National University of Kaohsiung Repository System:Item 310360000Q/10477

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(1)國立高雄大學生物科技研究所碩士論文. 磁性誘導凝膠之製備及在許旺細胞培養之應用 Preparation of magnet-induced gels and their applications for growth of Schwann Cells. 研究生：王文萱撰指導教授：鍾宜璋博士. 中華民國 98 年 07 月.

(2) 謝碩士的這兩年在忙碌的生活中匆匆溜過，首先我必須要感謝鍾宜璋老師的諄諄教導，陪同我們一起經歷實驗上的困難，並能適時的給予正向的意見及應有的學習態度；此外，亦感謝口試委員給予的寶貴意見及指正，讓這本論文更加豐富完整。當然在這研究的路上，得到許多人的幫助，在研究的討論中，不只給了我許多實驗的靈感，也讓我有了更多的動力去完成這份論文。在此非常的感謝同窗好友淑涵陪我度過了在實驗室奮鬥的時光，以及西米露、小小、國本對我的實驗的互相討論及熱情打氣，還有實驗室的開心果哲宇，讓我在煩悶時可以抒發心情，也讓笑聲充斥在 305-1 實驗室每個角落。當然還要感謝烏龜快遞的晚餐、阿幹熱情的外送飲料、小頭的加油打氣，以及阿桂、阿涓在實驗上的付出。還有張小淵在我遇到瓶頸時，總是在旁提供我意見，若沒有你們的情義相挺，也不會有我今日的成長。另外，最最最感謝的還是皓子學長不計任何酬勞，熱心的幫我完成實驗上的分析，真的可以發給你一張好人卡。最後，我要感謝我的家人，感謝他們在我的求學過程中，默默的付出並且對我任性的決定總是給予支持，使我可以專注於我想做的事情。以及感謝我認識生科所及化財所的朋友們，謝謝你們這段時間來陪我吃飯、聊天、陪我相互抱怨和鼓勵。很幸運能和你們在一起度過這兩年的時光，無論是在研究上或是生活上都讓我覺得，有你們真好！. I.

(3) 目錄謝. .......................................................................................................................Ⅰ. 目錄 .......................................................................................................................II 表目錄 ..................................................................................................................... V 圖目錄 ...................................................................................................................VI 中文摘要................................................................................................................ X 英文摘要.............................................................................................................XII 第一章緒論 .......................................................................................................... 1 1.1 前言 .............................................................................................................. 1 1.2 研究動機與目的 ......................................................................................... 4 第二章文獻回顧.................................................................................................. 5 2.1 磁性奈米粒子 ............................................................................................. 5 2.2 磁學原理...................................................................................................... 6 2.2.1 磁性之分類 .............................................................................................. 8 2.2.2 氧化鐵的種類 ........................................................................................11 2.2.3 磁性奈米粒子的磁滯曲線...................................................................13 2.3 磁性奈米材料的製備方法 ......................................................................18 2.4 磁性奈米粒子的分散性與穩定度 .........................................................20 2.5 磁性奈米粒子在生物醫學應用之評估.................................................22 2.5.1 磁性奈米粒子在生物醫學上的條件限制 .........................................22 2.5.2 磁性奈米粒子在醫療領域之應用 ......................................................23 2.6 磁性凝膠....................................................................................................26. II.

(4) 2.7 天然高分子與細胞的關係 ......................................................................28 2.7.1 幾丁聚醣(Chitosan)...............................................................................29 2.7.2 褐藻酸(Alginate) ...................................................................................33 2.7.3 葡聚醣(Dextran) ....................................................................................37 第三章材料與方法............................................................................................39 3.1 實驗藥品....................................................................................................39 3.2 實驗使用之儀器 .......................................................................................40 3.3 測量儀器....................................................................................................41 3.4 磁性膠體之製備 .......................................................................................45 3.4.1 化學共沈澱法製備磁性奈米粒子 ......................................................45 3.4.2 Core(Fe3O4)/shell(Biopolymer) 磁性膠體之製備 .............................47 3.4.2.1 陽離子膠體之製備 ............................................................................47 3.4.2.2 陰離子膠體之製備 ............................................................................48 3.4.3 磁性纖維之製備....................................................................................50 3.4.4 磁性凝膠交聯成膜................................................................................53 3.5 體外(in vitro)測試評估 ............................................................................56 3.5.1 動物細胞培養 ........................................................................................56 3.5.2 3T3 纖維母細胞的貼附與生長 ............................................................56 3.5.3 許旺細胞的貼附與生長 .......................................................................57 3.5.4 許旺細胞貼附角度分析 .......................................................................58 第四章結果與討論............................................................................................59 4.1 磁性奈米粒子合成之探討 ......................................................................59. III.

(5) 4.1.1 X 光繞射(XRD)分析 .............................................................................61 4.1.2 TEM 型態觀察........................................................................................63 4.1.3 奈米粒子之化學性質分析...................................................................66 4.1.4 磁性測試.................................................................................................71 4.2 磁性奈米一維材料合成之探討..............................................................73 4.3 磁性凝膠合成之探討與成膠測試 .........................................................76 4.4 細胞貼附及排列效果的探討..................................................................81 4.4.1 3T3 纖維母細胞貼附的結果 ................................................................81 4.4.2 許旺細胞貼附的結果 ...........................................................................83 第五章結論 ........................................................................................................88 第六章參考文獻................................................................................................89. IV.

(6) 表目錄表 2-1 磁性物質的分類 .....................................................................................10 表 2-2 鐵氧化物的分類及特性 ........................................................................12 表 2-3 幾丁質/幾丁聚醣的特性及其再生醫材料的應用.............................30 表 4-1 利用不同 Surfactant 合成的磁性奈米粒子之粒徑大小與表面電位比較表...........................................................................................................67 表 4-2 磁性凝膠混合沉澱測試 ........................................................................78. V.

(7) 圖目錄圖 2-1 磁矩示意圖 ............................................................................................... 7 圖 2-2 磁性粒子磁區構造的示意圖.................................................................. 7 圖 2-3 兩相鄰磁區間磁化方向變化情形 ......................................................... 7 圖 2-4 溫度對鐵磁性和反鐵磁性物質之性質轉換圖 ..................................10 圖 2-5 鐵磁性物質的磁滯曲線示意圖............................................................14 圖 2-6 順磁性物質的磁滯曲線示意圖............................................................16 圖 2-7 溫度對順磁性物質的影響 ....................................................................16 圖 2-8 保護劑對飽和磁化率的影響................................................................17 圖 2-9 多功能生物試劑示意圖 ........................................................................21 圖 2-10 藥物引導釋放示意圖 ..........................................................................25 圖 2-11 市售的 Resovist® MRI 顯影劑 .........................................................25 圖 2-12 注射乳醣酸修飾磁性奈米粒子溶液前後兔子肝臟的 MRI 影像.25 圖 2-13 一般凝膠交聯示意圖 ..........................................................................27 圖 2-14 誘導凝膠成薄膜或孔洞結構..............................................................27 圖 2-15 (a)幾丁聚醣，(b)幾丁質化學結構式.................................................30 圖 2-16 利用電紡絲製備磁性奈米纖維培養許旺細胞 ................................31 圖 2-17 利用微溝槽表面改質觀察許旺細胞生長情形 ................................31 圖 2-18 市售之超過濾膜...................................................................................32 圖 2-19 褐藻酸之結構 ......................................................................................34 圖 2-20 褐藻酸和 Ca2+之鍵結.........................................................................34 圖 2-21 許旺細胞之示意圖...............................................................................36. VI.

(8) 圖 2-22 以褐藻酸膠體作為神經導管修復之示意圖 ....................................36 圖 2-16 Dextran Sulfate 的結構式.....................................................................38 圖 2-24 Dextran 與 Chitosan 經由逐層組裝後包覆生長因子做為藥物釋放載體示意圖 ..................................................................................................38 圖 3-1 XPS 原理示意圖......................................................................................42 圖 3-2 表面電位( Zeta potential )偵測原理 ....................................................43 圖 3-3 化學共沉澱法合成磁性奈米粒子流程之示意圖..............................46 圖 3-4 各種 Surfactant 的結構式......................................................................46 圖 3-5 Core/shell 磁性陽離子膠體製備之示意圖 ..........................................47 圖 3-6 Core/shell 磁性陰離子膠體製備之示意圖 ..........................................49 圖 3-7 磁性陰離子膠體製備之示意圖............................................................49 圖 3-8 超過濾膜離心管製備磁性奈米線之示意圖 ......................................50 圖 3-9 綠梔子素(Genipin)結構式 ....................................................................51 圖 3-10 超過濾膜離心管結合滲透方式製備磁性奈米線之示意圖...........52 圖 3-11 利用滲透的方式合成磁性奈米纖維.................................................52 圖 3-12 利用磁性粒子凝膠之實驗流程設計.................................................54 圖 3-13 利用磁性粒子與磁性纖維凝膠之實驗流程設計............................55 圖 3-14 許旺細胞貼附角度分析計算示意圖.................................................58 圖 4-1 以檸檬酸鈉當 surfactant 合成之磁性奈米粒子的 XRD pattern .....62 圖 4-2 以 DMSA 當 surfactant 合成之磁性奈米粒子的 XRD pattern........62 圖 4-3 以褐藻酸鈉當 surfactant 合成之磁性奈米粒子的 XRD pattern .....62 圖 4-4 以檸檬酸鈉當 surfactant 合成之磁性奈米粒子的 TEM 圖.............64. VII.

