人蔘根培植體癒傷組織及多倍體之誘導

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(1)國立高雄大學生物科技研究所碩士論文. 人蔘根培植體癒傷組織及多倍體之誘導 Induction of callus and polyploids from root explants of Panax ginseng. 研究生：黃世揚撰指導教授：陳彥澄博士. 中華民國一百零一年七月.

(2) . 謝誌 Acknowledgement 感謝指導教授陳彥澄博士的耐心指導，在碩士班兩年的過程中，提供完善的學習及研究環境，並且給我一個能夠自由發揮的機會。陳老師在試驗過程中給予我重要且關鍵的意見，適時教導我所需的試驗方法，並且鼓勵我勇於嘗試，不要害怕失敗。此外，也謝謝老師在論文撰寫期間的細心指導及不辭辛勞的修改。謝謝高雄大學生命科學系和生物科技研究所的老師們，感謝你們所教授的一切。也謝謝朱以航同學在試驗以及儀器應用方面的幫助，並時常一起討論未來的研究方向，實在讓我受益良多。謝謝我的家人，父親黃瑞成先生、母親郭麗津女士，大姐黃世婷小姐及二姐黃世雯小姐！感謝你們給我完全的信任、支持及鼓勵。感謝父母提供我學費及生活費，讓我能夠一心一意專心研究，順利完成學業。謝謝大家！黃世揚於高學大學生物科技研究所 2012/8/14. i .

(3) . 縮寫表 Abbreviations 2,4-D. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid. BA. N6-benzyladenine. MS. Murashige and Skoog medium. NAA. α-Naphthaleneacetic acid. PGRs. Plant growth regulators. TDZ. Thidiazuron . ii .

(4) . 目錄 Contents 頁次謝誌.............................................................................................................i 縮寫表........................................................................................................ii 目錄...........................................................................................................iii 表目錄........................................................................................................v 圖目錄.......................................................................................................vi 中文摘要....................................................................................................1 英文摘要....................................................................................................3 第一章前言..............................................................................................5 1.1 人蔘的分布及植物學特性.................................................................5 1.2 人蔘的組織培養.................................................................................5 1.3 人蔘的藥用價值.................................................................................7 1.4 癒傷組織誘導與形態發生研究之文獻回顧...................................11 1.5 多倍體誘導研究之文獻回顧...........................................................11 第二章材料與方法................................................................................14 2.1 植物材料...........................................................................................14 2.2 培養基、容器及環境.......................................................................14 2.3 植物生長調節劑...............................................................................14 2.4 人蔘癒傷組織之誘導.......................................................................14 2.5 人蔘癒傷組織增殖率.......................................................................15 2.6 人蔘癒傷組織之試管內形態發生...................................................15 2.7 人蔘癒傷組織之多倍體誘導...........................................................15 iii .

(5) . 2.8 統計分析...........................................................................................16 第三章結果............................................................................................17 3.1 人蔘癒傷組織之誘導.......................................................................17 3.2 人蔘癒傷組織增殖率.......................................................................18 3.3 人蔘癒傷組織之試管內形態發生...................................................18 3.4 人蔘癒傷組織之多倍體誘導...........................................................18 第四章討論............................................................................................20 4.1 人蔘癒傷組織之誘導.......................................................................20 4.2 人蔘癒傷組織增殖率.......................................................................20 4.3 人蔘癒傷組織之試管內形態發生...................................................21 4.4 人蔘癒傷組織之多倍體誘導...........................................................21 第五章參考文獻....................................................................................28 iv .

(6) . 表目錄頁次表 1.1 人蔘組織培養研究之概況............................................................10 表 3.1 人蔘癒傷組織增殖率...................................................................22 表 3.2 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響.................................23 v .

(7) . 圖目錄頁次圖 1.1 人蔘皂苷 Rb1、Rg1 和 Re 結構式....................................................9 圖 3.1 人蔘根培植體之癒傷組織............................................................24 圖 3.2 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響...................................25 圖 3.3 秋水仙素對人蔘根培植體癒傷組織的影響................................26. vi .

