行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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※ 配對錯誤與單股未配對核酸修復系統之交互作用 ※
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計畫類別：■個別型計畫 □整合型計畫
計畫編號：NSC 90－2320－B－002－109－
執行期間：90 年 08 月 01 日至 91 年 07 月 31 日
計畫主持人：方偉宏
共同主持人：
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立台灣大學醫學院醫事技術學系
中 華 民 國
91 年 10 月 31 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
配對錯誤與單股未配對核酸修復系統之交一互作用
Preparation of NSC Project Reports
計畫編號：NSC 90-2320-B-002-109
執行期限：90 年 8 月 1 日至 91 年 07 月 31 日
主持人：方偉宏 國立台灣大學醫學院醫事技術學系
計畫參與人員: 李淑貞，莊以光，張友婷台大醫技系碩士班 一、中文摘要 大腸桿菌核酸配對錯誤甲基指引修復 系統是以MutH、MutL、MutS 為主的十種 酵素，針對核酸配對錯誤進行修復，以確 保複製及基因重組時之忠誠度而維持基因 之穩定性。修復反應一開始，包含配對錯 誤所引發在未甲基化之一股上進行切割造 成斷股，斷股之位置可以發生在未甲基化 這一股上單一配對錯誤之 3’或 5’端，如此 以利進行修復。我們曾證明這套修復系統 除了可以修復單一鹼基配對錯誤外，尚可 修復大至 7 個鹼基嵌入及刪除之未配對寡 核酸環，但是對於較大核酸環的修復效率 則非常的低。在不同的生物體中，包括人 類，也找到了相似的修復機制與鹼基嵌入 及刪除之修復特異性。在試管中之修復結 果指出，人類細胞對於較大之未配對核酸 環異雙股核酸存在一套與核酸配對錯誤修 復機制不同之修復系統。由於到目前為 止，尚未顯示出一套特別之修復系統針對 大腸桿菌之多鹼基核酸環進行修復，因此 曾有推測多鹼基單股核酸環或許會藉由修 復附近之配對錯誤而被共同修復之。 為了驗證此想法，我們擬建構了一系列 半甲基化之異雙股核酸，在這些基質上同 時包含單一配對錯誤與 21 個未配對鹼基的 單股核酸，以及單一配對錯誤位於 21 個鹼 基核酸環之上游若干鹼基處。這些異雙股 核酸在試管中與大腸桿菌之細胞萃取物進 行修復後，再分析其修復效率。 在這個研究中，我們發現了異雙股核 酸上的單股核酸環可以經由一個股斷而被 修復，而且其修復不需要mutH、mutL、mutS 等基因產物之參與。不僅如此，在mutH、 mutL、mutS 突變株中，原本不能修復的核 酸配對錯誤也可以經由這個單股核酸環的 修復而被共同修復。這個修復必須存在一 個股斷才能發生，而且核酸環及單股未配 對核酸必須在股斷的同邊。 本實驗顯示大腸桿菌中有多重修復的 系統以確保遺傳的恒定。 關鍵詞：核酸環修復，核酸配對錯誤修復， 共同修復 AbstractThe Escherichia coli methyl-directed, MutHLS-dependent mismatch repair system controls genetic variability by correcting DNA biosynthetic errors and ensuring the fidelity of homologous genetic recombination. Initiation of repair involves the mismatch-provoked incision of the unmodified strand at a hemimethylated d(GATC) sequences. The resulting strand break, which can occur either 3’ or 5’ to the mismatch on the unmethylated strand, suffices to target correct on to this strand. This system can repair base-base mispair as well as to correct insertion or deletion heterologies up to about 7 unpaired nucleotides, but larger heterologies are poorly processed by this system. Similar repair pathways and broad insertion or deletion mispairs specificity have been found in a variety of organisms, including in human.
In vitro experiments have also suggested that
human cells possess a system distinct from the mismatch repair pathway for processing heteroduplex with large insertion/deletion heterologies. Since the results described to date suggested that there was no multibase loop specific repair system in E. coli, it’s interesting for us to know whether a mismatch in the vicinity of a loop could
provoke the repair of both heterologies (corepair phenomenon).