(9) 圖 4-5 以 DMSA 當 surfactant 合成之磁性奈米粒子的 TEM 圖 ...............64 圖 4-6 以褐藻酸鈉當 surfactant 合成之磁性奈米粒子的 TEM 圖.............64 圖 4-7 以逐層組裝包覆兩種生物高分子的示意圖 ......................................65 圖 4-8 共沉澱法製備出的四氧化三鐵磁性粒子溶液 ..................................65 圖 4-9 包覆天然高分子後表面電位圖之轉換圖...........................................67 圖 4-10 以 X 光電子能譜儀分析包覆 CS 複合粒子表面上的 N 元素與 Fe 元素之能譜變化圖 ................................................................................69 圖 4-11 以 X 光電子能譜儀分析包覆 DS 複合粒子表面上的與 S 元素之能譜變化圖。..............................................................................................69 圖 4-12 以 X 光電子能譜儀分析包覆 AA 複合粒子表面上 C 元素之能譜變化圖...........................................................................................................70 圖 4-13 不同 Surfactant 保護的氧化鐵奈米粒子之 SQUID 圖 ..................72 圖 4-14 包覆 CS 高分子後磁性奈米子之 SQUID 圖 ...................................72 圖 4-15 利用 100K 超過濾膜製備磁性奈米纖維之 TEM 圖 ......................74 圖 4-16 利用 300K 超過濾膜製備磁性奈米纖維之 TEM 圖 ......................74 圖 4-17 以超過濾膜法製備出 CS 奈米纖維後，再利用滲透的方式讓 Fe3O4 在原處形成 .......................................................................................75 圖 4-18 以光學顯微鏡觀察磁性凝膠在玻璃片上成膜的情形 ...................77 圖 4-19 以 SEM 觀察磁性凝膠在玻璃片上成膜表面的結果 .....................77 圖 4-20 強力磁鐵之磁力線示意圖..................................................................79 圖 4-21 利用磁鐵誘導磁性凝膠沿磁力線排列之 OM 圖 ...........................79. VIII.

(10) 圖 4-22 磁性誘導奈米纖維與磁性粒子交聯之 OM 圖(a)磁性奈米粒子不規則的吸附在磁性纖維上，(b)磁性纖維與磁性奈米粒子形成團塊結構...............................................................................................................80 圖 4-23 將 CS 粒子與 DS 粒子之磁性凝膠依等比例混合後成膜於矽晶片上的 OM 圖。(a)原始沉積的薄膜，(b)經過 3T3 細胞貼附 12 小時後，(c)為薄膜的邊緣部分....................................................................82 圖 4-24 將 CS 粒子與 AA 粒子之磁性凝膠依 1：1 比例混合後成膜於矽晶片上後，經許旺細胞貼附培養 24 小時之 OM 及 SEM 圖 ............84 圖 4-25 將 CS 粒子與 AA 粒子之磁性凝膠依 4：1 比例混合後成膜於矽晶片上後，經許旺細胞貼附培養 24 小時之 OM 及 SEM 圖 ............84 圖 4-26 將 CS 粒子與 AA 粒子之磁性凝膠依 9：1 比例混合後成膜於矽晶片上後，經許旺細胞貼附培養 24 小時之 OM 及 SEM 圖 ............85 圖 4-27 將 CS 粒子與 AA 粒子之磁性凝膠依 19：1 比例混合後成膜於矽晶片上後，經許旺細胞貼附培養 24 小時之 OM 及 SEM 圖 ........85 圖 4-28 以空白矽晶片做為對照組，經許旺細胞貼附培養 24 小時之 OM 及 SEM 圖....................................................................................................86 圖 4-29 許旺細胞貼附培養 24 小時後之 OM 放大圖..................................86 圖 4-30 許旺細胞對於不同交聯比例成膜之貼附統計圖............................87 圖 4-31 許旺細胞貼附於材料上之生長方向分佈統計圖............................87. IX.

(11) 磁性誘導凝膠之製備及在許旺細胞培養之應用指導教授：鍾宜璋博士國立高雄大學化學工程及材料工程學系學生：王文萱國立高雄大學生物科技研究所摘要. 本研究乃結合磁性奈米粒子與生物高分子發展出一種磁場誘導成膠的系統。磁性凝膠的形成是以物理交聯和沉澱的方式，加上外部磁場的引導，可以非常容易地控制及誘導粒子到理想的地方形成凝膠，以作為細胞支架和組織再生修復之用。在材料設計中，氧化鐵奈米粒子的磁性核扮演一個重要的角色，它擁有超順磁的特性與生物相容性；此外，利用天然的聚電解質當做外部塗層，可以加強細胞的附著和生長。實驗作法上利用化學共沉澱法，製備出水相分散的磁性奈米粒子(Fe3O4)，並使用界面活性劑保護，再利用逐層組裝包覆相異電荷的生物可分解性高分子，如幾丁聚醣 (Chitosan)和褐藻酸(Alginate)，以形成穩定的生物可分解性分子包裹的表面，稱之為磁性凝膠。之後將陽離子和陰離子奈米粒子膠體依不同比例混合，控制其凝膠形態，最後外加磁場誘導其沉積於基材上，並於基板上置入許旺氏神經細胞，利用顯微鏡觀察細胞生長和貼附情形。磁性凝膠藉由 X 光繞射分析（XRD）、穿透式電子顯微鏡（TEM）、界面電位分析（Zeta potential）、X 光光電子能譜儀（XPS）等鑑定其性質。由 XRD 結果比對文獻後證明本實驗合成的磁性奈米粒子為 Fe3O4 的型態；而 TEM 觀察結果顯示，磁性奈米粒子大小約為 10-20nm，包覆天然高分子後其粒徑變大；測其表面電位得到 CS 包覆粒子為+31.7 mV，而 AA 包覆粒子為-40.3 mV，顯示其在水溶液中可均勻分散且容易造成異電荷相吸；還有 XPS 的能譜變化分析，可證明天然高分子確實包覆於磁性奈米粒子的 X.

(12) 表面。將兩種相異電荷的磁性凝膠依等比例混合時，在外加磁場作用下可形成一均勻薄膜，甚至可以利用磁場誘導其沿磁力線沉積成纖維狀結構，初步在其結構上培養許旺氏神經細胞，發現細胞會吸附在此薄膜上生長。此外，各種不同比例沉積的薄膜，對於神經細胞的貼附程度及生長方向也不盡相同，這都表示未來利用磁性粒子與生物活性分子的結合，可以做為神經導管應用於周邊神經組織之修復。. 關鍵字：磁性誘導凝膠、奈米粒子、天然生物活性高分子、許旺細胞. XI.

(13) Preparation of magnet-induced gels and their applications for growth of Schwann Cells Advisor(s): Dr.(Professor) YI-CHANG CHUNG Institute of Chemical and Materials Engineering National University of Kaohsiung Student: WEN-HSUAN WANG Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT. The study focused on a combination of magnetic nanoparticles and bioactive polymers to develop a magnet-induced gel-forming system. The magnetic gel was able to form a gel by physical crosslink and precipitation, as well as by external magnetic field induction. Thus, we can accessibly transfer particles to desired spots under well control and induction in order to fabricate a scaffold for cell growth and tissue reparation. In the design of materials, iron oxide nanoparticles played an important role because of their superparamagneticity and biocompatibility. On the other hand, the cell growth and attachment was able to be enhanced using natural polyelectrolytes as the outer coating. Experimentally, the well-dispersed magnetic Fe3O4 nanoparticals were prepared by a chemical coprecipitation method. The particle surfaces were passivated and protected using polyelectrolyte surfactants, and then were coated by the opposite-charged biodegradable polyelectrolyte (i.e., chitosan, alginate). As mixing different ratios of chitosan-coated to alginate-coated particles, we were able to control the morphology of gel forming on a substrate with a suitable interaction with the external magnet. The substrates were then XII.

(14) contacted with Schwann cells in a certain time to observe the cell attachment and growth. The magnetic nanoparticles were analyzed and characterized by XRD, TEM, zeta potential meter, XPS, and so on. Fe3O4 structure and crystalline was proved by the XRD analysis as literatures reported. TEM photographs illustrated the nanoparticles sizing as 10-20 nm in diameter. And also the size was increased as being encapsulated by natural polymers. Zeta potential analysis showed the CS-coated particles displayed a highly positive potential as +31.7 mV, while the AA-coated particles as -40.3 mV, demonstrating their well-dispersion and highly attractive interaction between each other. XPS analysis on the composition changes for the particle surfaces also provided an evidence of successful polymer coating. As injecting and mixing the equivalent ratio between the two opposite-charged nanoparticle suspensions, we were able to find the nanoparticles gel-forming to a homogeneous thin film on a substrate under control by an external magnetic field. As changing the magnetic direction and quantity, a fiber-like microstructure was specified. Preliminary cell attachment tests on the fiber-like films, Schwann cells tended to attach and grow along the fiber orientation. All the results demonstrated the gel to be a potential template for repairing peripheral nerve system.. Keywords: magnet-induced gel, nanoparticles, natural bioactive polymer, Schwann cells. XIII.

