科目名稱：生物化學( )
科目名稱：生物化學(一)
授課單元：DNA的重組與轉位
Department of Nutrition and Health Science Department of Nutrition and Health Science
Ching-Sheng Yeh Ph.D. E-mail：janson.yeh@msa.hinet.net Teachers’ Office: C533
課程大綱
DNA重組
DNA重組
轉位子
DNA
重 組
(DNA recombination)
， 顧 名 思 義 就 是
DNA分子或是片段的重新組合，使其產生變異。而
這也是生物多樣性與長年演化的重要關鍵之一。
依重組DNA的性質分為三類：
性重組
A.
同源性重組(Homologous recombination)。
B
專 性位置重組(Si
ifi
bi
i
)
B.
專一性位置重組(Site-specific recombination)。
C
轉位性重組(T
iti
l
bi
ti
)
C.
轉位性重組(Transpositional recombination)。
A
同源性重組(H
l
bi
ti
)
A.
同源性重組(Homologous recombination)
在參與重組的染色體DNA具有高度的相似性(不一
定為同源染色體) 此類型的DNA重組在原核及真
定為同源染色體)，此類型的DNA重組在原核及真
核 細 胞 皆 有 發 生 ， 最 常 見 於 細 胞 的
減 數 分 裂
核 細 胞 皆 有 發 生
最 常 見 於 細 胞 的
減 數 分 裂
(meiosis)中。
(
)
在大腸桿菌(E. coli)中，參與同源序列重組的機制
為
RecBCD pathway
，主要是藉由Rec蛋白及Ruv
蛋 白 ( 包 括 RecBCD 、 RecA 、 RuvA 、 RuvB 及
參與其中
B
專 性位置重組(Sit
ifi
bi
ti
)
B.
專一性位置重組(Site-specific recombination)：
表示其發生重組的DNA區域
表示其發生重組的
區域
只拘限於某些DNA片段
只拘限於某些
片段
，
並且從原核至真核細胞皆有，最著名的例子就是
噬菌
體感染
，此種
噬菌體
可將本身的DNA片段與
E. coli
基
因組的特定片段發生重組。
而在脊椎動物中，後天免疫中的抗體產生，必須經由
免疫球蛋白
輕鏈 重鏈的DNA重組
免疫球蛋白
(即抗體)輕鏈、重鏈的DNA重組。
C
轉位性重組(Transpositional recombination)：
C.
轉位性重組(Transpositional recombination)：
代表著基因可從原基因座(locus)「移動」(又稱為「跳躍」)至另一個基因 座，有別於上述兩種方式，其重組基因不需具備同源或相似的特徵，因此， 此重組方式亦稱為不合規則的重組(illegitimate recombination)。 在原核及真核細胞皆具備，此重組方式發現者為芭芭拉·麥克林托克(Barbara McClintock)，他在1904年對於玉米顏色研究時發現了Ac/Ds轉 位子。
除此之外 在原核系統中的
除此之外，在原核系統中的IS(Insertion sequence)、Tn (Transposon)、
真核系統中酵母菌的Ty、果蠅的p element、copia element以及人類的 Alu element，皆是利用基因嵌入的特性而影響其目的基因的表現或造成 其變異。 其變異
DNA
DNA重組
重組
一、DNA
DNA重組
重組
在原核細胞或真核細胞中，DNA重組作用都是基因
變異的主要機制，例如：
組
先
黴素
無抗藥性
重組可使原先對
四環黴素
(Tetracycline)無抗藥性
的細菌變成(transoformation)有抗藥性
的細菌變成(transoformation)有抗藥性。
真核細胞在
減數分裂(meiosis)
時，獲得基因互換
真核細胞在
減數分裂(meiosis)
時，獲得基因互換
的機會。
的機會
DNA突變或損傷時，可依賴重組作用完成修補。
1
同源性重組(Homologous recombination)
1.