To test this idea, we constructed series of f1MR1-PM hemimethylated heteroduplex substrates containing both single base mismatch and 21 unpaired bases. The single base mismatch locates 43 bases upstream to the 21-base-loop. Repair efficiency of these substrates are determined by using an in vitro assay. The repair strand specificity of the methylation state and the dependent on products of mutH, mutL, mutS, and uvrD loci were tested. We found a loop repair activity is independent of methyl-directed system. Using mismatch repair deficient cell extracts, we found single base mismatch was co-repaired by a loop repair activity. In order to understand whether the distance would affect the corepair efficiency, the large nucleotides heterologies designed in different distance from the mispair base. We found co-repair can cover several hundred nucleotides section.
The results of this project highlight the important and versatility of the DNA loop repair systems in its ability not only to repair loops and but also indirectly to base-base mismatch through corepair activity.
Key words: DNA loop repair, Base-base
mismatch repair, co-repair
二、緣由與目的 大腸桿菌之甲基指引核酸配對錯誤 修復系統，在矯正核酸複製時所產生的錯 誤以及確保基因重組時之忠誠度上扮演著 極為重要的角色(1)。以細胞萃取物中(in vitro)，針對不同之基質(substrate)所引發之 甲基指引修復反應，已經在試管中使用純 化之蛋白質而重現反應(2)。參與整個修復過 程中之成員包含大腸桿菌之MutH、MutL、 MutS、DNA helicase II (uvrD 基因產物)、 單 股 核 酸 鍵 結 蛋 白(single strand DNA binding protein；SSB)、核酸聚合? (DNA polymerase III) 、 核 酸 接 合 ? (E.coli ligase)、和核酸外切? (DNA exonuclease)即 ExoI、ExoVII 或 RecJ 三者其中之一(2)。因 此以甲基指引之方式移除配對錯誤之核酸 的整個作用機制，已經被清楚地證實 (1,3)。 基本上，這套修復系統主要針對核酸複製 後(post-replication)所造成的鹼基配對錯誤 而進行修復(2)，因為當大腸桿菌核酸複製 後，新合成的一股其d(GATC) 序列有一短 暫時間尚未被dam methylase 甲基化(4)，因 此大腸桿菌甲基指引修復系統在此半甲基 化狀態之核酸上，藉由原始模版(parental strand)之甲基化狀態而指引修復發生在新 合成核酸上的配對錯誤(5)。此外，大腸桿菌 這套核酸配對錯誤修復系統，針對所有鹼 基配對錯誤之認識能力以及修復效率皆不 同(6)。一般而言，G-T 配對錯誤被修復之效 率最佳，其他之配對情形A-C、C-T、A-A、 T-T、G-G 和 A-G 則各有不同之修復效率， 而C-C 則幾乎不被修復(2,6)。 發生配對錯誤時，首先由MutS 蛋白結 合到核酸配對錯誤處(7)啟始修復反應，然後 在 ATP 之參與下，吸引 MutL 蛋白與之結 合(8)， 這樣所形成的複合物便可以活化 MutH 蛋 白 之 核 酸 內 切 ? 活 性 (DNA endonuclease) ， 於 未 甲 基 化 之 一 股 的 d(GATC) 序 列 處 切 開 而 形 成 單 股 斷 裂 (nick)(9)。此外，MutS 與 MutL 蛋白也會幫 助 MutH 蛋白，在核酸上尋找離配對錯誤 處最近之未甲基化序列，然後再進行水解 作用(10)，所以經由水解作用所形成的單股 斷裂可以發生在配對錯誤處之 3’端或 5’端