(15) 第一章緒論 1.1前言近年來有關組織修復工程的研究已被陸續地開發，其中神經組織之修復是非常引人矚目的。關於周邊神經組織損傷修復的方法，臨床上大多採用自體神經移植的方式，不過這會造成捐贈處的神經損傷及手術過程中的傷害，所以許多研究都致力於發展神經導管，利用神經導管引導神經細胞的再生。而在組織修復的過程中，首先需要提供細胞可以貼附生長的表面。因神經細胞在人體內的生長是具有方向性的，故在修復組織時需要調控細胞生長的方向。而貼附之表面的幾何結構、材料性質、表面化學修飾等等，皆會影響細胞的貼附與生長。為了製造出有方向性並可誘導神經細胞生長的表面，我們除了外加磁場的調控磁性凝膠的方向之外，也可由磁性材料本身之幾何結構來發展。因此我們除了利用氧化鐵磁性奈米粒子做為水溶性磁性凝膠之外，還想發展一維的磁性材料，希望以一維結構的磁性材料與水溶性磁性凝膠結合，形成帶有一致方向性的長線形表面結構之交聯膜，以利於後續神經細胞之修復應用。若是之後要在生物體內修復組織且避免手術，其中一種方法便是使用水溶性可注射型磁性凝膠。然而一般文獻上所討論的磁性凝膠 (Magnetic gel) (Liu et al., 2006)，指的是在體外成膠後才植入體內應用的膠體，但可注射型的磁性凝膠特殊之處在於它是一種流動性的材料，可經由體液流到身體缺損部位，然後再以磁鐵誘導其在原位膠凝並形成支架。由於它具有可流動之特性，故有能填充任意形狀的缺損之優點，且. 1.

(16) 大幅降低對植入生物體組織的侵入性破壞，減少二次手術的創傷。目前關於磁性氧化鐵材料的生醫應用方面，顆粒狀的氧化鐵粒子有較多的相關文獻及研究，在一維結構的磁性材料方面，則鮮少人研究其做為生醫材料相關之應用。故本研究製備具磁性的氧化鐵奈米粒子，並利用其可受外加磁場誘導的特性，來進行交聯形成薄膜支架，再使細胞貼附培養於薄膜支架上。但此種方式所形成之材料較無特定方向的結構，所培養的細胞將呈現不具特定方向性的生長，故此技術較不適合用於方向性生長的神經細胞之修復，但是對於纖維母細胞的貼附生長，則可能是還不錯的選擇。而材料本身的性質亦會影響神經細胞的生長。目前用於人工神經導管的生物分子材料，包括聚乳酸(PLA)、聚甘醇酸(PGA)及它們的共聚物 PLGA(張, 2004)、Chitosan (Sangsanoh et al., 2007)、Alginate (HASHIMOTO et al., 2005)、膠原蛋白(Yoshii et al., 2002)等材料，其優點為生物相容性佳，且可被生物降解性的特性，皆為很好的選擇。當然也可以改質上一些蛋白質(laminin)或生長因子，更能幫助細胞貼附於材料上。此外，關於磁性奈米粒子的合成方法已被普遍的發展，我們捨棄分散性較好的超音波製程(陳, 2004)，因為過於分散之粒子不容易被磁鐵所誘導吸引，因而使用步驟較為簡單的化學共沈澱法來製備。化學共沈澱法，係取具有 Fe3+及 Fe2+的鐵鹽物質水溶液，室溫下加入鹼性的水溶液混合攪拌，並反應成磁性氧化鐵奈米粒子(Fe3O4)。再將其加至高溫熟化，之後以離心或磁鐵吸附過濾等方式將環境中多餘的鹼性水溶液移除。反應式如下： 2Fe3++ Fe2++ 8OH- ÆFe3O4 + 4H2O。. 2.

(17) 而一維結構的磁性材料合成方面，除了文獻上利用電紡絲 (Electrospun)的方式製備之外(Chew et al., 2008)，本實驗室也已經發展出利用壓印法做出微米線條，但仍需解決壓印均勻度、殘餘層、脫模方式、模具的選擇等問題。因此我們將嘗試使用新的方式來製備磁性奈米纖維或奈米管，作法如下：選擇市售孔徑大小約為 100nm 的超過濾膜，並利用離心力將超過濾膜上層的 Chitosan 與鐵離子混合溶液擠壓至下層的鹼液中，使其瞬間形成 Chitosan 的磁性奈米纖維或奈米管。製備出的磁性粒子及纖維則以 XRD、TEM、SEM、SQUID 等儀器來鑑定。接著利用磁場誘導使磁性纖維在基板表面進行排列，我們亦將調整磁性凝膠的比例及磁場大小，來製備不同表面結構之纖維薄膜，最後在基板表面培養許旺細胞，利用光學和電子顯微鏡觀察細胞生長和貼附情形。. 3.

(18) 1.2 研究動機與目的奈米氧化鐵在生物醫學與生物工程上的應用，越來越受到矚目，僅在一個外加磁場的作用下即可有各種不同的應用。眾多學者在磁性材料上修飾具生物相容性的物質，欲利用磁性質所產生之非接觸式的力，進行生醫材料方面的研究。在本研究中，欲發展出獨特的水溶性磁性凝膠產品，其主要成份為奈米級的氧化鐵粒子，以及與氧化鐵粒子結合的生物高分子聚合物，其中的氧化鐵粒子在奈米尺度下會具有超順磁的特性，故可受外加磁場的誘導調控。然而製備磁性奈米粒子的方法有很多種，因此本研究將改善不同文獻之作法，並針對生醫領域的應用，以水相法製備水溶性的超順磁奈米氧化鐵粒子(Fe3O4)，並以逐層組裝的技術，將不同離子型態的天然高分子，如幾丁聚醣(Chitosan)、葡聚醣(Dextran)、褐藻酸(Alginate)等，包覆在磁性奈米粒子表面，且在水中形成分散良好的懸浮液，稱之為磁性凝膠。使用天然高分子主要的優點是低免疫源性及材料來源充足，且具備相當良好的生物相容性及生物可分解性，能作為組織工程修復之材料。另一方面，我們進一步探討磁性凝膠應用於周邊神經的修復，因為神經細胞在人體內的生長是具有方向性的，故在修復組織時需要調控細胞生長的方向，而貼附表面的結構、材料性質、表面化學修飾等，皆會影響細胞之生長貼附。因此我們欲以外加磁場誘導磁性凝膠排列出具方向性的表面圖案，以供後續進行許旺細胞培養，觀察其表面誘導圖案對細胞的親和力。. 4.

(19) 第二章文獻回顧 2.1 磁性奈米粒子「磁性奈米粒子」，顧名思義即是擁有磁性質的奈米粒子，因此會受到磁場環境的影響，產生相應的行為。而一般物質的組成成分中含有鐵、鈷、鎳這三種元素時，會有磁性質的表現，而且這三種元素也是目前自然界中主要構成磁性物質的成分。若將這三種元素與其他元素結合或取代，則可形成具有不同特性的磁性材料，這些材料隨著自身磁性的差異都有不同的應用價值。磁性奈米粒子又可稱為「磁流體(ferrofluid)」，因為從巨觀看來它便是具有磁性的流體。但在微觀之下，這是磁性奈米粒子穩定的分散在溶劑中且沒有產生聚集的現象，當磁鐵靠近時會產生磁場誘導，故可觀察到粒子被吸引的現象(Donadel et al., 2008 )。若此時移動磁鐵，磁性奈米粒子亦會跟著磁鐵滑動，如同流體一樣。因此這種磁流體之特性即是：當外加磁場存在時，磁性奈米粒子即展現可磁化的性質；當沒有外加磁場時，磁性奈米粒子就與一般的液體狀態相同。. 5.

(20) 2.2 磁學原理磁矩是磁學中最基本的單位，又稱為「磁偶極矩」，為一不可切割之最小組成單位。原子藉由電子的自旋及環繞著原子核運動而產生磁偶極矩，即類似一根小磁棒，如圖2-1所示(金, 2002)。在磁性質的描述中有所謂的磁區(magnetic domain)的概念，具有磁性的物質根據本身的能量分佈狀態，會將晶體區分成幾個不同的區域，而在同一個磁區內的磁矩方向都是同一個方向，此即是磁區的概念，圖2-2 所示。然而各磁區的方向不盡相同，因此會有相互抵消的現象，若淨磁矩等於零，則此時物質將不具磁性。當物質的尺寸從塊材縮小至奈米時，磁區的數目亦會減少，因此當尺寸減少到某個程度時，會出現單一磁區 (single domain)，即沒有磁區間相互抵消的現象 (莊, 1994)。圖2-3 兩相鄰磁區間磁化方向變化情形。. 6.

(21) 圖2-1 磁矩示意圖示(金, 2002)。. 圖2-2 磁性粒子磁區構造的示意圖，物質內隨能量分佈不同，磁區的排列也不相同(莊, 1994)。. 圖2-3 兩相鄰磁區間磁化方向變化情形(莊, 1994)。. 7.

