溫度逆境下植物基因產物蛋白質的生理功能(2/3)

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行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告

計畫編號: NSC 87-2311-B-002-018-B01 執行期限: 86年08月01日至87年07月31日 主 持 人: 劉麗飛教授 台灣大學農藝系 一、中文摘要 本子計畫利用粒子槍法將HVA22 基因啟動子之ABRC1（ABA-Response Complex 1）調控序列，接上 Amy64 最 小啟動子，再以 GUS 為報導基因， 轉殖到水稻中，以觀察 ABRC1 調控 序列在水稻中的表現。從PCR 及南方 氏墨點分析的結果顯示，共得到 3 個 攜帶有 3 套 ABRC1及 2 個攜帶有 4 套 ABRC1 的轉殖懸浮細胞系；在 不同的 ABA 濃度 及時間處理後， GUS 酵素活性之表現隨著 ABA 濃 度提高及處理時間增長而大幅提高。 在 GUS 組 織 化 學 染 色 分 析 中 施 以 20μM ABA 處理，則可明顯的提高 GUS 在根部、葉片及花藥中的表現， 此結果亦見於其植株後代(T1)，以上結 果證實了 ABRC1 序列可以在轉殖水 稻中受 ABA 調控，且能穩定的遺傳 至後代。另一方面，若將外加 ABA 處 理 改 成 以 1% 鹽 或 4 ℃ 低溫 處 理 時，亦可提高 GUS 的表現，但誘導 表現的幅度不若 ABA 處理明顯。 關鍵詞: ABA，ABRC，粒子槍，GUS Abstr act

This project was conducted to explore the regulation and expression of ABA response complex1 (ABRC1) which was cloned from the promoter region of barley HVA22 gene. Four

plasmids were used in this study which contain 1-4 copies of ABRC1, each was followed by Amy64 minimal promoter,

and GUS reporter gene. From PCR and

Southern blot, it revealed that 3 and 2 independent transformed cell lines harboring 3 and 4 copies of ABRC1, respectively, were available. Time course and ABA treatment assays showed that promotion of GUS activity was correlated with higher ABA concentration and longer treatment time. In histochemical analysis on T0 and T1

plants, GUS expression was enhanced by 20µM ABA drastically in roots, leaves and anthers. Besides, 1% sodium chloride or chilling could also increase GUS expression , but were not as good as ABA treatment.

Keyword: ABA, ABRC, particle bombardment, GUS

二、緣由與目的

離層酸（Abscisic acid, ABA）是 可以在植物體內自然合成的荷爾蒙， 參與植物生長與發育過程中許多生理 代謝的調節，其中最重要的包括種子 形成和植物對逆境的反應。關於離層 酸與低溫抗性的研究相當多早期的研 究 主 要探 討 低溫 下 離 層 酸 含 量 增 加

2 （2,4,5），外加離層酸可提高植物全 株或培養細胞的耐冷性（1），及內生 離層酸含量高低與耐冷性強弱間的關 係（6）等，近年來則由於分子生物學 技術發展 ， 對 於 離 層 酸 調 控 基 因 表 現，及促進耐冷性的機制方面，逐漸 開始有深入分子層次的研究。 自1980年代起，已由許多植物中 分離出受 ABA 誘導而表現的基因， 例如由小麥發育胚選殖的 Em（7）、 水稻的 rab16（8）、玉米的 rab17 （ 14 ） 、 及 大 麥 糊 粉 層 選 殖 的 HVA1、 HVA22...等基因。為了解這 些基因的表現，可進行啟動子分析， 以期尋找到 ABA 能辨識的 DNA 序 列，即 ABA 反應元素（ABA-response element, ABRE ） ， 及 由 反 式 因 子 (trans-acting factor) 中，尋找到可以與

ABRE 結合的蛋白質（ABRE binding protein, ABREBP）。 目前為止，已經證實有許多經由 ABA 誘 導 而 表 現 之 基 因 中 確 實 有 ABRE，這些被找到的 ABRE 都有一 個共同的特徵，即在 ABRE 內都含有 ACGT 為 中 心 的 類 似 G-box 序 列 （3,13）。除此之外，在大麥糊粉層 ABA誘導表現而選殖出來的的HVA22 基因中發現，在其 ABRE3 下游約 20 個鹼基的位置，有一段 TGCCACCGG 序列，稱為CE1，若把包含有 ABRE3 及 CE1的 49個鹼基調控序列片段（稱 為ABRC1），接上 Amy64 minimal 啟 動子，來驅動GUS 報導基因，將基因 轉殖到大麥幼胚，分析基因之短暫性 表現，經 ABA 處裡後，GUS 活性會 隨著此片段套數（copy）增加而提高， 只有一個套數時，比對照組增加 20-30 倍，如果同時接上四個套數，活性更 比對照組高了130 倍（10,11）。因此 經過這樣的改造後，可以更增強 ABA 對基因表現的調控，若在這種啟動子 後面連接上有用的基因，使其在 ABA 調控下大量表現產物，將是很有效的 表達系統。不過以上結果係短暫性表 現之分析，未來應建立轉殖植株，觀 察基因是否具有同樣的穩定性表現， 以期進一步探討是否可受ABA及低溫 逆境的調控。 目前在大麥轉殖植株的研究上， 尚未建立理想的轉殖系統，因此無法 利用大麥進行這方面的試驗。而本研 究室過去在水稻未成熟胚的再生培養 上，已有相當好的基礎，並且也建立 了粒子槍轉殖水稻的條件，因此本計 畫以水稻為材料，嘗試將分別含有1-4 個套數的ABRC 1調控序列，各接上