(10)。在進行移除反應(excision)時，仍然需
要MutS、MutL、DNA helicase II、再加上 適當之外切? (DNA exonuclease)共同參與
(3)
。當未甲基化序列位於配對錯誤之 3’端 時，由exonuclease I 執行 3’端往 5’端之核 酸移除工作；而未甲基化序列若位於配對 錯誤之5’端時，則由 exonuclease VII 或 RecJ 來執行 5’端往 3’端之核酸移除工作(3)，因 此整個移除反應是發生在未甲基化這一股 上。當移除反應結束後，再由核酸聚合? (DNA polymerase III)，以甲基化這一股作 為模版，重新合成被移除之部分，最後再 經由核酸接合? (DNA ligase)之接合作用 (ligation)將斷股接合，使核酸回復原本之雙 股螺旋結構。因此，當大腸桿菌之甲基指 引修復系統發生缺陷時很容易造成突變， 因為在MutH、MutL、MutS 和 UvrD 修復 蛋白之基因有缺陷之突變菌種中，最容易 觀察到轉變突變(transiton mutation)和骨架
位移突變(frame shift mutation)之現象發生 (11)，因而我們相信大腸桿菌這套核酸配對 錯誤修復系統除了修復鹼基配對錯誤外， 對於因嵌入(insertion)或刪除(deletion)所造 成之未配對鹼基的寡核酸環應該具有修復 能力。曾有報告指出，以人工合成之寡核 酸環異雙股核酸，經轉殖(transform)至大腸 桿菌中，再分析其修復情形，發現含不同 數目之未配對鹼基之寡核酸環異雙股核 酸，於活體中會有不同之修復效率(12)；在 試管中，我們曾利用大腸桿菌之細胞萃取 液進行相同之實驗也可以看到一樣之結果 (13) ，也就是含1~7 個未配對鹼基之單股寡 核酸環，可以有效地經由甲基指引修復系 統而進行修復，並且修復之效率也不受寡 核酸環之組成所影響(13)。 核酸配對錯誤修復系統，隨著演化的 進行被保留了下來，在哺乳動物中，如人 類，也有找到大腸桿菌之MutS 與 MutL 的 同源物，分別簡稱為hMSH (Human MutS
Homolog)與 hMLH (Human MutL Homolog)
(14)，而其中之各別組成和酵母菌大致相 同，例如 hMutS由 hMSH2 與 hMSH3 所 構成(15)；針對不同配對錯誤之辨識能力和 酵母菌也是相類似(15,16)，並且在功能上也 是重複的(17)。已經有報告指出，當hMSH2 或一些 hMLH(hMLH1、hPMS1、hPMS2) 之基因發生突變時，便會造成遺傳性非息 肉 性 大 腸 癌 (Hereditary non-polyposis colorectal cancer ; HNPCC) ( 18,19 )，並且伴隨 著微衛星標誌(microsatellite)不穩定之現象 發生( 20~24)，而在酵母菌中，當這些修復蛋 白發生突變時，也是容易出現微衛星增加 或減少1 個甚至 1 個以上的重複單位(repeat unit)之現象(25)。然而，當hMSH6 基因發生 突變時，在活體中並不會觀察到微衛星不 穩定之現象發生，其原因在於細胞仍然具 有正常之 hMSH3 蛋白可以執行修復之功 能，但是這樣的突變細胞，對於產生癌症 之機率仍然是相當的高(26)。因此，在真核 生物中，人類之核酸配對錯誤修復系統， 對於維持遺傳物質之穩定度或避免癌症之 產生皆扮演著極為重要的角色。在哺乳動 物中，這一套核酸配對錯誤修復系統之機 制，基本上和大腸桿菌相當的類似，也是 可以從配對錯誤處之 5’端或 3’端開始執行 修復之工作(27)，但不同的是，在細菌中是 藉由甲基化指引(methyl-directed)之方式而 修復配對錯誤處；在哺乳動物中，則是經 由斷股來指引(nick-directed)著修復蛋白進 行配對錯誤之修復(28)。而這一套核酸配對 錯誤修復系統對於各種單一配對錯誤和未 配對鹼基之寡核酸環之修復效率也不同， 就單一配對錯誤而言，一般來說，嘌呤-嘌 呤 (purine-purine) 和 嘌 呤 - 嘧 啶 (purine -pyrimidine)之配對錯誤所引發之修復效率 較好；而嘧啶-嘧啶(pyrimidine-pyrimidine) 之配對錯誤修復則較弱，尤其是 C-C 配對 錯誤(28)。