微生物學實驗

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(1)教育部高中生物科學資優生培育計畫高雄區. 微生物學實驗. 學生：學校：授課教師：林順富老師國立高雄大學生命科學系. 1.

(2) 實驗一、革蘭氏染色法目的由於細菌是透明之微小生物，無法以肉眼觀察，必在顯微鏡下才可看到。事實上，顯微鏡下的細菌仍很微小，一般多以染料使其著色，以便觀察。. 一、概述革蘭氏染色法是由一位丹麥微生物學家漢斯-克理斯蒂安-革蘭(Hans Christian Gram)於 1884 年發明，至今仍為鑑別細菌關鍵的第一步驟。依據革蘭氏染色法可將細菌分為革蘭氏陽性以及革蘭氏陰性兩類。現已證明細菌之細胞表層結構可簡單歸納如下圖，其染色原理推測其與此兩類細菌之細胞表層結構有很大的不同有關。革蘭氏陽性菌的細胞壁結構較爲簡單，由數十層交疊的肽聚糖構成，強度較高。革蘭氏陰性菌的細胞壁結構較爲複雜，但強度較低。細胞壁外多了一層外膜。革蘭氏陰性菌的細胞壁層較薄，一般只含有寥寥數層肽聚糖。染色原理說法有二，其一為：革蘭氏陰性菌之細胞壁含脂量高，以酒精處理時會將部份脂質萃取出來，而使細胞壁結構鬆動，通透性增加，故結晶紫-碘複合體被帶出細菌體外而呈無色。革蘭氏陽性菌之細胞壁幾乎不含脂質，酒精甚至會使細胞壁脫水，故結構更加緻密，結晶紫-碘複合體就被留在細菌體內。其二為：酒精處理時，會使細菌之細胞壁肽聚醣空隙縮小。革蘭氏陽性菌之細胞壁肽聚醣較厚，而革蘭氏陰性菌較薄，所以造成結晶紫-碘複合體離開的機會較大。在本實驗中，先以結晶紫-碘進行初染後，酒精處理後，最後再以紅色番紅進行複染時，此時革蘭氏陰性菌就會染成紅色，而原本已染上藍色的革蘭氏陽性菌就會呈現出紫色。. 2.

(3) 細菌之細胞表層結構圖。. 二、藥品與器材藥品 1. 液態培養菌液  大腸桿菌(Escherichia coli)  金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 2. 染劑  初染劑：2% Crystal Violet (結晶紫)  媒染劑：Gram’s Iodine (革蘭氏碘液)  脫色劑：95% Ethanol (酒精)  複染劑：3.6% Safranin (番紅) 3. 蒸餾水洗滌瓶 4. 95%酒精 5. 鏡油. 器材 1. 2. 3. 4. 5.. 光學顯微鏡玻片 x2 拭鏡紙酒精燈接種環 3.

(4) 三、實驗步驟 (一)玻片塗抹 1. 取出玻片，於正中央畫一小圈。 2. 以接種環取出一環菌液，塗抹於玻片小圈的反側內，再均勻分散之。 3. 在酒精燈上加熱進行熱固定，以便將菌體固定在玻片上。 (二)革蘭氏染色 1. 將此玻片平放，先以 2% Crystal Violet 染液作用 30 秒，再以蒸餾水將剩餘染料沖洗去除。 2. 加入 Gram Iodine 媒染劑(Mordant)，作用 30 秒，用水沖洗。 3. 再以 95%酒精進行脫色作用。將玻片斜置，由上往下滴入酒精溶液，直到流出的酒精變成無色後，再用水沖洗。 4. 加入第二種染液 3.6%之 Safranin (Counterstain)，繼續作用 30 秒後，用水沖掉多餘之染料，以濾紙吸去玻片上之水份，在乾燥後，滴油，於顯微鏡下仔細觀察，並記錄細胞之外形與顏色。. 4.

(5) 實驗二、細菌菌數的計數法目的細菌為單細胞生物，其生長並非指細胞的變大或增重，而是指在充分養分存在下，細胞經由不斷的分裂變成一個大的族群稱之。本實驗主要能熟悉如何利用菌數之直接計算法與菌落之形成。. 一、概述細菌繁殖的結果，菌數會明顯的增加，當然整個族群的總重量也隨之提高，而養分的消耗與廢物的堆積更加明顯，這些現象都可做為細菌生長的指標。其中以菌數的測定最為方便且實用。細菌數目的測定，可直接在在顯微鏡下觀察，或以肉眼看到菌落之形成，還可利用菌液之混濁度來判斷。. 二、藥品與器材藥品與器材 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.. 金黃色葡萄球菌營養肉湯營養平碟 0.85%食鹽水無菌試管微量吸管：20-200 µl、100-1000 µl 彎曲玻棒泡在酒精中簽字筆酒精燈及試管架. 三、實驗步驟 A. 序列稀釋 1. 備一培養好之金黃色葡萄球菌菌液(原液)。 2. 取出將滅菌過之試管數支，排立於試管架上，每管各先加入 0.9 毫升滅菌過之 0.85%食鹽水。 3. 取 0.1 毫升原液菌體樣本，加入 0.9 毫升第一稀釋管混勻，此即 10-1 之稀釋液。 4. 再由 10-1 之稀釋液中取出 0.1 毫升菌液，加至下一稀釋管混勻，此即 10-2 之稀釋液。以此類推。 5. 依同法繼續稀釋下去，亦即進行 10 倍的連續稀釋至最後一管。 5.