(22) 2.2.1 磁性之分類磁性物質的分類如表2-1所示，以下再針對各磁性種類加以描述。 (1)順磁性(Paramagnetism) 順磁性物質的磁化與磁場成正比。一般順磁物體所含之磁原子，其來源是電子自轉與繞核運轉，淨磁矩不為零。在外加磁場下，原子之磁矩沿磁力線有秩序的排列，表現出微弱的正磁化率，其大小約為10-4~10-6 emu/cm3Oe 之間，這種效應稱為順磁性。由於磁矩的方向一致性，非常容易受熱擾動的影響，因此若溫度上升，順磁性則減弱。 (2)反磁性(Diamagnetism) 反磁性是一種弱磁性，磁化率約為10-6 emu/cm3Oe，所呈現的磁化方向與外加磁場方向相反。其來源是該物質內原子間的磁矩互相抵消，對外磁矩為零，因此在外加磁場下，原子內部沿著軌道運動的電子受到輕微的影響，在原子內部產生感應電流。 (3)鐵磁性(Ferromagnetism)：鐵磁性的物質內有高的磁量化，其磁化率大於101~106 emu/cm3 Oe，且磁化強度與磁場強度呈現非線性關係，會有磁滯的現象產生。一般而言，個別原子之內層軌域的電子對之自旋方向是相反的，但在Fe、Co、 Ni 鐵磁性物質中，內層有未成對的3d 電子，磁矩則按區域自發取向，此正是鐵磁性的來源。若鐵磁性物質所受溫度大於居里溫度 (Curie-Temperature, Tc)時，則磁性將轉變為順磁性，如圖2-4 即為溫度對鐵磁性和反磁性物質的性質轉換圖(溫, 2000)。 (4)超順磁性(Superparamagnetism)：. 8.

(23) 一般磁性物質為多磁區結構，當材料的尺寸愈接近奈米結構時，多磁區會轉變為單磁區而展現不同的特性。在磁性材料中的偶合力 (coupling forces)，會使相鄰原子間的磁力矩(magnetic moment)排列整齊而產生強大的內部磁場。磁性物質的磁化率與溫度有密切關係，當超順磁性的物質其溫度低於居禮溫度，熱能並不足夠改變相鄰原子間的磁力矩，但卻會影響整個微晶體的磁化強度(magnetization)，並使得淨磁力趨近於零。因此超順磁奈米粒子表現出來的磁性質是與順磁物質相似的，但差別在於每一個原子受外在磁場的影響都是獨立的，整個微晶體的磁力矩傾向與磁場一致(金, 2002)。. 9.

(24) 表2-1 磁性物質的分類(溫, 2000). 圖2-4 溫度對鐵磁性和反鐵磁性物質之性質轉換圖(溫, 2000)。. 10.

(25) 2.2.2 氧化鐵的種類氧化鐵是人類最早發現具有磁性的礦物，在自然界中蘊藏量很豐富，且可以許多不同型態存在；通常是Fe2+或Fe3+與其他元素形成化合物，一般常見的有FeO、α-Fe2O3、γ-Fe2O3 及Fe3O4 等。其中γ-Fe2O3 及 Fe3O4 具有強的鐵磁性，因此成為第一代的磁性紀錄器材及磁鐵材料。 α-Fe2O3是氧化鐵的最終穩定相，因其晶格具高度對稱性，使磁性鐵離子間的磁矩互相抵銷，不具有強的磁性，但具有半導體性質，所以應用也相當廣泛。表2-2為鐵氧化物的分類及特性(溫, 2000)。以下對具有較強磁化強度的Fe3O4 及γ-Fe2O3 針對其晶格結構加以討論其磁性性質的產生原因與貢獻(金, 2002)：（1）磁赤鐵礦γ-Fe2O3 一般被認為是由Fe3O4 相轉變為α-Fe2O3 時的中間產物，此含有過量氧的氧化鐵，主要為立方狀。在γ-Fe2O3 的晶格結構中Fe3+佔據八面體和四面體的中心位置，但未能填滿八面體的的位置，因此八面體中常有空位置呈現。所以化學式亦可以寫成 Fe8(Fe40/3Δ8.3)O32 以Δ表示八面體中陽離子之空缺情形。因此此空缺位置可置換成不同金屬的陽離子，以作為生產鐵氧磁體的原料之一。（2）磁鐵礦Fe3O4 的化學式亦可以表示為Fe2+Fe3+2O4，與γ-Fe2O3 同為尖晶石結構，在晶格結構內同時具有八面體和四面體的晶格，其中 Fe3+離子同時可佔有八面體及四面體的中心位置，Fe2+則僅佔有具八面體的位置。Fe3O4 的主要晶型則有八面體、菱形、立方、球狀等。具有磁性，為早期製作磁塊、磁鐵、磁針的原料。. 11.

(26) 表2-2 鐵氧化物的分類及特性(溫, 2000). 12.

(27) 2.2.3 磁性奈米粒子的磁滯曲線磁滯曲線(hysteresis curve)是磁性材料中相當重要的一種資訊，也是呈現磁性物質對於外加磁場的變化所反應出來的一種行為，為磁性材料的重要參考值，同時亦決定了物質在磁性應用的範圍。圖2-5即是一般鐵磁性物質的磁滯曲線。從圖中可以看出飽和磁化量(Ms)與外加磁場(H)的關係，當一個磁性物質受到逐漸增強的外加磁場作用時，其磁化現象隨之增強，即從O到A 這個過程。當外加磁場增強到某個強度之後，磁化量即不再增加，此時達到該物質的「最大飽和磁化量(Ms)」，而不同狀態的磁性物質其最大的飽和磁化量都不盡相同。接著外加磁場慢慢一直減少到零(A到B的過程)，此時外加磁場為零，但磁化量並不為零，而是維持在某一定的值，即圖中的B點，此時在零外加磁場時所得到的磁化量則稱為「殘磁量」(B 點的值)。若施以相反方向的外加磁場，則發生B到C的過程，磁性物質內部磁矩因受到相反方向的磁場影響，造成了部份磁矩的方向改變且剛好互相抵消，因此完全沒有磁性，此時的外加磁場大小稱為「矯頑力 (coercivity, Hc)」(C點的值)。當反向磁場繼續增強(即C到D的過程)，則達到另一次的飽和磁化量，此時與A點值相同但方向完全相反。之後，由D 經由E、F到A的過程則是與由A經由B、C到D的過程一樣，最後會形成一個封閉的的循環(ABCDEFA)，也就是所謂的磁滯曲線。. 13.

(28) 圖 2-5 鐵磁性物質的磁滯曲線示意圖。. 14.

(29) 鐵磁性物質因為有殘磁量的緣故，因此在無外加磁場下即擁有磁性，從磁滯曲線圖即可看出此現象；然而順磁性物質在無外加磁場的情況下是沒有磁性的，但當有足夠的外加磁場存在時，順磁性物質便開始擁有磁性，因此順磁性物質的磁滯曲線如圖 2-6 所示。順磁性物質在無外加磁場時，磁化率為零，對於磁滯曲線的變化過程與鐵磁性物質相似，O＇→A＇ →B＇ → A＇ →O＇ → C＇→D＇ →C＇ →O＇為一個完整的循環。可以發現順磁性物質，其矯頑力是零而且沒有殘磁現象，這是與鐵磁性物質最大不同的特性。溫度對於磁滯曲線的影響可以從磁性物質所表現出來的行為來了解。當溫度升高，鐵磁性物質和順磁性物質基本上仍維持本身的狀態，只是磁化率會有所變化，但鐵磁性物質可能因此喪失磁性或者是轉變成順磁性；反之，若溫度下降，對鐵磁性物質而言並不會有很大的影響。不過在順磁性物質方面，則會有很大的影響，即從順磁性轉變成為鐵磁性，圖 2-7 即是溫度對順磁性物質的關係圖(金, 2002)。. 15.

(30) 圖 2-6 順磁性物質的磁滯曲線示意圖。. 圖 2-7 溫度對順磁性物質的影響。. 16.

(31) 磁滯曲線除了與溫度有關之外，還有幾個因素也會影響磁化率的變化，包括保護劑種類、奈米粒子的大小和晶體結構組成等因素(劉, 2005)。保護劑會吸附或鍵結在金屬奈米粒子表面，不同的保護劑對於晶格面的能量影響都有所差異。由於物質表面的磁矩表現會受到保護劑影響，因此導致磁滯曲線的飽和磁化率的降低。而奈米粒子本身的大小關係到磁區的數目與排列，不同粒徑的奈米粒子其表面磁區的能量亦不相同，故對於週遭環境的感受度也就不同，因此也會影響到磁矩的穩定度，磁滯曲線也因而產生差異性。因此相同大小、相同組成的磁性奈米粒子可能因為晶格結構不同，所以磁滯曲線亦會不同，這是因為不同結構裡，原子的排列位置是不一樣的，加上保護劑的因素，磁滯曲線的改變也是與此項因素有關。如圖 2-8 是保護劑對飽和磁化率的影響，一般表面有保護劑修飾的磁性物質，其磁化率都會因此而下降(金, 2002)。. 圖 2-8 保護劑對飽和磁化率的影響。. 17.