(8) 人蔘根培植體癒傷組織及多倍體之誘導指導教授:陳彥澄博士國立高雄大學生物科技研究所學生:黃世揚國立高雄大學生物科技研究所摘要本試驗以人蔘根部作為培植體，培養於含不同濃度的植物生長調節劑： 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D）及Thidiazuron（TDZ）之改良式Murashige and Skoog medium（MS）進行癒傷組織誘導。培養四週後結果顯示，在PGR–free 的對照組之根培植體逐漸褐化，在不同濃度的 2,4-D及TDZ誘導下，根培植體長出不同形態的癒傷組織。癒傷組織增殖率試驗中，以濃度 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 所誘導之癒傷組織增殖率最高，平均達 11.5 倍。將濃度 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ誘導的癒傷組織置入含不同濃度N6-benzyladenine （BA）及α-Naphthaleneacetic acid（NAA）之培養基觀察其形態發生。八週後結果顯示，置於PGR–free的癒傷組織逐漸褐化，此外，NAA濃度越高之誘導下癒傷組織傾向發根， BA濃度越高之誘導下則會使癒傷組織褐化。在濃度 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA之形態發生試驗中，濃度 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ所誘導之癒傷組織發根率最高，平均發根數為每培植體 3.4 條根。此外，濃度 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ誘導之癒傷組織在不同濃度BA及NAA之處理下皆無發根。在秋水仙素誘導多倍體試驗中，選用三品系癒傷組織，分別是 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ、2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ為增殖率前三高之組別。四週後結果顯示，三品系癒傷組織經由 50 及 100 mg/L秋水仙素處理後，癒傷組織的生長情形明顯受到抑制，其餘秋水仙素濃度在 0、0.5、1、2、3、4、5、10 mg/L的處理下，癒傷組織的生 1.

(9) 長情形則無太大影響。值得注意的是癒傷組織經由秋水仙素處理後，大部分呈現白色鬆軟的外觀。此現象對於未來人蔘癒傷組織誘導多倍體研究可作為參考依據。. 關鍵字:人蔘、多倍體、形態發生、癒傷組織. Induction of callus and polyploids 2.

(10) from root explants of Panax ginseng Advisor: Dr. Jen–Tsung Chen Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung Student: Shih–Yang Huang Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT Roots of Panax ginseng were used as explants to culture on MS medium supplemented with different concentrations of plant growth regulators. After four weeks, the results showed that callus could be induced by 0.5–2 mg/L of 2,4-D + 0.1–0.5 mg/L of TDZ, but the root explants in PGR–free medium became browning. Callus cultured on MS medium with 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ had highest proliferation rate which had an average of 11.5 folds. We selected the callus which induced by the concentration of 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ and 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ with different ratio of BA and NAA medium for in vitro morphogenesis. Under the condition of the callus which induced by the concentration of 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ were cultured on MS medium with 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA, the treatment could promote root formation and had an average of 3.4 roots. In addition, the callus treated with 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ were cultured on MS medium with all different ratio of BA and NAA did not possess the ability of root formation. The result showed that higher NAA/BA ratio favored to promote root induction. 0.5–100 mg/L of colchicines were used to induce polyploidy of callus, the test selected three callus lines comprising 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ、2 3.

(11) mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ and 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ﹐respectively. The results showed that at the concentrations of 50 and 100 mg/L colchicine treatment were inhibited callus growth, but other concentrations(0,0.5,1,2,3,4,5 and 10 mg/L)were not affected. It was noteworthy to mention that the callus treated by different concentrations of colchicines became white and soft.. Keywords：Panax ginseng; callus; morphogenesis; polyploidy. 4.

(12) 第一章前言 1.1 人蔘的分布及植物學特性人蔘的種類繁多，包括韓國人蔘（Panax ginseng C. A. Meyer）、西洋蔘（Panax quinquefolius L.）、三七蔘（Panax notoginseng （Burk.）F. H. Chen）以及日本蔘（Panax japonicas C. A. Meyer），但傳統醫學上指的人蔘是韓國人蔘（呂, 2002）。韓國人蔘屬於五加科（Araliaceae）多年生草本植物，主要生長在東亞，分佈於海拔 500 ~ 1100 公尺的地區，一般生長於晝夜溫差小的山地緩坡或斜坡地的針闊混合林或雜木林中，喜陰涼、濕潤的氣候（黃, 2008）。由於人蔘根部肥大，形若紡錘，常有分叉，整體形似人的頭、手、足和四肢，故稱其為人蔘（王, 1993; 田, 1995; Harris and Lieberman, 2001）。主根為其主要藥用部位，夏季生長開花，秋初結果，果色為紅色，一般在每年的 9 至 11 月之間採收，高麗人蔘播種後，需經 4 至 6 年的期間才能收成，要栽培出優良的人蔘，氣候、日照量及土壤等自然環境條件都是重要因素（楊, 1993; Li and Wardle, 2002）。人蔘其治療及預防疾病的功效備受肯定，但其培養環境條件要求嚴苛，植株成熟時間長。為了能夠更迅速取得優良、藥用成份更多的人蔘，發展一套人蔘試管內再生體系有其價值。. 1.2 人蔘的組織培養形態發生（morphogenesis）是指植物在再生或發育過程中，細胞開始分裂，隨之產生功能及形態的變化，而使其器官或個體結構形成的過 5.