同源性重組(Homologous recombination)
同質性重組發生在兩段核苷酸序列相同或相似度很
高的染色體之間
染色體互換發生於
姊妹染色分體
高的染色體之間，染色體互換發生於
姊妹染色分體
，
主要有四種方式：
主要有四種方式：
1)
染色體間單點互換。
1)
染色體間單點互換
2)
)
染色體間雙點互換。
染 體間雙點 換
Homologo s Recombination 影片(1分)3)
染色體內同向互換。
Homologous Recombination-影片(1分))
4)
染色體反同向互換。
同質性重組發生四種方式
同質性重組發生四種方式：
(A) Holliday模式
(A).Holliday模式
Robin Holliday(1964)提出的Holliday模型，是第一個被廣泛 接受的重組模型，它是通過要發生重組的2個DNA分子的2條 接受的重組模型，它是通過要發生重組的2個DNA分子的2條 單鏈在同一部位斷裂，斷裂的遊離末端彼此交換形成異源雙 鏈，然後2條雜合單鏈彼此連接形成Holliday連接體。 Holliday連接體一旦形成就能進行重排，從而改變鏈的彼此 關係，形成不同的構象，構象決定了在Holliday連接體拆分 關係，形成不同的構象，構象決定了在Holliday連接體拆分 時是否發生重組。 Holliday連接體是所有重組模型的核心。
DNA Holliday Junction-影片(42秒)
Holliday DNA重組模式的五個主要步驟:
Holliday DNA重組模式的五個主要步驟:
a) 聯會(synapsis)：兩同質性染色體並排，接著由核酸內切酶切開分別產生單股斷裂。
b) 侵入(invasion)：由解旋酶分解DNA線股；斷裂的游離端由特殊因子(類似RecA蛋白)侵入對 方雙股結構中，由DNA接合酶接合而產生交叉點。
c) 交叉點遷移(branch migration)：在前頭解旋(unwinding)及後頭解旋(winding)作用下使交叉點 往前遷移。
d) 結構旋轉180°，產生Holliday交叉結構。
e) 解套(resolution)：以核酸內切酶產生兩個對稱的切點，再由
(B) M
l
R ddi
模式
(B).Meselson
(梅塞爾森)-Radding模式
Meselson和Radding在Holliday模型的基礎上作了一
些改進 認爲DNA單鏈的形成及其向相鄰DNA雙鏈
些改進，認爲DNA單鏈的形成及其向相鄰DNA雙鏈
的侵入爲
非對稱産生
，提出Meselson-Radding模型。
的侵入爲
非對稱産生
提出Meselson Radding模型
DNA單鏈形成可在一條DNA雙鏈中首先産生，隨著
DNA單鏈形成可在 條DNA雙鏈中首先産生 隨著
缺刻處DNA鏈的修複合成，游離出的單鏈末端侵入
相鄰DNA雙鏈中，與同源部分配對結合，被替換的
DNA鏈形成一個逐漸增大的D-loop。
Homologous Recombination & Holliday Junctions-影片(1分27秒)
D loop
斷開後産生的單鏈末端交叉侵入相
D-loop
斷開後産生的單鏈末端交叉侵入相
鄰DNA雙鏈中 DNA自由末端共價連接形
鄰DNA雙鏈中，DNA自由末端共價連接形
成Holliday結構。Meselson Radding模型首
成Holliday結構。Meselson-Radding模型首
次將DNA合成與重組聯系起來，這種DNA
次將DNA合成與重組聯系起來，這種DNA
雜合鏈形成機制似乎更貼切地解釋了
非對
雜合鏈形成機制似乎更貼切地解釋了
非對
稱重組現象
。
稱重組現象
Meselson-Radding模式的五個主要步驟:
a) 聯會(synapsis)：兩同質性染色體(A/a)並排，Meselson Radding模式的五個主要步驟:
接著由核酸內切酶造成其中一條染色體(a) 中的DNA斷裂。 b) 侵入(invasion)：由解旋酶分解DNA線股； 斷裂的游離端由特殊因子(類似RecA蛋白) 侵入對方(染色體A)雙股結構中，由核酸內 切酶造成另一條染色體(A)中的DNA斷裂， DNA接合酶將兩游離端接合，形成異股接 合，此時再由核酸外切酶修剪染色體A的缺 口。 c) 染色體a殘留的3’游離端在DNA聚合酶催化 下，朝3’ 方向修補缺口，並與染色體A缺口 的5’端接合，形成交叉。 d) 結構旋轉180°，產生類似Holliday交叉結構 中間體。e)
解套 (resolution)
：
e)
解套 (resolution)
：
以核酸內切酶產
以核酸內切酶產
生兩個對稱的切
點，再由DNA接
合酶形成異股接
合，完成修補與
重組
重組。
(C)
雙股斷裂修補(d bl
t
d b
k
i )
(C).雙股斷裂修補(double strand break repair )
一般的DNA重組現象，大致遵循Holliday模式
般的
組現象 大致遵循
y模式
和Meselson-Radding模式兩種機制完成重組；
g
；
但DNA重組的另一個任務是修補整條斷裂的
染色體
(雙股同時斷裂)
。這種現象往往發生在
染 色 體 移 位
(translocation)
或
染 色 體 重 排
(rearrangement)
的過程中。
雙股斷裂修補的五個主要步驟:
a) 聯會(synapsis)：兩同質性染色體(A/a)並排，雙股斷裂修補的五個主要步驟:
其中染色體a發生雙股DNA同時斷裂。第一 步由核酸外切酶從切點5’端向3’端方向切除 DNA股線，擴大缺口，。 b) 侵入(invasion)：由解旋酶分解開切點附近 的DNA線股；染色體a的3’端隨後在特殊因 子(類似RecA蛋白)引導下，侵入對方(染色 體A)雙股結構中，三股中間體形成套環 (loop)結構，染色體A 的一股成為染色體a 修補缺口的模版。 c) 染色體a殘留的兩個3’游離端在DNA聚合酶 催化下，朝5’→3’方向修補缺口，修補時分 別以染色體A的其中一股為模版；侵入染色 體A結構的3’端接合，形成雙交叉結構中間 體。 d) 解套(resolution)：以核酸內切酶產生兩個對稱的切點 再由 d) 解套(resolution)：以核酸內切酶產生兩個對稱的切點，再由 DNA接合酶形成異股接合，完成修補與重組。2
同源性重組複合體
2.
同源性重組複合體
負責DNA重組的酵素與因子是一種過渡性的複合體。 大腸桿菌中與 重組有關的基因通稱為 基因 名稱來自 大腸桿菌中與DNA重組有關的基因通稱為rec基因(名稱來自 recombination)： recombination)： 與同質性重組最相關的是recA、recB、recC以及recD基 因。 recB、recC、recD基因產物形成RecBCD複合體---具有
雙股DNA解旋酶以及核酸外切酶的活性。 雙股DNA解旋酶以及核酸外切酶的活性
RecBCD複合體主導的雙股斷裂修補反應步驟
RecBCD複合體主導的雙股斷裂修補反應步驟
1) 兩個RecBCD複合體分別接合在
斷裂點；RecB負責3’→5’方向解 (crossover hotspot instigator) 旋；RecD負責5’→3’方向解旋與
分解。
(crossover hotspot instigator)
分解
2) 當RecBCD複合體移動到Chi位
時 由RecC辨識Chi(crossover
時，由RecC辨識Chi(crossover
hotspotinstigator, Chi)位，促使 的酵素活性受到抑制產生 RecD的酵素活性受到抑制產生 暫停效應。 3) RecD脫離複合體，但RecB的解 旋與分解工作持續進行，3’端游 離單股DNA形成「重組生成端」。
3
非同源性重組:位置專一性重組
3.