對於1~5 個嵌入/刪除之未配對鹼 基環也具有和嘌呤-嘌呤，嘌呤-嘧啶之配對 錯誤相同的修復效率，而至於核酸環之修 復上限則介於8~12 個鹼基(29)，但是對於較 大之核酸環仍然不具修復之能力(29)。在近 期有報告指出，較大之核酸環在人類細胞 萃取液中，是經由 5’端之斷股而指引修 復，但是整個修復之機制，似乎和人類核 酸配對錯誤修復系統無關(30)。這樣的結果 引起我們相當的注意，因為在之前本實驗 室對於大腸桿菌的研究中發現，甲基指引 修復系統對於大至20 幾個鹼基之核酸環， 也是不具任何修復能力(13)，因此，我們所 感到興趣的是，在大腸桿菌中是否存在任 何機制來處理因嵌入或刪除所造成之大核 酸環的修復問題。核酸在進行基因重組時 (genetic recombination)，會先形成所謂的 Holliday junction(31)，然後將相同之兩股進 行互換(strand ex-change)，在這過程中，如 果所互換之兩股在序列上並非完全同源 (homeogenous)，則可能會同時形成鹼基配 對錯誤與核酸環。在酵母菌的研究中發 現，當進行基因重組過程中所產生的這些 配對錯誤與核酸環若未被修復，則會抑制 下次基因重組之進行(32)。所以，在生物體 內勢必存在一套修復系統以維持基因重組 之穩定性。在大腸桿菌中，我們已知甲基 指引修復系統會對鹼基配對錯誤與少數寡 核酸環進行修復(13)，然而，是否這一套系 統會藉由修復基因重組時所產生之配對錯 誤而間接地修復了附近的核酸環。較早期 之研究發現，參與大腸桿菌之基因互換 (gene conversion)所造成配對錯誤之修復， 是經由甲基化指引共同修復(corepair)而完
成的(33)。此外，也有人設計不同大小之核 酸環異雙股核酸，然後在活體中(in vivo)進 行實驗而證實，在大腸桿菌中對於大至514 個鹼基之核酸環，可以藉由修復附近之配 對錯誤而共同修復之，並且與甲基指引系 統有關(34)。 為了解甲基指引共同修復之專一 性、機制與反應需求，我們計畫設計一系 列半甲基化異雙股核酸，而在此異雙股核 酸上同時包含了各種配對錯誤（GG, GT, GA, AA, AC, CT, TT, CC等）與21個鹼基之 單股核酸環，然後在試管中與大腸桿菌細 胞萃取物一起反應，以研究是否存在此共 同修復之機制。此外，在核酸環與鹼基配 對錯誤之距離考量上，大部分之異雙股核 酸上的核酸環與配對錯誤相距約43個鹼 基；我們也將設計了一種異雙股核酸，其 核酸環與配對錯誤相距長達243個鹼基。以 探討修復反應的範圍。探討的項目包括： 共同修復的現象是否與配對錯誤的修復專 一性有直接的關聯；共同修復與兩者間的 距離遠近是否有關；共同修復是否也與甲 基指引之股專一性；共同修復是否需要 mutH、mutL、mutS和uvrD等基因產物之參 與等。 三、結果與討論 為了證明核酸配對錯誤與單股核酸環 是否能被大腸菌細胞萃取液所共同修復， 我們設計了含有一個各種配對錯誤及單股 核酸環的雜雙股核酸（如表一），以此雜雙 股核酸進行試管中反應，我們發現只要存 在有股缺刻的存在，就會有一個修復活性 將單股核酸環修復，而且這個活性與甲基 指引修復活性無關，而缺刻的位置可以出 現在5’端或是 3’端。如果提供的雜雙股核 酸為完整連續的核酸環，則修復的效率則 大大的降低。 我們以甲基指引缺乏的大腸菌萃取液 進行測試，發現在單股核酸環附近的核酸 配對錯誤可以被共同修復，這個修復的活 性只要是配對錯誤與單股核酸環出現在股 斷的同一邊即可發生。 由以上的結果結論出在大腸桿菌中， 針對核酸複製或是核酸重組時所產生的錯 誤，有一種以上的修復系統可以對不同規 模的錯誤進行修復，這種修復的重疊性是 確保生物體遺傳物質穩定的重要手段。 表一、mutS 大腸菌萃取液共同修復反應 修復反應中含24fmol 反應物，修復結果以 fmol 表示。 錯誤種類I 錯誤種類 II 修復Ｉ 修復 II cccGG <0.5 cccCC <0.5 C32 4.65 V32 5.52 CC C32 6.0 6 GT C32 6.7 6.8 TT C32 4.2 4.7 AA C32 4.9 4.4 AC C32 4.1 5.3 GA C32 4.6 4.0 GG C32 5.6 5.7 GG V32 4.4 4.4 C21 CC 6.7 7.4 C21 GT 2.3 2.9 C21 TT 6.4 6.8 C21 AA 5.7 5.4 C21 AC 3.7 4.1 C21 GA 4.6 4.4 C21 CT 5.1 5.5 V21 TG 4.2 4.3 四、計畫成果自評 本研究成功完成原計畫申請書中的目標。 本研究正準備投稿中。 五、參考文獻 參考文獻
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