗主要為研究酚亞硫酸基轉移 酵素因氧化還原產生的結構改變，與受質 PAP 反應的理論模型。我們所推論的模型 可由幾點來印證 (1) 1994 年 Duffel 等人利 ATPDA 「2'-O-[(R)-Formyl(adenin-9-yl) -methyl]-(S)-glyceraldehyde 3'-triphosphate」、「ATP dialdehyde」做親和 性試驗定出 PAPS 結合位，發現胺基酸序 列
63-Leu-Glu-Lys-Cys-Gly-Arg-68 會和 PAPS 類似物 ATPDA 結合， 而我們推測此區域可移動靠近 PAPS 與其
產生結合[1]，(2)利用已知的 Estrogen 亞硫
酸基轉移酵素結構(1997 年 Kakuta 等人解
出 X-ray 單晶結構 pdb code: 1aqu)[2]，我們
用類比法(Homology)模擬出酚亞硫酸基轉 移酵素的結構,再以結構觀察 PAP 的結合 位置發現序列 64∼69 的位置並不是位於 PAP 結合區，而是屬於可隨意移動的環狀 區(loop)(可由胺基酸序列分析以及此區域 在已解出結構的同家族亞硫酸基轉移酵素 也並未能解出的證據推論其為可隨意移動 的環狀區)， (3)經由亞硫酸基轉移酵素家 族的胺基酸序列比對我們也可以發現相似 度高且經由結晶已確認出的 PAP 結合區中 並無包括序列 64~69[2]，(4)1996 年 Yang 等人做出突變種(K65ER68G) 酚亞硫酸基 轉移酵素對 PAP 的結合能力較弱，且純化 出的酵素全為不含 PAP 的β 型[3]， (5)1997 年 Marshall 等 人 用 質 譜 法 (Mass spectrometry)發現酚亞硫酸基轉移酵素中 胺基酸 Cys66 氧化或與 Cys232 形成雙硫鍵 對酵素的活性扮演著一個相當重要的角 色，並且 Cys66 為大多數的亞硫酸基轉移 酵素所擁有，屬於保留性的序列(conserved residue)。 經由以上的證據再加上我們所做的分子模 擬我們推論出氧化還原對酵素結構改變的 模型,即加入氧化劑(GSSG)後將會造成 Cys66 與 Cys232 或 Cys66 與 Cys82 形成雙 硫鍵使得原本易滑動的 64~69 的 loop 固 定住，這樣 PAP 進出酵素的通道即不被阻 礙，我們由轉移反應(以 PAP 當輔因子，不 須放出)以及生理逆反應(以 PAP 當受質， 須放出才能反應)可以看出很大的差別，另 外突變種(K65ER68G)於結構中是因為電 荷的改變造成環狀區不易接近酵素的受質 進出口區，使的酵素易形成不含 PAP 的 型，同樣的也可以解釋為何突變種 (K65ER68G)酵素的生理反應活性可以不 需經由氧化就能達到與野生種酵素氧化後 得到的一樣活性。所以藉由本實驗能證明 我們所提出的酵素反應理論，也能讓我們 更明顯看出受質在酵素內的結合與反應路 徑與順序。 結果與討論 本實驗所推論的反應簡圖，可說是經 由前人所努力的實驗結果，再加上近年來
4 同家族的酵素結構紛紛被解出，而我們利 用分子模擬的方法，找出重要的胺基酸序 列在結構中的相對位置及可能的交互作 用，進而推論出氧化後的酵素其實驗結果 所帶來的結構上的意義，這可以說是水到 渠成所得到的實驗結論，利用分子模擬三 維結構所帶來的資訊，我們瞭解了以前一 直不明瞭的實驗結果。而且能更清楚的看 到受質在酵素內的結合情形，這對研究酵 素蛋白質工程或是酵素反應機制的科學家 來講可說是相當重要的資訊，他們可以利 用此資訊選擇要突變的胺基酸，使酵素的 穩定性增高或是改變其受質的特異性，創 造出理想或是所謂的超級酵素。以往我們 要了解蛋白質結構一定要透過 X-ray 解 單晶 或 是 NMR 核 磁共振光 譜才能 得 到。雖然說分子模擬帶給我們的並不是百 分之百的準確結構，但是對於相似度高的 酵素(50%以上)其所做出的酵素結構還是 有一定的參考價值，來提供我們做下一步 更深入的研究。以我們的酚亞硫酸基轉移 酵素來講，我們可以利用分子模擬所做出 的結構對不同的 PAP 類似物進行結構上的 比對，找尋三度空間中相對應的胺基酸， 藉由突變特定區域的胺基酸達到替換受質 的目的，相信分子模擬是研究酵素非常好 的工具。也期待因為有了參考結構，能使 我們的研究更向前邁進一步。 參考文獻
[1] Zheng Y, Bergold A, and Duffel MW, (1994), Affinity labeling of aryl sulfotransferase IV. Identification of a peptide sequence at the binding site for 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate, J. Biol. Chem. , 269: 30313-9.
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McPhie P, Jakoby WB, (1997), Control of activity through oxidative modification at the conserved residue Cys66 of aryl sulfotransferase IV, J. Biol. Chem. , 272:9153-60.
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[8] Andrew R. Leach, 1996,MOLECULAR MODELLING PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Addison Wesley Longman Limited.
[9]DENNIS LIOTTA, 1995, ADVANCES IN MOLECULAR MODELING , Volumn 3. [10] 原 作 者 : Gerald M. MaggioraS ， Lakshmi Narasimhan..等，改寫者:何智雄， 蛋白質分子三維結構預測方法-類此方法 ( Homology ) 簡介，國家高速電腦中心， Technical Report。 [11] 謝昌煥，解讀生物巨分子結構資料庫 PDB 與 SCOP ， 國 家 高 速 電 腦 中 心 ， Technical Report。