非同源性重組:位置專 性重組
(Lambda DNA) 用site-specific recombination嵌入大腸桿菌
非 同 源 性 重 組
(non-homologous recombination)
homologous recombination)
主要是
噬菌體
基因體及隨後
主要是
噬菌體
基因體及隨後
轉位子
運用的重組機制，而
其負責催化重組反應的酵素
(整合酶)只能辨識特定的DNA序列故
( ) 能指導噬菌體 DNA插入E.coli染 色體中稱為
位置專一性重組
(site-ifi
bi
ti
)
specific recombination)
。
λ
噬菌體DNA有兩種存在型式：
λ
噬菌體DNA有兩種存在型式：
裂解狀態(lytic)：噬菌體(phage)DNA在被感染的細菌中以 獨立的環形分子結構存在。 獨立的環形分子結構存在。 溶源狀態(lysogenic)：( y g ) 噬菌體DNA整合到宿主基因組中， 成為細菌染色體一部分。 為了進入溶源狀態，游離的λ噬菌體DNA必須整合(integrate)到細菌 DNA中去；而為了向裂解狀態轉化，原噬菌體DNA必須從細菌染色； 體DNA上切除(excise)。 這兩種類型間的轉換即整合和切離 都是通過 噬菌體 和細菌 這兩種類型間的轉換即整合和切離，都是通過λ噬菌體DNA和細菌 DNA之間的位置專一性重組實現的，這些特定位點叫做附著點 (attachment site，att)。
附著點(attachment site, att)
細菌染色體上的附著點 稱為attB，長度大約25 bp， 位 於生 物 素 基 因 (bio)和半乳糖基因(gal) (bio)和半乳糖基因(gal) 之間，分為B、O、B‘三 個序列組分。 噬菌體的附著位點稱為 噬菌體的附著位點稱為
attP，由P、O和P‘三個 (biotin)
attP 由P O和P 三個 序 列 組 成 ， 長 度 為 240 bp。
二、轉位子
二、轉位子
二 轉位子
二 轉位子
任何會跳躍的基因(jumping genes)都稱為轉位子(transposon)，它並不符
任何會跳躍的基因(jumping genes)都稱為轉位子(transposon)，它並不符
合以上所說的交換機制。它含有一段可以產生酵素的基因，此酵素可以催 化轉位子插入至一個新的位置。
轉位因子有兩種：轉位因子有兩種
1) 一種是insertion sequence，例如 IS5和IS10。
本身就有轉位酶 可以作為調控 IS10本身就有轉位酶(transposase)可以作為調控。 2) 另外一種轉位子常常是兩個不同的IS中間夾雜著一些其他的基因。 廣見於革蘭氏陽性及陰性菌。 轉位子與其他基因之間的關係
1
崁入序列
崁入序列(insertion sequence)，在5’端及3’端各有一組特1.
崁入序列
崁入序列(insertion sequence)，在5 端及3 端各有 組特 殊序列，大多數IS的兩組續列互為反轉重複(inverted repeat, IR)，依照其位置分別命名為左反轉重複序列(IRL)及右反轉 重複序列(IRR) 兩個IR中間為轉位酶(t )基因負 重複序列(IRR)，兩個IR中間為轉位酶(transposase)基因負 責催化轉位反應，而轉位酶的辨識序列就在兩個IR序列中 責催化轉位反應 而轉位酶的辨識序列就在兩個 序列中 (左反轉重複序列) (右反轉重複序列) (左反轉重複序列) (右反轉重複序列) (轉位酶基因的啟動子) (IS崁入後產生的正向重複序列) (正向重複序列, direct repeat sequence)(反向序列中兩個能被轉位酶辨識與作用的區段)
剪貼轉位模式(Cut-and-Paste model)
轉位酶分別辨識反轉重複(IR)及目標位置，再以其核酸內切酶於目標序列產生切口，
剪貼轉位模式(Cut and Paste model)
( ) 崁入序列(IS)隨後崁入被切開的目標序列中，此種模式稱為 『剪貼模式』(cut-and-paste model)。 paste model) 崁入後產生的缺口由DNA聚合酶補齊，目標序列此時會產生複製，即在IS兩端分 別有 段序列完全相同的正向重複序列(di t t DR )
別有一段序列完全相同的正向重複序列(direct repeat sequence, DR )。
(direct repeat sequence)
2.