(32) 2.3 磁性奈米材料的製備方法製備磁性奈米粒子的方法有許多種，常見的製備方法有熱分解法 (Thermal decomposition) ( Simeonidis et al., 2007)、水熱法(Hydrothermal method) (Ge et al., 2007)、微乳化法 (Microemulsion) (Jia et al., 2006)、溶液－凝膠法(Sol-gel) (Xu et al., 2007)、固相研磨法(Ye et al., 2006)，以及化學共沉澱法(Co-precipitation) (Nishio et al., 2007)。熱分解法及水熱法所製備的氧化鐵奈米粒子則使用有機相的分散劑，一般以油酸(oleic acid)作為保護劑，在高溫下將鐵化合物裂解然後生成氧化鐵奈米粒子，其粒徑也很均勻，但礙於有機相的緣故，不適合生醫領域的應用。除非加入PEO與PPO的共聚物使其相轉移(Gonzales and Krishnan, 2007)，或是加入一些界面活性劑如meso- Dimercaptosuccinic acid (DMSA)，改變奈米粒子表面的ligand，轉換為水相的奈米粒子 (Haddad et al., 2007)。固相研磨法是在手套箱中充滿氮氣後，利用瑪瑙研缽將氯化鐵、氯化亞鐵、界面活性劑、NaOH的粉末皆研磨均勻後，再將其用去離子水分散，此方法亦能得到磁性奈米粒子，但此方法的變數太多，例如各粉末所秤得的重量比不同，會有不同的結果；也由於不是機器研磨，因此每次操作所得到的粒子也會有不一樣的結果。藉由以上的經驗，我們在實驗上便選擇了化學共沉澱法來合成磁性奈米粒子，此法為最普遍採用的方式，且方法操作簡單、可大量製備、成本便宜和製備時間短等四個優點。. 18.

(33) 而共沉澱法方式製備的水相氧化鐵奈米粒子因為應用性較為廣泛，也較符合生醫上的應用。其反應機制可以用下列式簡單表示：. 以製備氧化鐵奈米粒子為例子，反應中使用的鹼主要以氨水或氫氧化鈉為主，兩者的作用有些許不同，但最後的結果是ㄧ致的，其反應式為：. 共沉澱法主要都是以水溶液作為反應系統，反應的同時必須隔絕氧氣，此舉是為了避免形成Fe2O3，因此會在氮氣或是氬氣環境下進行；另外加熱步驟也是必須的，溫度範圍在85 ℃到95 ℃之間，目的在於有利 Fe3O4的生成。若條件控制不佳，則產物就會得到Fe3O4和Fe2O3的混合物，因為部分的Fe3O4被氧化成Fe2O3 (Donadel et al., 2008) 。 4Fe3O4＋O2Æ6γ-Fe2O3:. 19.

(34) 2.4 磁性奈米粒子的分散性與穩定度化學共沉澱法雖然是所有製備方法中最方便的，反應時間也最短，但形狀的控制也是較不理想的。主要作用原理乃利用金屬離子在鹼性環境下同時劇烈的攪拌，生成金屬氧化物。用此方法製備出的磁性奈米粒子通常粒徑大小不一，甚至很不穩定，也容易產生沉澱。在一些生物醫學應用領域，是不允許沉澱的現象發生，所以許多改良的製備方法陸續被發表出來，像是加入各種界面活性劑，如帶有相當強正電荷的四級銨鹽(NR4+) (Cheng et al., 2005)、具有親疏水兩性的Phosphatidylcholine (PC) (Giri et al., 2005)，或是有兩個功能性官能基的胺基酸(Polyaspartate) (Aurich et al., 2007)，可針對不同的應用來改善奈米粒子的分散性。為了有效改善共沉澱法的奈米粒子沉澱現象，大部分的方式都是在製備好的奈米粒子中加入保護劑，以避免聚集或沉澱的發生(Li et al, 2008)，但這個保護過程已在粒子成長完全之後才執行，此時粒徑都已達到某ㄧ種程度的大小，雖然有保護劑的保護作用，但實際上還是有可能發生沉澱的現象。因為粒子較大受到的重力所造成的影響也較大，離心分離時易產生粒子聚集。因此本實驗傾向於在合成奈米粒子的過程中即加入界面活性劑分散，希望能達到改善的效果(高等, 2005)。磁性奈米粒子的穩定性決定於凡得瓦力、排斥力等因素之外，還必須考慮磁吸引力。在一個外加磁場存在的系統中，磁性奈米粒子是否會受外加磁場影響而產生吸引作用是與本身的粒徑有關。當系統中的熱能所產生的布朗運動(Brownian motion)可以抗衡磁場所產生的吸引作用時，使磁性奈米粒子即可穩定的懸浮在溶液中。穩定性除了取決於磁性. 20.

(35) 奈米粒子本身的因素及系統因素之外，還有外在因素如 pH 值也都會影響。pH 值的因素對於含有特定官能基之保護劑較為明顯，最常見到的官能基就是氨基(－NH2)和羧基(－COOH)，透過 pH 的改變不僅可以控制氫鍵的形成，同時也影響到離子電雙層的穩定度(Filippov et al, 2008)。此外，若能在表面結合上配體(ligand)，如標靶性分子、促進滲透因子，或是將配體合併在結構內部，例如螢光染劑、治療試劑，除了能改善磁性奈米粒子分散之外，也能將單純奈米粒子提升為多功能生物試劑 (Sun et al., 2008)。. 圖 2-9 多功能生物試劑示意圖(Sun et al., 2008)。. 21.

(36) 2.5 磁性奈米粒子在生物醫學應用之評估 2.5.1 磁性奈米粒子在生物醫學上的條件限制磁性奈米粒子要應用在生物體內則必須符合三大基本條件，分別是無生物毒性、水溶性以及生物相容性。無生物毒性是首要考量的因素，當奈米材料本身會對生物體產生毒性或是引起負面效應時，則不予考慮可成為應用在生物醫學的選擇。水溶性是第二考量的因素，因為水在生物體內占了重要的比例，所以若要應用在生物醫學上也必須是屬於水溶性的物質，否則非水溶性的奈米粒子會造成排斥或是阻塞。最後考量的是生物相容性，如果奈米粒子無毒性且又是水溶性，但缺少生物相容性，則此材料仍不被採用。沒有生物相容性的物質，進入到生物體內會被視為外來物，而引發過敏反應或是引起免疫反應，對生物體來說並不是一個適合的生醫材料(王, 2002)。生物醫學領域又可分為「體外」和「體內」兩個方面，本實驗將針對體外應用來做為探討。由於此未直接進入生物體內，因此對於磁性奈米粒子粒徑上的要求就不用那麼嚴格，在缺乏外加磁場的情況下，放置長時間後會產生聚集沉澱現象的較大粒徑之奈米粒子(100~1000 nm)仍可被接受的，況且本實驗的最終目的是將磁性粒子誘導成膜於基材上。為了快速的收集樣品，故希望磁性奈米粒子具有良好之磁性，能快速以磁鐵誘導吸引，而分散性過強之磁性奈米粒子便較不適用。因分散性良好的磁性奈米粒子的磁性相對較弱，故需耗費更長時間來吸引粒子。. 22.

(37) 2.5.2 磁性奈米粒子在醫療領域之應用在治療方面的應用包括：（一）藥物引導治療(Drug Delivery Targeting and Diagnosis) 藥物引導治療的方式是將 Fe3O4 磁性奈米粒子連接上抗癌藥物，並以磁場控制奈米粒子集中到腫瘤區域進行治療。也可以利用此概念，將藥物分子換成生物分子 DNA 或是蛋白質，連結到磁性奈米粒子，並以磁場引導至目標處，再利用溫度轉換，將生物分子釋放，如此一來便可進行治療或是提供偵測標定的功能(Chen et al., 2007)，如圖 2-10 所示。（二）溫熱療法(Hyperthermia) 利用 Fe3O4 磁性奈米粒子進行溫熱療法，優點在於尺寸只有數個奈米、無毒性、生物相容性、及穩定性，再配合固定化技術與藥物導引技術，使得磁性奈米粒子只會分佈在產生腫瘤的區域。這也是目前其他治療希望達到的目標之一(Kim et al., 2006)。 Schmidt H.教授曾使用 Dextran 分子作為糖衣包裝奈米氧化鐵粒子，注入人體後，氧化鐵顆粒逃過了免疫系統的掃描，精確的進入腫瘤組織內，健康的細胞不會受到傷害，就可以開始啟動磁場，藉由磁場的高速變化，氧化鐵粒子會受磁場感應將磁能轉變為熱能釋放，等同於加熱氧化鐵粒子，進行癌症治療殺死癌細胞(陳, 2004)。. 23.

(38) 在診斷方面的應用包括：（三）磁共振造影(Magnetic Resonance Imaging) 磁共振造影對醫學領域而言是一個重大的突破，其最大的貢獻在於能在不同的組織和不同的環境下，呈現出有差異的顯影效果，因此被用來診斷組織的病變與否。以目前被允許的磁性奈米粒子而言，均是氧化鐵為主，如 Resovist®即是少數之一被允許上市販售的 MRI 顯影劑，圖 2-11 所示。另外，也可以將 Fe3O4 磁性奈米粒子外層修飾針對細胞具有特殊親和力的分子，利用此技術對於早期監控和預防是很有幫助的。例如用乳醣酸修飾的磁性奈米粒子溶液注射入兔子後，做核磁共振得到的影像也顯示修飾過的奈米粒子能夠選擇性的累積在肝細胞上，這結果證實了利用乳醣酸修飾磁性奈米粒子能夠作為造影劑，在肝臟的疾病診斷上有很大的潛力(Selim et al., 2007)。圖 2-12 所示。以上這些應用皆可證明利用磁性誘導是可行的。. 24.