(13) 程（Ramage and Williams, 2002）。器官發生（organogenesis）是形態發生的一種，是指由器官或細胞形成根、芽等器官的生長過程。器官發生又分直接器官發生與間接器官發生兩種;直接器官發生是由培植體表面直接生成器官，而間接器官發生則是指先生成癒傷組織，再由癒傷組織形成完整植物體的過程，先由部分細胞分化產生芽，然後由另一部分細胞分化產生根，並形成一株完整的植株（王和高, 2006; 冉, 2004; Ramage and Williams, 2002）。植物生長調節劑是植物組織培養中影響形態發生的重要因素之ㄧ，在人蔘的形態發生研究中，植物生長素（如 NAA 與 IBA）能夠有利於根及不定根的生成（Tang, 2000）。而細胞分裂素（如 BA）則有利於人蔘試管內芽體的誘導（Lim et al., 1997）。在人蔘的器官發生研究中，以葉柄為培植體，置於含BA及GA3的 1/2 MS培養基當中，可誘導出芽（Lim et al., 1997）。以子葉為培植體，置於 BA及IBA的MS培養基中可誘導出不定芽（Choi et al., 1999）。此外，以根為培植體，置於含IBA的MS培養基中可誘導出不定根（Choi et al., 2000 ; Han et al., 2006）（見表 1.1）。以根（Chang and Hsing, 1980; Choi et al., 2000; Huang et al., 2010）、葉柄（Lim et al., 1997）為培植體，置於含 2,4-D 及 kinetin 的 MS 培養基中可誘導出癒傷組織。而以子葉（Tang, 2000）、葉（Punja et al., 2004）為培植體，置於含 2,4-D 及 NAA 的 MS 培養基中也能誘導出癒傷組織。在誘導癒傷組織最佳培養基方面: 以根為培植體，最佳培養基是含 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L kinetin 的 MS 培養基（Huang et al., 2010）（見表 1.1）。. 6.

(14) 1.3 人蔘的藥用價值人蔘是廣為東方人使用的滋補品，用於傷癒後恢復、增強體力、調節人體荷爾蒙、降低血糖和控制血壓、控制肝指數和肝功能保健等（方, 2003; 牛, 2011; 久保, 2007）。人類使用人蔘作為中草藥的歷史至少有四千餘年，最早可追溯到春秋戰國，范蠡所著《計然》一書中，就有”人蔘出上黨，狀類人形者善 ”之描述。我國最早的藥方巨著《神農本草經》約成書於西漢，記述了”人蔘補五臟、安精神、安魂魄、止驚悸、除邪氣、明目開心，久服輕身延年”。由此可見，在西漢以前，中國人就已經知道人蔘的藥用價值了。而且自漢以後，人蔘即列為珍貴藥材，廣泛用來防治各種疾病（孫, 2006; 歐, 2001）。野生人蔘因生長環境險峻，所以不易取得，韓國於 18 世紀初開始發展人蔘栽培，人蔘根部所含皂苷是其有效成分，人蔘皂苷主要分成兩個族群，分別是Rb和Rg，而Rb包含Rb1、Rb2、Rc和Rd，而Rg則是包含Re、 Rf及Rg1（Tanaka and Kasai, 1983），人蔘皂苷中的Rb1、Rg1 和Re（見圖 1.1），對中樞神經系統據有刺激或抑制作用，也具有調節神經傳遞的作用，Rg1 和Rb1 能提升中樞神經系統活動，但是Rb1 的作用較弱。至今已分離出三十多種人蔘皂苷及十多種人蔘多醣，它們的結構十分複雜，分子量為 10,000 ~ 100,000，上述成份具有強心、擴張心血管、抗心肌缺血、耐缺氧、心肌保護、抗休克、降血脂、抗動脈粥樣硬化、降血糖、促進蛋白質合成、抗利尿、抗疲勞、促進腦部代謝、增強造血功能、抑制血小板聚集、刺激腎上腺皮質功能、增強免疫機能、增強人體適應性、抗突變、抗腫瘤等多種藥理作用（Shu et al., 2003）；人蔘皂苷更可清除. 7.