原核細胞轉位子
原核細胞的基因交換
原核細胞的基因交換
原核細胞第一類轉位子
第一類轉位子與崁入序列有密切關係，結構上在3’端及5’端各有一個IS1，原核細胞第 類轉位子
第 類轉位子與崁入序列有密切關係 結構上在3 端及5 端各有 個IS1 其轉位完全依賴兩端的IS1，轉位調控也受兩端的IS1轉位的調控，如抗 氯黴素基因( hl h i l i t )氯黴素基因(chloramphenicol resistance gene)：
第一類轉位子能從R質體 轉位到無抗藥性的質體或 轉位到無抗藥性的質體或 細菌的基因體，使此質體 有抗藥性的質體 無抗藥性的細菌 或無抗藥性細菌轉變為具 有抗藥性的質體 無抗藥性的細菌 有抗藥性。 由IS主導的非複製轉位模 由IS主導的非複製轉位模 式(non-replicative model)( )， 也就是剪貼模式，故原來 的R質體會因為失去轉位 子變成無抗藥性的質體。 無抗藥性的質體 有抗藥性的細菌 子變成無抗藥性的質體 無抗藥性的質體
原核細胞第二類轉位子
第二類轉位子最大的特點是兩端具有自己的反轉重複序列原核細胞第二類轉位子
第二類轉位子最大的特點是兩端具有自己的反轉重複序列， 不 含 IS 模 組， 自 己 具 有 轉 位 機 制 ， 且 遵 循複 製 模 式 不 含 IS 模 組 自 己 具 有 轉 位 機 制 且 遵 循複 製 模 式 (replicative model)，進行轉位，以Tn3為例： 其 端 端各有 段 的 轉重複序列 轉位酶辨識位IR TnpA res TnpR Ampr IR
Tn3其5’端及3’端各有一段38 bp的反轉重複序列，是轉位酶辨識位； 中間含有三個開放讀框，分別編碼TnpA、TnpR及Ampr等三種基因。 1) TnpA：編碼的轉位酶主導的複製模式轉位。 2) T R 編 碼 的 蛋 白 質 因 子 具 有 抑 制 子 ( )或 鬆 解 酶 2) TnpR：編 碼 的 蛋 白 質 因 子 具 有 抑 制 子 (repressor) 或 鬆 解 酶 (resolvase)的功能。 3) Ampr：編碼的抗安比西林基因。
複製轉位模式(replicative model)
複製轉位模式(replicative model)
Tn3編碼的轉位酶 主導的複製模式 轉位，能使原先 轉位，能使原先 的轉位子保留原 位，而目標位置 複製 組完全相 複製一組完全相 同的轉位子。 (使雙倍體恢復成兩個質體) 同的轉位子 (R質體與目標質體各有一個轉位子)3.
真核細胞轉位子
玉米轉位子
玉米轉位子是最早發現的真核細胞轉位子，Barbara McClitock先將玉米基因體中的轉位片段稱為控制元素 McClitock先將玉米基因體中的轉位片段稱為控制元素 (control elements)。 野生型玉米具有紫色顆粒；而突變型玉米具有白色顆粒。 某 些 誘 導 植 物 株 快 速 轉 換 的 元 素 稱 為活 化 元 素 某 些 誘 導 植 物 株 快 速 轉 換 的 元 素 稱 為活 化 元 素(activator element, Ac element)；而造成慢速轉換的 元素稱為解離元素(di i ti l t D l t)
元素稱為解離元素(dissociation element, Ds element)。
活化元素(activator element, Ac element)：是真核
細胞中的轉位子。
解離元素(dissociation element Ds element)：是
解離元素(dissociation element, Ds element)：是
刪除部分DNA片段不完全Ac轉位子。
遺傳學家在玉米基因體中，發現許多種有轉位功能
的
自主型元素(autonomous elements)
；亦有缺損
的
自主型元素(autonomous elements)
；亦有缺損
的元素、無法自行轉位的元素稱為
非自主型元素
的元素 無法自行轉位的元素稱為
非自主型元素