(39) 圖 2-10 藥物引導釋放示意圖(Chen et al., 2007)。. 圖 2-11 市售的 Resovist® MRI 顯影劑。. 圖 2-12 注射乳醣酸修飾磁性奈米粒子溶液前後兔子肝臟的 MRI 影像 (Selim et al., 2007)。 25.

(40) 2.6 磁性凝膠一般的混合凝膠都是在體外成型之後，再以開刀的方式植入體內，如此一來限制了其應用方向，如圖 2-13 所示(Cho et al., 2007)。本研究嘗試將凝膠中加入磁性奈米粒子，稱之為磁性凝膠，使其賦予磁性與水溶性的功能，凝膠混合後不會立即固定成型，由於它是一種流動性的材料，因此可以受磁場誘導的方式，到達某特定位置後再交聯。由於它具有可流動之特性，故有能填充任意形狀的缺損之優點，且大幅降低對植入生物體組織的侵入性破壞，減少二次手術的創傷。目前文獻中也有類似的發展，例如利用 Polyvinyl alcohol(PVA)和 Glutharaldehyde(GTA)合成磁性凝膠，可以製成生物相容性的薄膜 (Albornoz et al., 2006)。還有文獻發展刺激感應型之材料，當接受到外界之刺激時，如酸鹼值、溫度、外部磁場等，會改變其結構或物理化學性質而加以回應，像是薄膜或孔洞的結構(Bhattacharya et al., 2006)，如圖 2-14 所示。而本實驗即針對以外部磁場誘導方式的磁性凝膠，使其交聯成薄膜狀或是誘導其沿磁力線排列成線條狀。. 26.

(41) 圖 2-13 一般凝膠交聯示意圖(Cho et al., 2007). 圖 2-14 誘導凝膠成薄膜或孔洞結構(Bhattacharya et al., 2006). 27.

(42) 2.7 天然高分子與細胞的關係我們利用逐層組裝方式將磁性凝膠包覆天然的生物可分解性高分子，使用天然高分子主要的優點是低免疫源性及材料來源充足，且使這暫時性的凝膠支架在作用完後能被生物所分解，是作為組織工程修復之用很好的材料。天然多醣體高分子材料，如中性多醣體有纖維素(Cellulose)、、澱粉(Starch)；鹼性多醣體有幾丁質(Chitin)、幾丁聚醣(Chitosan)，而酸性多醣體則有褐藻酸(Alginate)、葡聚醣(Dextran)、透明質酸(Hyalur- onic acid)。另外還有聚葡萄醣胺基多醣體(Glycosaminoglycans)，如硫酸軟骨素(Chondroitinsulfate)及硫酸乙醯肝素(Heparin sulfate)。以上除了纖維素因結構排列之外，其餘的多醣體於人體內都可被酵素所分解，所以此類型材料長期植入人體將不會因無法分解而造成身體的負擔。而透明質酸及膠原蛋白等，屬於生物可降解性高分子，雖然有其生物相容性等優點，但除了來源有限並且取得不易，及材料成本昂貴造成產品價格偏高，均是未來應用上隨之而來的問題。因此，本研究嘗試使用成本較低廉，同時又兼具生物相容性的天然多醣類生物性材料，如來自甲殼類的幾丁聚醣以及藻類提煉的褐藻膠，來做為生醫材料上的應用，並探討與細胞貼附的關係。. 28.

(43) 2.7.1 幾丁聚醣(Chitosan) 幾丁聚醣為天然性高分子材料，因其具有良好的生物相容性及無毒性，又因具有價格便宜、生產原料不缺乏等優點，使得幾丁聚醣是近年來十分受到重視的新興材料，其在醫藥、食品、工業、化工、農業及生物技術上之應用極具潛力。其應用如表2-3所示(袁等, 2001)。首先介紹幾丁質是由N-乙醯葡萄糖胺(N-Acetyl-D-glucosamine)單體以β-1,4 鍵結所組成，主要存在於自然界中無脊椎動物的外殼及真菌類的細胞壁中。而幾丁聚醣是將幾丁質脫去乙醯基而形成的葡萄醣胺，其結構如圖2-15所示。幾丁聚醣是白色帶淡黃色結晶狀的粉末，其去乙醯度一般多在 85 ％。幾丁聚醣由於具有一級胺基(amino group, -NH2)，在溶液中為一親水＋. ＋. 性分子鍵結構。若在酸性的狀況下，因其可吸附 H 對形成帶 NH3 的陽＋. 離子聚合物(NH2＋H Æ NH3 )，使得相鄰分子產生靜電相斥力使分子鍵展開來，故在酸性溶液中溶解。幾丁聚醣可溶於酸性或弱酸性溶液中，其中醋酸則常被選作為幾丁聚醣溶液測定的標準溶液劑。但是因為幾丁聚醣只能溶於酸中並不能溶於水中，使其在應用上受到很大的限制，故若能改質幾丁聚醣，使其能溶於水中，那將使得幾丁聚醣有更廣泛的應用空間。. 29.

(44) 表 2-3 幾丁質/幾丁聚醣的特性及其再生醫材料的應用(袁等, 2001). 圖 2-15 (a)幾丁聚醣，(b)幾丁質化學結構式. 30.

(45) 已有研究證明許旺細胞能夠貼附在 Chitosan 所形成的電紡絲纖維或是薄膜上(Yuan et al., 2004 ; Sangsanoh et al.,2007 ; Chew et al., 2008)，且根據結果指出，神經細胞比較傾向貼附及生長在纖維狀的結構上，如圖 2-16。或者是利用壓印方式壓印出微溝槽的結構(陳, 2003)，並將其表面改質成細胞喜好貼附的表面，使許旺細胞沿著溝槽生長，如圖 2-17 所示。. 圖 2-16 利用電紡絲製備磁性奈米纖維培養許旺細胞(Sangsanoh et al.,2007). 圖 2-17 利用微溝槽表面改質觀察許旺細胞生長情形(陳, 2003). 31.

(46) 目前利用 Chitosan (CS)與磁性奈米粒子結合，製備出其它結構的磁性材料方法包括利用在原處交聯 CS 與磁性奈米粒子(Li et al, 2006)，需要一個模具才能使其在原處成形。此外，Hu et al.製備三圍結構的 Chitosan 磁性奈米棒，此方法需要選擇一個適當的模具，最後應用於骨細胞的修復上。上述的兩種方法都需要模具，若沒有適當的模具，也就無法製備出磁性奈米結構，因此我們想利用市售的超過濾膜當作一個模具，如圖 2-18 所示，原理是將上管的膠體混合液，以離心力將溶液擠壓至下管中，當此膠體通過超過濾膜的孔徑時，會產生類似纖維狀的結構，在收集純化下管的產物即可。目前尚未有文獻利用超過濾膜來製備一維結構的材料。. 圖 2-18 市售之超過濾膜. 32.

(47) 2.6.2 褐藻酸(Alginate) 褐藻酸亦為天然高分子，由β-1,4-linked -D-mannuronic acid及α -1,4-linked -L-guluronic acid以不規則及非重複的序列共聚合而得的多醣類共聚物，分子量約為240,000，其結構如圖2-19所示，為一具有多數陰電荷之高分子。褐藻酸鹽的來源主要是由褐藻類提煉而成，無毒性且生物相容性佳。其鈉鹽可溶於水，而鈣鹽不溶於水。褐藻酸鈉之黏稠水溶液，在含鈣的水溶液中，會與鈣離子形成鍵結，使褐藻酸聚合物連接成網狀而凝固或膠狀，如圖2-20。而在組織工程上的應用，常利用交聯的方式將褐藻酸鹽做成多孔性支架，進行細胞培養。過去有學者將褐藻酸鹽與二價陽離子鍵結後，形成高含水量之膠體做為軟骨細胞培養之基材，但結果顯示軟骨細胞在褐藻酸鹽基材的生長情形並不好，且機械性質差，但具有較佳的生理特徵，因此仍有許多學者在進行相關研究(潘, 2004)。. 33.

(48) 圖 2-19 褐藻酸之結構. 圖 2-20 褐藻酸和 Ca2+之鍵結. 34.

(49) 周邊神經修復的再生過程當中，常會面臨再生軸突的排列與方向無法控制，因而產生彼此間相互糾纏或生長方向無定的問題，進而影響神經功能恢復的程度(Gupta et al, 2009)。然而，許多研究報告指出，周邊神經系統中的神經膠細胞，如許旺細胞(Schwann cell)，圖 2-21 中所示，不僅可保護神經細胞，並分泌促進軸突貼附生長的細胞間基質(Extracellular matrix, ECM)及神經生長因子(Nerve growth factor, NGF)，進一步具有導引神經生長方向的功能(陳, 2003)。我們也將根據此特點，將其與許旺細胞共同培養，未來希望能做為磁性誘導之神經修復導管。目前有研究中表示 Alginate 膠體亦可應用於神經導管修復導引神經再生(Hashimoto et al., 2005)，不僅可簡化手術程序及時間，也較無神經手術縫合時對神經造成拉扯傷害，並能減少神經生長因子的流失。. 35.

(50) 圖2-21 許旺細胞之示意圖. 圖2-22 以褐藻酸膠體作為神經導管修復之示意圖(Hashimoto et al., 2005). 36.