(6) B. 菌液塗抹 1. 備 3 個固體營養培養基，標示稀釋倍數。 2. 分別由最低等稀釋液中取出 0.1 毫升菌液，均勻塗抹於對應之培養平碟上，於 30oC 培養過夜後，計算菌落之數目，一般範圍以 30~300 個為主。 C. 觀察與計算 1. 於培養平碟後方以簽字點數計算菌落數，僅計算 30 至 300 之間的菌落。 2. 菌落數 × 稀釋倍數 × 10 = 原培養液中每毫升之菌體數稀釋倍數=1：1×106 = 10-6 培養皿上平均菌數= 34 回推原樣本中之原液菌體數 : (34×106) 菌落數 / 0.1 ml = 3.4×108×10 CFU/ml (CFU：colony-forming unit). 序列稀釋及菌液塗抹示意圖。. 6.

(7) 實驗三、抑菌活性的分析目的微生物學的研究起於人類對微生物造成的生命威脅，如何控制微生物長久來就是一很重要課題。以物理方法及化學藥劑可控制細菌的生長，許多化學物質會影響細菌之生長，甚至會破壞細菌之結構或干擾其代謝反應。本實驗主要以抗生素來學習測定細菌之抑菌效果的檢測方法，以期能擴大應用來篩選出適當且有效之抗生素。. 一、概述常用抑菌活性的分析法有最低濃度抑制法及濾紙擴散法。稀釋法是將不等量之抗菌劑以漸增的方法，加入於液體或固體培養基內，被檢之細菌在一定菌數濃度下接種於此培養基，以觀察抗菌劑在何種濃度下方能完全阻止其生長或將其消滅。而擴散法是以一個濾紙盤，多孔杯或無底的小量杯，其內含有已知量的藥物，將其放入於已接種培養之被檢固體培養基內，一定時間培養後(通常 18-20 小時)測定細菌發育被抑制環之大小，來檢定其對被檢細菌之抗菌能力。然而此種方法除藥物與細菌之間的反應外，尚有一些物理及化學上主觀的因素如培養基的性質、擴散力及藥品分子之大小及其穩定性，因此使狀況標準化就能以定量的檢定藥效或微生物的感受性。. 二、藥品與器材藥品及器材 1.液態培養菌液大腸桿菌(Escherichia coli) 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 2. 抗生素 3.小濾紙 4. 鑷子. 三、實驗步驟 1. 備一隔夜培養好之金黃色葡萄球菌及大腸桿菌菌液(濃度約為每毫升 105 至 106 CFU) 各一管。 2. 取 2 個營養平碟，以簽字筆分別標明 a 及 b ；a 菌碟接種金黃色葡萄 7.

(8) 球菌，b 菌碟接種大腸桿菌。 3. 自培養液分別吸取 0.1 毫升菌液，以塗抹法均勻密塗於 a 及 b 菌碟中。 4. 以鑷子夾取小濾紙將其平鋪於菌碟培養基表面上，各濾紙間保持一定距離。 5. 取 40 μl 不同濃度之抗生素依序加至小濾紙上。 6. 於 30℃培養，隔天觀察細菌生長受抗生素抑制之情形，測量抑制圈之大小並記錄之。. 圖不同抗生素濃度對細菌產生的抑菌效果。. 8.

(9) 四、實驗結果. 學校 : _______ 姓名 : _______ 座號 : _____. 1. 細菌染色之觀察 Escherichia coli: 中文學名 : ______________ 形狀 : _____________ 顏色 : _____________ 為革蘭氏_____菌，簡寫為(G__). Staphylococcus aureus: 中文學名 : ______________ 形狀 : _____________ 顏色 : _____________ 為革蘭氏_____菌，簡寫為(G__). 圖檔裁切後貼此. 圖檔裁切後貼此. 2. 細菌菌落數測試菌落數. 稀釋倍數 10___ 10___ 計算 :. 回推樣本原液之細菌菌數=_____________. 3. 抗生素感受性測試. 9.

(10) 菌種. 金黃色葡萄球菌/大腸桿菌. 濃度抑制圈大小 (mm). 五、討論. (請於課後三週內將報告電子檔 e-mail 到 [email protected] 檔名：學號+姓名；例如：1 號高大雄). 10.

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