(15) 自由基與抑制脂質的過氧化，進而達到抗老的功效（Aburjai et al., 2003）。此外尚含有人蔘炔醇、人蔘環氧炔醇、α –人蔘烯、有機酸、甾醇、木質素、酶類、黃酮類和銅、鋅、錳等微量元素（徐, 2001）。近年來由於化學藥物普遍使用所衍生的諸多問題，已經引起人們研究草藥之興趣。歐洲有些國家如德國、英國，已允許醫生開草藥處方給病人治病，醫學院中亦教授有關草藥的課程，且在醫藥法規中，訂定草藥療效與安全的標準，其中人蔘最為常用（江, 2008; 顏等, 2005）。台灣現今面臨高齡化社會及環境污染等問題，國人需要更多有效的保健食品以增進健康，人蔘的藥用成分非常多樣，譬如人蔘皂苷、人蔘多醣等都是保健醫療市場上不可或缺的來源（Hasegawa, 2004; Park et al., 2003; Shin et al., 2000），因此，利用植物組織培養是比較能夠大量生產，另一方面也可以維持優良性狀的有效方法。. 圖 1.1 人蔘皂苷 Rb1、Rg1 和 Re 結構式（鄭竣亦老師繪製）. 8.

(16) 表 1.1 人蔘組織培養研究之概況 9.

(17) Explant types. Basal. PGRs. In vitro. media. References. morphogenesis. Root. MS. 1 mg/L 2,4-D. Callus. Chang and Hsing, 1980. Petiole. MS. 1 mg/L 2,4-D +. Callus. Lim et al., 1997. 0.1 mg/L kinetin 1/2 MS 1 mg/L BA +. Shoots. 1 mg/L GA3 Cotyledons. MS. 10 mg/L GA3. Shoots and roots. Choi et al., 1998. Cotyledons. MS. 2 mg/L BA +. Adventitious buds Choi et al., 1999. 0.1 mg/L IBA Cotyledons. MS. 0.5 mg/L 2,4-D. Callus. Adventitious buds SH. 0.1 mg/L NAA. Roots. Root. 1 mg/L 2,4-D +. Callus. MS. Tang, 2000. Choi et al., 2000. 0.1 mg/L kinetin Root. SH. 5 mg/L IBA. Adventitious roots. Root. MS. 0.1 mg/L 2,4-D. Callus. Monteiro et al., 2002. Leaf. MS. 2 mg/L 2,4-D +. Callus. Punja et al., 2004. 2 mg/L NAA Root. MS. 3 mg/L IBA. Adventitious roots Han et al., 2006. Root. MS. 2 mg/L 2,4-D +. Callus. 0.5 mg/L kinetin. 1.4 癒傷組織誘導與形態發生研究之文獻回顧 10. Huang et al., 2010.

(18) 植物生長調節劑對於植物的形態發生以及誘導生成癒傷組織有相當大的影響（Bonfill et al., 2002），以往的癒傷組織誘導實驗中，主要以根為培植體，置於含有不同植物生長調節劑的 MS 培養基來誘導癒傷組織生成。 1998 年 Chang 及 Hsing 等學者以人蔘根部作為培植體，以誘導癒傷組織生成，實驗結果顯示含 1 mg/L 2,4-D 的 MS 培養基能夠使根培植體生成癒傷組織。2000 年 Choi 等學者以及 2010 年 Huang 等學者也是以人蔘根部作為培植體，置於含有不同植物生長調節劑的 MS 培養基誘導癒傷組織生成，最後結果發現濃度 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kinetin 及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L kinetin 的組合可有效快速生成癒傷組織。 1997 年 Lim 等學者則是以人蔘葉柄作為培植體誘導癒傷組織，實驗結果顯示含 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L kinetin 的 MS 培養基能夠大量誘導出癒傷組織。2000 年 Tang 以人蔘子葉為培植體，置於含 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L BA 的 MS 培養基，藉此誘導出癒傷組織。2004 年 Punja 等學者以人蔘葉片作為培植體，置於含 2 mg/L 2,4-D + 2 mg/L NAA 的 MS 培養基，成功誘導出癒傷組織。. 1.5 多倍體誘導研究之文獻回顧多倍體（polyploidy）是指擁有兩套或以上染色體組的生物體，這種情形在動物界並不多見，但在植物界中多倍體的情形相當普遍，估計有 30~80%的存在率，對於植物進化過程可能是重要的一環（Masterson J, 1994）。多倍體常發生於多年生利用無性繁殖的植物，一年生及木本植物多倍體的發生率則較低（夏等, 2010; Otto, 2007; Wendel and Cronn, 11.