(nonautonomous elements)
。
(
)
自主型元素 非自主型元素 自 元素(autonomous elements) (nonautonomous elements)非自 元素
Ac(activator) Ds(dissociation) Ac(activator) Ds(dissociation) Spm(suppressor-mutor) dSpm(defective Spm) En(enhancer) I(inhibitor) Mu(mutator) ？
活化元素(Ac)的分子結構
A ( ti t )分子結構 是 個具有五個外顯子(E )結構的轉位酶功能活化元素(Ac)的分子結構
Ac(activator)分子結構：是一個具有五個外顯子(Exon)結構的轉位酶功能 性基因，5’端與3’端具有特殊核甘酸序列的模組，是轉位酶辨識點。 圖下方三種解離元素，其基因產物皆有缺陷的蛋白分子，無法表現正常的 轉位子的活性。 轉位子的活性 1) DS9：被刪除外顯子III。 2) DS2d1：被刪除外顯子II 。 3)) DS6：被刪除外顯子II、III 、IV 。解離元素(Ds)造成染色體斷裂，部分基因被刪除
因此，解離元素要有Ac存在時，以非複製模式進行轉位，而解離元素(Ds)造成染色體斷裂 部分基因被刪除
因此，解離元素要有Ac存在時，以非複製模式進行轉位，而 這種剪貼模式的轉位子轉位機制會造成原先位置的缺口，在 DNA修補之後，染色體往往形成不正常結構，包括缺失、重 複 倒位等現象 這就是A ( ti t )造成玉米突變的原因 複、倒位等現象，這就是Ac(activator)造成玉米突變的原因。 轉位反應可發生在同一條染色體DNA分子上，亦可發生在不同條染色體DNA分子之間4
反轉錄轉位子
4.
反轉錄轉位子
反轉錄轉位子
多種真核細胞的基因體中反轉錄轉位子
多種真核細胞的基因體中， 皆 含 有 反 轉 錄 轉 位 子 (retrotransposon)，符合反轉 錄轉錄子條件是，轉位的過 錄轉錄子條件是 轉位的過 程中存在有一段時期是RNA， 由於必須經過RNA階段 為 由於必須經過RNA階段，為 了在崁入基因體DNA中，將 以反轉錄方式將RNA回復為 DNA轉錄子。 DNA轉錄子人類染色體含有五種同類型的轉位子序列：
1)
散佈型長元素(long interspersed elements
1)
散佈型長元素(long interspersed elements,
LINEs)
)
：
占為基因體總長的20%。
它保有一個轉位子遠古以來的構造，此序列也
包含基因轉位和基因分離的主要酵素，分別
為
轉位酶(transposase)
和
分解酶(resolvase)
。
2)
Alu序列：
分別寄居在LINE 的序列中 其加總長度約為基因體的 分別寄居在LINEs的序列中，其加總長度約為基因體的 10%。長度約為300個鹼基，這個序列本身並沒有轉位 的能力，因寄居於LINEs中，它可以利用轉位子的機制 而轉入其他的基因或DNA序列中。 在5´的第 個 具有兩個RNA l III 在5 的第一個monomer，具有兩個RNA polymerase III
的promoter，在3´的第二個monomer則帶有一個31bpp p 的insertion。
Alu的轉位可做成基因訊息的中斷，也就是產生基因嚴
重的變異。 重的變異。
3) 長末端重覆序列(long termianl repeats, LTRs)：此序列
又稱為”反轉錄轉位子(retrotransposons)”，此結構與反轉 錄病毒相似，是否此序列會演化成病毒？或反轉錄病毒 錄病毒相似，是否此序列會演化成病毒？或反轉錄病毒 進入人類基因體的遺蹟？這是分子生物學家值得探討的 一個重要的課題。 4) DNA型的轉位子序列：此類轉位子是以DNA而不是通過 RNA的形式來複製的。 RNA的形式來複製的。 5)) 缺陷型的轉位子序列：因為此等序列已失去DNA複製的 能力，因此不能進行DNA轉位的動作。