(51) 2.6.3 葡聚醣(Dextran) Dextran 主要是由α-1,6 linked D-glucopyranose 所組成之聚醣類高分子，但也具有少部分α-1,2、α-1,3、或α-1,4 linked 的支鏈，如圖 2-23 所示。原為細菌所製造的 Dextran 分子量可達數百萬，但經由水解或酵素的分解即可得到各種不同分子量的 Dextran 高分子。此外 Dextran 很容易受到酵素 Dextranase 的分解，分解後主要產物為 Glucose 及 Isomaltose。另外，Dextran 在生物系統中不會造成細胞毒性，目前於手術中作為抗血栓藥物使用，因為 Dextran 能夠與紅血球、血小板和血管上皮細胞結合，減少血栓之發生。除此之外，大分子量之 Dextran 不會通透血管壁，可調節血液滲透壓，在臨床上已當作血漿增容劑來使用。因 Dextran 具有良好的生物相容性、能被酵素分解，還有優良的水溶性，故近年來許多人利用 Dextran 製成水膠，期望能夠做為藥物傳遞上的應用。. 將 Dextran 與 Chitosan 經由逐層組裝後包覆生長因子當做一藥物釋放載體，利用改變 pH 值，能夠促使生長因子的是放，使得纖維母細胞分化，如圖 2-24 所示(Itoh et al., 2008)。. 37.

(52) 圖 2-23 Dextran Sulfate 的結構式. 圖 2-24 Dextran 與 Chitosan 經由逐層組裝後包覆生長因子做為藥物釋放載體示意圖(Itoh et al., 2008). 38.

(53) 第三章材料與方法 3.1 實驗藥品 1. Iron(III) chloride hexahydrate，FeCl3‧6H2O，M＝270.33 g/mole，購自 Sigma 2. Iron(II) chloride tetrahydrate，FeCl2‧4H2O，M＝198.83 g/mole，購自 MERCK 3. Trisodium citrate dehydrate，C6H5Na3O7，M＝294.10 g/mole，購自 SHOWA，試藥級 4. Sodium sulfite，Na2SO3，M＝126.04 g/mol，購自 Riedel-dehaen 5. Zinc acetate，Zn(Ac)3，M＝219.51 g/mol，購自 J.T.Baker 6. Ammonia solution，NH4OH，購自 J.T.Baker 7. Alginic acid sodium salt, From brown algae，購自 Sigma 8. Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp，購自 Sigma 9. Chitosan, low molecular weight，購自 Aldrich 10. Acetic acid, Glacial，購自 J.T.Baker 11. 水溶性甲殼素，購自世展科技股份有限公司，食品級 12. Genipin，購自嘉年科技 13. DMEM 高醣培養基，購自岑祥 14. USDA approved FBS，購自岑祥 15. 抗生素，購自岑祥 16. Trypsin-EDTA solution 胰蛋白酶，購自 Sigma 17. Trypan blue solution cell culture tested 染劑，購自 Sigma. 39.

(54) 18. DMSO 二甲基亞石風，購自 Sigma 19. MTT 二甲基硫醇二苯基四唑溴，購自 Sigma 20. PBS 磷酸緩衝劑，購自 Sigma. 3.2 實驗使用之儀器 1. 多用途試管震盪器(Vortex-genie 2) 2. 超音波細胞破碎機(Branson Digital sonifier) 3. 磁石攪拌機(CORNING, MODEL PC-420) 4. 組織均質機(HOMOGENIZER, HG-300/D) 5. 離心機(HERMLE, Z323K) 6. pH meter(SP-2200) 7. 超過濾膜(Omega nanosep 300K) 8. 粒徑分析儀(ZETASIZER 3000HSA). 40.

(55) 3.3 測量儀器 1. 穿透式電子顯微鏡【Transmission electron microscopy, TEM】利用穿透電子來呈像，以觀察物體內部之微細構造。因材料可讓電子束穿透的難易度不同，造成電子束的穿透量有差別，因此在成像時產生亮區與暗區的對比，藉此可判斷材料顆粒的大小及形態。因此將所製備的樣品水溶液滴落在鍍炭銅網上，將其放入烘箱或乾燥箱乾燥後即可上機觀察。 2. X 光粉末繞射【X-ray diffraction, XRD】 X 光繞射原理：在某些散射角下，從相鄰晶面散射之波彼此相位相同，光程差為波長的整數倍，因而產生建設性干涉。滿足此條件便可產生繞射，稱為布拉格定律(Bragg’s law) 2dhklsinθ=nλ 不同的晶體結構晶面間距(d)會有所差異，其中 hkl 是各晶面之指標，因此會有不同組合之繞射角(2θhkl)。晶體是由原子或原子團在空間中以規則排列而成的固體，X-ray 進入晶體時，會被原子散射，當存在某種相位關係(相位差)兩個或兩個以上散射波相互疊加後，就會產生繞射現象。X 光繞射儀就是利用偵測器收集繞射訊號強度，得到待測樣品的繞射圖譜(Diffraction Pattern)。取樣品水溶液滴在玻璃片中央，使其乾燥後再滴上一層樣品，步驟重複數次，直到玻璃片變成不透明為止，之後設定參數 Cu 靶入射光，描掃角度範圍為 20~70°，掃描速率固定為 10°/min。. 41.

(56) 3. X 光電子能譜儀【X-ray photoelectron spectrometer, XPS】又稱為化學分析電子能譜術(electron spectroscopy for chemical analysis, ESCA)是分析材料表面的電子結構與化學成分之重要方法之一。XPS 的原理如圖 3-1，是利用光電效應，當材料表面被 X-Ray 照射時，原子內的電子吸收 X-Ray 能量後而游離出來，此電子稱光電子，其動能為入射電磁波的能量減去電子在原子中的束縛能，不同元素的光電子具有其特定的動能，因而可用來判定材料表面的元素成分。將樣品溶液分別滴在 Polypropylene (PP)濾膜上風乾，形成奈米複合膜後將其送測 XPS。. 圖 3-1 XPS 原理示意圖 4. 超導量子干涉器【Superconducting quantum interference measurement device, SQUID】超導量子干涉磁量儀是一精密的磁性量測系統。超導線圈於超導態時對外在磁場的改變會有相對應的電流變化，此種變化較一般磁性物質都來的靈敏，因此可利用來感測外部磁場的變化。SQUID 其設計為將樣品置於超導線圈內，施加一磁場，而後讓樣品往復進出線圈。樣品若對磁場有所感應，則會對週遭的磁場產生影響，而這種影響可由 42.

(57) 超導線圈的電流變化得知，進而得知樣品的磁特性。將待測的樣品冷凍乾燥後得到的粉體，接著秤重後送測成大貴儀中心進行檢測，掃描範圍為±20000 高斯。 5.. 粒徑分析儀之動態光散射分析儀【Dynamic light scattering, DLS】與表面電位分析儀【Zeta potential meter】 DLS 是利用雷射光經過懸浮粒子進行布朗運動時所產生散射條紋對時間的變化轉換成粒徑分佈。而表面電位分析儀的原理是利用微電泳法結合雷射散射的都卜勒效應來進行。如圖 3-3 所示，將電極置入稀薄的樣品懸浮液中，施加一定的電壓後，顆粒會在電場間不斷移動。此時可利用雷射光束來檢測顆粒的移動情形：其強度與頻率的波動及顆粒移動速度有關。利用函數分析求出顆粒的移動速度，進一步可求出粒子的表面電位( Zeta potential )。將樣品溶液稀釋數倍後，進行粒靜分析及表面電位分析。. 圖 3-2 表面電位(Zeta potential)偵測原理(王, 2002). 43.

(58) 6. 掃描式電子顯微鏡【scanning electron microscope, SEM】掃描式電子顯微鏡是用聚焦電子束在試樣表面逐點掃描成像。二次電子是最主要的成像信號。由電子槍發射的能量為 5～35 keV 的電子，於試樣表面按一定時間、空間順序作柵網式掃描。聚焦電子束與試樣相互作用，產生二次電子發射以及其他物理信號，二次電子發射量隨試樣表面形貌而變化。二次電子信號被探測器收集轉換成電訊號，經視頻放大後輸入到顯像管柵極，調製與入射電子束同步掃描的顯像管亮度，得到反映試樣表面形貌的二次電子像。. 44.

(59) 3.4 磁性膠體之製備 3.4.1 化學共沈澱法製備磁性奈米粒子取氯化鐵(FeCl3‧6H2O)溶液和氯化亞鐵(FeCl2‧4H2O)溶液，以莫耳比 2:1 的比例混合，加入適量的界面活性劑溶液並攪拌均勻，之後加入沉澱劑(NH4OH)劇烈攪拌 5 分鐘，得到黑色的沉澱物，即為磁性奈米氧化鐵粒子(Fe3O4)。反應式如下：Fe2+＋2Fe3+＋8OH- Æ Fe3O4＋4H2O。然後將其溶液放入水浴槽加熱至 80 ℃，此時仍需維持劇烈攪拌，加熱的目的是為了使粒子成長熟化，讓粒子更穩定。之後以磁鐵誘導輔助及離心過濾的方式將多餘的沉澱劑去除。其中以磁鐵輔助過濾的過程也能確保過濾後的粒子具有磁性。最後得到表面包覆界面活性劑的磁性氧化鐵奈米粒子溶液(Chen et al, 2007)。製備流程示意圖如圖 3-3 所示。上述方法中的氯化亞鐵也可以亞硫酸鈉取代，氯化鐵與亞硫酸鈉的莫耳比則為 3:1。使用亞硫酸鈉的目的是為了還原氯化鐵中部分的三價鐵離子，使其生成二價鐵離子，以便後續生成磁性氧化鐵奈米粒子 (Li, 2006)。使用此方法可以在室溫下空氣中反應。在界面活性劑(Surfactant)的選擇上，實驗中所使用的有：檸檬酸鈉 (Citrate acid trisodium salt) (Chen et al, 2007)、 DMSA(meso-Dimercaptosuccinic Acid) (Pisanic II et al, 2007)、褐藻酸鈉鹽 (Alginic acid sodium salt)，結構式分別如圖 3-4 所示。當界面活性劑包覆在粒子的表面時，因為各種不同官能基的解離而使粒子帶有表面負電荷，並因為電荷排斥的原理造成粒子會均勻的分散在溶液中。. 45.