(19) 2003）。多倍體自然產生的途徑有兩種方式，一是體細胞的變異，體細胞在有絲分裂過程中，染色體經複製後卻沒有繼續完成分裂過程，造成染色體的加倍。另一是多倍體也可能經由未減數的配子體結合而形成（夏等, 2010; Soltis et al., 2003）。綜觀大部分的多倍體和二倍體植物比較，有植株較壯碩、高產量、抗病性及抗逆境較強等優良性狀（Dhawan and Lavania, 1996; Leitch et al., 2004）。由於多倍體的細胞有加大的情形，導致多倍體植物會有增厚、寬大的葉子，大花及果實，芽變粗、節間變短等現象，此外，多倍體植株發現其二級代謝產物有提高之現象（Dhawan and Lavania, 1996）。例如四倍體玉米其維生素A含量比二倍體高40％，還有四倍體菸草其尼古丁含量比二倍體高33％（夏等, 2010）。對於藥用植物來說，較大的生物量可能代表較多的有效成分，因此，發展藥用植物的多倍體有其商業價值（Steinitz–sears, 1962; Comai, 2005）。秋水仙素（colchicine）最初是從秋水仙（Colchicum autumnale）萃取出來的一種劇毒生物鹼。醫學方面能夠用來治療風濕病和痛風，也可做為嘔吐劑（Sannohe et al., 2002）。秋水仙素能夠誘導植物產生多倍體的機制是在減數分裂時，抑制紡錘體微管生成，阻止染色體分離。促使染色體複製，但阻止細胞分裂，結果生成的一半配子不包含染色體，而另一半配子則包含為正常兩倍的同源染色體，例如一般情況為單倍體時，則變成雙倍體，繼而導致由此結合而成的合子和胚胎亦包含為正常兩倍的同源染色體，例如一般情況為雙倍體時，則變成四倍體（夏等, 2010）。前人研究發現秋水仙素可以有效誘導出多種二倍體植物加倍成為四倍體。除草劑歐拉靈（oryzalin）也有類似的效果（Nguyen et al, 12.

(20) 2003）。 2004 年根據 Kim 等學者的研究指出，使用人蔘的不定根(四倍體)做為培植體，分別用 50 mg/L 及 100 mg/L 秋水仙素處理 12、24、36、48 及 60 小時，實驗得知以人蔘不定根搭配 100 mg/L 秋水仙素處理 60 小時能夠誘導出最大量的八倍體，且人蔘根部中主要藥用成分的人蔘皂苷 Rg1 含量比對照組高出 22％。人蔘、西洋蔘及日本蔘皆為天然四倍體（2n = 4x = 48），三七蔘則是二倍體（2n = 2x = 24），人蔘八倍體則有 96 條染色體（2n = 8x = 96）（Choi et al., 2009）。2004 年 Kim 等學者用根尖細胞染色觀察染色體數目與流式細胞儀來判斷倍體數（Kim et al., 2004）。鑑定多倍體的方法有很多種，包括觀察氣孔或保衛細胞的大小或密度、根尖染色以及型態學上的不同，例如葉片、花朵及植株大小差異來辨認多倍體（Tang et al., 2010）。然而，鑑定多倍體最快速最準確的方法還是使用流式細胞儀（Choi et al., 2009）。. 13.

(21) 第二章材料與方法 2.1 植物材料人蔘（Panax ginseng）由芸寶生技股份有限公司(台灣屏東)所提供。. 2.2 培養基、容器及環境基礎培養基為全量 MS（Murashige and Skoog, 1962）培養基添加 30 g/L 蔗糖（sucrose）、1 g/L 蛋白胨（peptone）及 3 g/L 水晶洋菜（gelrite），並添加不同濃度的植物生長調節劑。培養基的 pH 在水晶洋菜加入前先以 1 N NaOH 或 1 N HCI 調整至 5.7。培養容器為 150×20 mm 的試管。每管試管裝有 10ml 的培養基，以單層鋁箔紙封口，經高溫（121℃）與高壓（15 psi）殺菌 20 分鐘，取出後斜置。. 2.3 植物生長調節劑本實驗使用之生長調節劑: 植物生長素 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D）與α-Naphthaleneacetic acid（NAA）及細胞分裂素Thidiazuron （TDZ）與N6-Benzyladenine（BA）。. 2.4 人蔘癒傷組織之誘導本實驗取人蔘根部切塊（2 × 2 × 2 mm3）做為培植體來誘導癒傷組織之形成。將培植體置入含有 2,4-D（0、0.5、和 2 mg/L）與TDZ（0、 0.1 和 0.5 mg/L）共七種組合的培養基。於全暗處誘導，每個處理五重複。. 14.

(22) 2.5 人蔘癒傷組織增殖率將長出癒傷組織的根培植體加以處理，取下約 2 × 2 × 2 mm3 的癒傷組織，置入含原植物生長調節劑組合的培養基的試管（150 × 20 mm）進行繼代培養，每處理五重複。一個月後將癒傷組織取出秤重，計算癒傷組織重量變化。癒傷組織增殖率之計算以最終重量除以初始重量。. 2.6 人蔘癒傷組織之試管內形態發生為了觀察不同比例植物生長素與細胞分裂素對於癒傷組織形態發生的影響，此實驗以植物生長素NAA及細胞分裂素BA加以組合，以觀察植物生長素與細胞分裂素比例高低對其形態發生的作用。本實驗選用組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ以及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ的癒傷組織，將繼代處理的癒傷組織取下約 2 × 2 × 2 mm3 做為培植體，分別置入含有不同濃度BA（0、0.01、0.1、1 和 10 mg/L）與NAA（0、0.01、0.1、 1 和 10 mg/L）之培養基的試管中，置於光照下，每種處理五重複。. 2.7 人蔘癒傷組織之多倍體誘導培養基成分為全量MS培養基、30 g/L蔗糖、1 g/L peptone及 3 g/L 水晶洋菜（gelrite），原植物生長調節劑 2,4-D及TDZ，經高溫殺菌 20 分鐘，取出置於無菌操作台。培養容器為塑膠培養皿（60 × 15 mm petri dish），於無菌操作台中等待滅菌培養基冷卻至約 60℃左右後，分別添加不同濃度（0、0.5、1、2、3、4、5、10、50 和 100 mg/L）的秋水仙素，塑膠培養皿中分別倒入 25 ml的培養基，每盤培養皿中置入兩個 2 × 2 × 2 mm3的癒傷組織，每種處理四盤。以paraffin封口，至於黑暗中培養，四週繼代 15.

(23) 一次。. 2.8 統計分析實驗結果以鄧肯氏多變域分析（Duncan’s Multiple Range Test, p＜ 0.05）計算顯著差異性。. 16.

(24) 第三章結果 3.1 人蔘癒傷組織之誘導試驗結果顯示人蔘根培植體置入誘導癒傷組織培養基一個月後，所有培植體除了對照組（無添加植物生長調節劑）外，組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ、0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ、1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ、1 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ、2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 可誘導產生癒傷組織。而這些處理所得到之癒傷組織，經分組繼代後，觀察其生長情形。觀察發現組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ、0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 及 1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 所誘導出的癒傷組織大多呈現淡黃色，質地較為結實，塊狀為主。另外組別 2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 所誘導出的癒傷組織則大多呈現白色些微透明，質地則較為鬆軟，顆粒微小分明（見圖 3.1）。癒傷組織繼代後生長情形良好，無褐化現象發生。. 3.2 人蔘癒傷組織增殖率癒傷組織繼續繼代的結果，所有處理皆增殖出更多的癒傷組織。一個月後觀察，濃度 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 之處理其癒傷組織增殖率最高，平均達 11.5 倍；濃度 2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之處理次之（8.1 倍），0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之處理再次之（7.3 倍）（見表 3.1）。. 17.