(60) 圖 3-3 化學共沉澱法合成磁性奈米粒子流程之示意圖. 圖 3-4 各種 Surfactant 的結構式. 46.

(61) 3.4.2 Core(Fe3O4)/shell(Biopolymer) 磁性膠體之製備 3.4.2.1 陽離子膠體之製備利用相異電荷相吸原理，包覆生物可分解性高分子。先將 Chitosan(CS) 溶於 1wt%的醋酸溶液，取過量的 CS 膠體溶液，在均質機攪拌下加入奈米粒子外層有檸檬酸保護的 Fe3O4 溶液，使其因靜電力吸引作用而包覆在粒子外層後，再以離心步驟將多餘的 CS 去除，重新分散於水溶液中，即＋. 製作出 CS 包覆的奈米粒子(MNP )，稱為表面吸附聚陽離子膠體。全部反應如圖 3-5 所示。此外，在包覆 Chitosan 的過程中，由於幾丁聚醣必須溶於弱酸水溶液，在弱酸環境下會影響磁性奈米粒子的穩定性，因此也嘗試使用改質過的水溶性幾丁聚醣（取自世展科技公司，分子量約為 35000 g/mole），利用它可溶於一般去離子水的特性，還有在中性環境下仍帶正電荷的優點，使得實驗可操作的範圍變大。. 圖 3-5 Core/shell 磁性陽離子膠體製備之示意圖. 47.

(62) 3.4.2.2 陰離子膠體之製備將已經包覆過 Chitosan 的氧化鐵粒子溶液，加入過量的 Dextran sulfate sodium salt (DS)膠體溶液，以均質機攪拌均勻。依正負電荷相吸的－. 原理，聚陰離子的膠體(MNP )會包覆於聚陽離子膠體的表面，最後以離心的方式移除多餘的 DS，即可得到表面吸附聚陰離子的逐層組裝粒子之膠體溶液。反應如圖 3-6。另一種方法是以 Alginic acid sodium salt (AA)膠體溶液當作界面活性劑，在合成磁性氧化鐵奈米粒子時，同步包覆於粒子的外層。此法與磁性氧化鐵奈米粒子的合成是相似的，也需經過加熱熟化的步驟，並且也要經過磁鐵吸附分離或離心的方式將多餘的沉澱劑移除，最後分散於去離子水中，使磁性奈米粒子的表面為帶負電的 Alginic acid。反應如圖 3-7 所示。. 48.

(63) 圖 3-6 Core/shell 磁性陰離子膠體製備之示意圖. 圖 3-7 磁性陰離子膠體製備之示意圖. 49.

(64) 3.4.3 磁性纖維之製備商業用的超過濾膜的孔徑大小有分為 30K、100K、300K，膜的孔靜皆為 100 nm，而 K 代表的是分子截流量，例如 300K 的超過濾膜，便可以讓分子量 30 萬以下的分子通過，而分子量超過 30 萬則會留在超過濾膜的上層。實驗的方法如下，先將 Fe3+、Fe2+離子溶液混合形成 Fe3+ / Fe2+錯合物，取各種濃度的 Chitosan(CS)與鐵離子溶液混合，接著放置於超過濾膜離心管的上層，下層則加入 NaOH 鹼性溶液，以 10000 g 的離心力過濾。當 CS 與鐵離子之溶液通過超過濾膜時，受到離心力的擠壓而成線狀。當接觸到離心管下層的鹼液時，便發生 Fe2+＋2Fe3+＋8OH-ÆFe3O4＋4H2O 的化學反應，立即形成 CS / Fe3O4 的磁性奈米線，最後將產物純化。藉由不同孔徑的超過濾膜離心管，以及不同轉速的離心力，或是不同濃度的 CS 來調控磁性奈米線的形成，圖 3-8 為超過濾膜離心管製備磁性奈米線之示意圖。. 圖 3-8 超過濾膜離心管製備磁性奈米線之示意圖. 50.

(65) 另一種方法是以相同的原理，先製備出 CS 奈米纖維。由於 CS 不溶於鹼液，故在接觸到下層鹼液時會析出，再離心將產物分離取出。之後將產物泡入交聯劑綠梔子素(Genipin)中(Mia et al., 2003)，結構示如圖 3-9 所示，使 CS 交聯固化，再浸入鐵離子溶液使鐵離子滲透到 CS 纖維內部，最後泡入鹼液中，使 Fe3O4 在 CS 纖維中形成，如此一來亦可得到磁性奈米纖維，如圖 3-10 所示。滲透的方式是參考文獻而來(Wang et al, 2008)，圖 3-11 所示。 Genipin 本身在水中不會開環，但若水中存在自由胺基或是氫氧根離子等含有自由電子對的官能基時，將會對 genipin 做親核攻擊，使 genipin 開環形成醛基。開環後的醛基，會再與 geniping 上的二級胺反應形成雜環鍵結，進而達到交聯生物組織的結果。. 圖 3-9 綠梔子素(Genipin)結構式. 51.

(66) 圖 3-10 超過濾膜離心管結合滲透方式製備磁性奈米線之示意圖. 圖 3-11 利用滲透的方式合成磁性奈米纖維(Wang et al, 2008). 52.

(67) 3.4.4 磁性凝膠交聯成膜進行細胞培養之前，須先以外加磁場來誘導磁性材料進行交聯成膜，製作出可供細胞貼附生長之表面。交聯成膜的原理乃利用不同分子所帶有的相反表面電荷，經由正負電荷互相吸引，以及磁鐵誘導集中，使材料之間產生具有一定強度之交聯鍵結而成膜。實驗的方法是先將洗淨的矽晶片裁切成適當大小後，置入培養皿中，加入帶相異電荷的兩種磁性奈米粒子膠體溶液，依不同體積比例混合，並找出適當的混合比例，讓兩種膠體混合後不立即成膠或沉澱。然後在培養皿底部施以一外加磁場的方式，促使磁性凝膠誘導沉積於晶片基材上，形成薄膜狀或纖維狀，所形成的薄膜以磷酸緩衝溶液(PBS)潤洗過，將多餘的凝膠洗去後乾燥，即可以 OM 和 SEM 觀察其表面結構。如此一來，即形成細胞生長的溫床，供後續進行細胞的貼附和培養。. 53.

(68) 磁場誘導成膜之實驗示意圖如下： (1) 將帶表面正、負電荷的兩種磁性奈米粒子混合，同時注入一溶氣中，以外加磁場誘導其沉澱形成薄膜，並藉由調控磁場的方向，來誘導粒子沿磁力線方向排列成具有方向性的表面結構，圖 3-12 所示。. 圖 3-12 利用磁性粒子凝膠之實驗流程設計. 54.

(69) (2) 將表面帶負電荷的磁性奈米粒子和帶有表面正電荷的磁性奈米纖維作混合，以磁鐵誘導集中於基材上成膜，膜的表面也會形成與外加磁場方向相同之方向性的線形微奈米表面結構，圖 3-13 所示。. 圖 3-13 利用磁性粒子與磁性纖維凝膠之實驗流程設計. 55.

(70) 3.5 體外(in vitro)測試評估動物細胞培養乃是評估材料的生物相容性主要的方法之一。細胞培養主要分為細胞貼附(Cell adhesion)和細胞成長(Cell growth)兩階段。若材料表面的生物相容性不佳，則細胞不易與材料的表面產生交互作用，也就是細胞不易貼附及成長；反之，若材料表面的生物相容性較佳，則材料表面會貼附細胞並進而增生。. 3.5.1 動物細胞培養本實驗所使用之許旺細胞株購自於食工所，並於本實驗室進行繼代培養。取Dulbecco’s Modified Eaglel Medium(DMEM)培養基，加入10％牛胚胎血清(Fetal bovine serum , FBS)和1％的antibodies (Penicillin/Strepomycin)做為medium，培養條件為37 ℃、5％ CO2，維持細胞生長。持續3到4天的細胞生長，之後進行細胞分盤工作。先將舊培養液倒掉，並以磷酸緩衝溶液(PBS)清洗數次後，加入trypsin- EDTA靜置 3至5分鐘，待細胞脫離表面並懸浮於溶液中，便可將細胞分配至新培養皿中完成分盤工作。貼附型的3T3纖維母細胞取自於高雄大學生科所楊文仁老師實驗室，並於本實驗室進行繼代培養。培養的方式也是取上述medium做為繼代培養之培養液，其他步驟亦相同。. 3.5.2 3T3纖維母細胞貼附測試我們將奈米粒子形成的薄膜與3T3纖維母細胞共同培養一段時間. 56.