(25) 3.3 人蔘癒傷組織之試管內形態發生將癒傷組織置於不同濃度 NAA 和 BA 的培養基中，觀察其形態發生的結果。組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 以及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 的癒傷組織在 PGR–free 的對照組中，癒傷組織皆逐漸褐化。組別 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA、0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 及 1 mg/L BA + 1 mg/L NAA 處理兩週後的癒傷組織逐漸從淡黃色轉成淡綠色，10 mg/L BA + 0.1 mg/L NAA 及 10 mg/L BA + 0.01 mg/L NAA 兩個處理的癒傷組織一個月後呈現褐化現象。每種處理培養一個月後進行繼代，八週後之結果顯示組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 用 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 處理之癒傷組織發根，而組別 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 則是無發根現象。發根數最高的是 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 誘導出的癒傷組織以 0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 處理之組別，平均每個培植體生成 3.4 條根，次之的是同樣組別之癒傷組織以 0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA 處理，發根數為平均每個培植體生成 1.4 條根。組別 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 誘導出的癒傷組織在所有不同濃度 BA 及 NAA 處理下則是只有綠化現象，而無發根（見表 3.2; 圖 3.2）。. 3.4 人蔘癒傷組織之多倍體誘導本實驗選用的癒傷組織是增殖率前三高的組別，分別是 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ、2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 三組癒傷組織。0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 所誘導生成的癒傷組織尚未經由秋水仙素處理時是大多呈現淡黃色緊密的結構，而 2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 所誘導生成 18.

(26) 的癒傷組織尚未經由秋水仙素處理時則是大多呈現白色鬆軟的結構。實驗結果顯示，三個組別的癒傷組織經由秋水仙素濃度 50 及 100 mg/L 處理後，癒傷組織的生長情形明顯受到抑制，而其餘秋水仙濃度（0、0.5、 1、2、3、4、5 和 10 mg/L）處理的癒傷組織的生長情形則是無太大影響。此外，癒傷組織經由秋水仙素處理後，大部分皆呈現白色鬆軟的外觀（見圖 3.3）。. 19.

(27) 第四章討論 4.1 人蔘癒傷組織之誘導實驗結果說明使用之植物生長素及細胞分裂素組合對於其誘導人蔘癒傷組織有顯著影響，先前的研究大多以人蔘主根為培植體，進行癒傷組織之誘導，少數以子葉、葉或葉柄做為培植體，可能是因為人蔘主要藥用成分為主根，所以使用主根做為培植體能夠盡量保存其原本有效成分。2010 年 Huang 等學者以 2,4-D 及 kinetin 組合使用，成功誘導出癒傷組織，本實驗使用之 TDZ，對於誘導人蔘癒傷組織的研究還不普遍，所以有其實驗價值。 Thidiazuron （TDZ）是一種人工合成的苯基脲類（phenylurea），以往主要用於棉花的落葉劑，被證明其有類似植物細胞分裂素的特性，所以近年來常被使用於植物的組織培養及形態發生試驗上，例如癒傷組織的誘導試驗，相較於其他腺嘌呤（adenine）衍生物的細胞分裂素，TDZ 處理過後的培植體，有著相對更高的癒傷組織生成率（Visser et al., 1992）。. 4.2 人蔘癒傷組織增殖率 1980 年 Chang 及 Hsing 等學者誘導出人蔘癒傷組織的實驗是以人蔘根部作為培植體，置於只含 2,4-D 的 MS 培養基，實驗顯示組別 1mg/L 2,4-D 能夠成功生成癒傷組織，顏色為金黃色，但是其增長緩慢，且繼代不易，容易褐化。2010，Huang 等學者提到以人蔘根部作為培植體，置於含 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L kinetin 的 MS 培養基中，能最佳誘導癒傷組織生成。此癒傷組織為淡黃色，質地緊密，具有再生的能力。本實驗顯 20.

(28) 示癒傷組織呈現白色鬆軟狀的組別生長較快，而癒傷組織呈現淡黃色緊密狀的組別則生長較慢，為了得到更良好生長更快速的癒傷組織，植物生長調節劑的選用是很重要的因素。. 4.3 人蔘癒傷組織之試管內形態發生實驗結果顯示在 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的處理中，高比例的植物生長素（NAA）可誘導癒傷組織發根，而高比例的細胞分裂素（BA）在先前研究中能夠誘導癒傷組織發芽（Choi et al., 1999），而此實驗中卻未觀察到發芽情形，可能是植物生長調節劑不同的使用比例以及種類，導致形態發生的情況不盡相同。此實驗使用兩種組別之癒傷組織來進行形態發生，分別是 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 以及 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ，組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 生成的癒傷組織呈現淡黃色緊密狀，而組別 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 生成的癒傷組織則呈現白色鬆軟狀，先前研究指出癒傷組織若為黃色緊密狀，有再生之能力，而癒傷組織若為白色鬆軟或霜狀，則較不具有再生之能力。由此兩個組別生成的癒傷組織形態去進行形態發生，發現實驗結果符合先前之研究。. 4.4 人蔘癒傷組織之多倍體誘導根據 Kim 等學者 2004 年研究結果，秋水仙素濃度 50 mg/L 誘導人蔘根產生多倍體是幾乎沒有影響，但在秋水仙濃度 50 mg/L 處理 60 小時的組別，在總共 30 個培植體數目下有 2 個多倍體生成。此外，在秋水仙素濃度 100 mg/L 處理 12、24、36、48 及 60 小時的組別則是都成功誘導出 21.

(29) 了多倍體，其中以秋水仙素濃度 100 mg/L 處理 60 小時有最高的多倍體生成率，但是其植株存活率也最低。多倍體誘導效率隨秋水仙素的濃度及處理時間的不同而有所差異，根據先前的研究可以得知，秋水仙素濃度越高或處理時間越長，對植物的毒性越強、存活率越低，但相對也得到較高比率的多倍體。本實驗是以秋水仙素濃度 0、0.5、1、2、3、4、5、10、50、100 mg/L 處理癒傷組織達一個月，2004 年 Kim 等學者則是以秋水仙素濃度 100 mg/L 處理 60 小時，就能誘導出多倍體。為了得到最佳多倍體生成率，秋水仙素處理時間長短及濃度多寡的控制為重要的因素由於本試驗所誘導人蔘癒傷組織的再生系統尚未建立，所以本試驗是否能夠得到更高比率的多倍體，尚待未來研究誘導出再生小苗之後才能加以確認。. 22.

(30) 表 3.1 人蔘癒傷組織增殖率. Treatments (mg/L). Explants. Proliferation. 2,4-D. TDZ. number. rate of callus. 0.5. 0.1. 5. 7.3 b. 0.5. 0.5. 5. 5b. 1. 0.1. 5. 6.1 b. 1. 0.5. 5. 3.97 b. 2. 0.1. 5. 8.1 b. 2. 0.5. 5. 11.5 a. Proliferation rate =. Final fresh weight – initial fresh weight Initial fresh weight. × 100%. 實驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值的差異比較（p＜0.05）。. 23.

(31) 表 3.2 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響. Treatments (mg/L). Explants. Root. Average. BA. NAA. number. number. number. 0. 0. 5. 0. 0b. 0.01. 10. 5. 7. 1.4 ab. 0.1. 10. 5. 17. 3.4 a. 1. 1. 5. 0. 0b. 10. 0.1. 5. 0. 0b. 10. 0.01. 5. 0. 0b. 實驗結果以鄧肯氏多變域分析法（Duncan’s Multiple Range Test）進行平均值的差異比較（p＜0.05）。. 24.

(32) a. b. c. d. e. f. g. 圖 3.1 人蔘根培植體之癒傷組織（bar = 5.0 mm）人蔘根培植體於 a：PGR-free（對照組）；b：0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ；c：0.5 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ；d：1 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ；e：1 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ；f：2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ； g：2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ 的培養基於第四週的情況. 25.

(33) a. b. c. d. e. f. g. h. i. 圖 3.2 BA 與 NAA 對癒傷組織形態發生的影響（bar = 5.0 mm）組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 a：PGR-free（對照組）；b：0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；c：0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 的培養基於第四週的情況組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 d：PGR-free（對照組）；e：0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；f：0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 的培養基於第八週的情況組別 0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ 之癒傷組織分別在 g：PGR-free（對照組）；h：0.01 mg/L BA + 10 mg/L NAA；i：0.1 mg/L BA + 10 mg/L NAA 的培養基於第十六週的情況. 26.

(34) 圖 3.3 秋水仙素對人蔘根培植體癒傷組織的影響（bar = 5.0 mm） 1a–10a. 癒傷組織組別 (0.5 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ)分別在秋水仙濃度 (0、0.5、1、2、3、4、5、10、50、100 mg/L) 處理第四週的情況 1b–10b. 癒傷組織組別 (2 mg/L 2,4-D + 0.1 mg/L TDZ) 分別在秋水仙濃度 (0、0.5、1、2、3、4、5、10、50、100 mg/L) 處理第四週的情況 1c–10c. 癒傷組織組別 (2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L TDZ) 分別在秋水仙濃度 (0、0.5、1、2、3、4、5、10、50、100 mg/L) 處理第四週的情況. 27.

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