Amy64 minimal啟動子，再以 GUS 作

為報導基因，利用粒子槍轉殖到水稻 中，以期從轉殖植株中觀察 ABRC1 調控序列在轉殖水稻中受ABA及低溫 逆境誘導表現的情形。 三、結果與討論 本計畫以水稻為材料，分別將含 有 1-4 個套數的 ABRC 調控序列， 各 接 上 Amy64 最 小 啟 動 子 ， 再 以 GUS 為報導基因，利用粒子槍法轉殖 到水稻中，觀察 ABRC 調控序列在水 稻中的表現，並比較植株中含不同套 數 ABRC調控序列之表現是否與暫時 性表現具一致性。 結果顯示，所構築的 4 個質體都 不需要經過 ABA 處理，即能正常的 在水稻幼胚中表現，表示水稻幼胚內 可能已經有足以誘導 ABRC 調控序 列的ABA 濃度，最後將篩選所得到的 一部份細胞培養成懸浮細胞，一部份 使植株再生，從分析結果顯示轉殖 3 套ABRC1 的懸浮細胞中，以 PCR 擴 增發現在 3 個抗 hygromycin 的細胞 系中，都有擴增出轉殖的片段；在 4 套 ABRC/GUS 的轉殖細胞系中，得 到 2 個抗 hygromycin 的轉殖系，證 明了外來的基因成功的插入植物基因 中。 將轉殖的懸浮細胞，在細胞系建 立四個月時施以 20μM ABA 處理

3 24 小 時 後 ， 進 行 GUS 組 織 化 學 染 色，帶1 個套數 ABRC1 的 2 個懸浮 細胞系中，GUS 活性分別提高了 12 倍及 22倍；2 個套數 ABRC1 的 2 個懸浮細胞系中，GUS 活性分別提高 了 9 倍及68 倍；3 個套數 ABRC1 的 2 個懸浮細胞系中，GUS 活性分 別提高了 312倍及 220 倍；而帶有 4 個套數 ABRC1的 2 個懸浮細胞系 中，GUS 活性分別提高了 150 倍及 211 倍；在細胞系建立六個月時，僅 施以 1μM ABA 處理 3 小時 3 個 套數 ABRC1 的懸浮細胞系，GUS 活 性即能提高 45 倍；但是在細胞系建 立七個月後，再施以 20μM ABA 處 理後，各細胞系雖然仍可受 ABA 誘 導而提高 GUS 表現，但所誘導的活 性 比 三 個 月 前 處 理 的 材 料 低 了 2-3 倍，此差異是否因培養時間增長後外 來基因逐漸甲基化(9)使基因表現減 弱，或是因為粒子槍轉殖的細胞本身 具有鑲嵌的表現，導致細胞分裂後， 一些無 GUS 表現的細胞增多，而稀 釋了 GUS 活性所致，仍待未來的研 究與探討。 在轉殖植株的表現方面，1 個套 數 ABRC1 共得到 4 個獨立的轉殖 系，共得 19 株 再生株；2 個套 數 ABRC1 共得到有 3 個轉殖系，共得 21株再生株；3 個套數 ABRC1 得到 有 4個轉殖系，共得到 29 株再生 株；4 個套數ABRC1得到有 3 個轉殖 系，共得到 17 株再生株，若各取 1-4 株植株的葉片染色體組 DNA 進行 PCR 擴 增 ， 結 果 顯 示 轉 殖 1-4 套 ABRC1 的植株系都各有 2 個植株系 有擴增片段，其中最早再生出含有 3 個套數ABRC1 的植株系的4個後代仍 有 PCR 的擴增片段產生。另外，在 3 套 ABRC1的轉殖株根部、葉片及生殖 生長期中的花藥中，施以 20μM ABA 處理，並進行 GUS 組織化學染色， 由結果顯示，未處理 ABA 時根部、 葉片及花藥中就會有 GUS 表現，當 ABA 處理後，可明顯的提高 GUS 在 根部、葉片及花藥中的表現，其所結 成 之 T1 種 子 播 種 於 無 菌 含 有 hygromycin 的培養基中一星期後，有 75% 抗 hygromycin的種子 會生成 小 苗， 在 GUS 組 織 化 學 染 色 結 果 顯 示，在 20μM ABA 處理後，仍可比 未處理者明顯的提高 GUS在根部及 葉片中的表現，而活性最多分別可提 高至 127 倍及 76 倍。 在 T1 子代植株中，若施以 1% 鹽害或低溫處理也會提高 GUS 的表 現，但其 GUS 的表現不若以 ABA 處理那麼明顯，可能的原因是轉殖的 殖株仍為鑲嵌的狀態，導致受逆境誘 導的表現較弱。總的來說，在表現位 置上 GUS基因的表現並不具組織專 一性，但其GUS 基因可穩定的遺傳至 T1 子代，同時不改變植株的農藝性 狀。未來將從轉殖的後代中挑選基因 表現較為均質(homogenous) 的植株進 行分析，以期找出對低溫等逆境反應 較強之植株進行分析。 四、計畫成果自評 以本計畫執行結果而言，證明了 ABRC 可穩定的在轉殖細胞與植株中 受 ABA 誘導而表現，且其表現能穩 定的遺傳至 T1 子代。在懸浮細胞系的 表現方面，只要經由低濃度 ABA 及 短時間的處理就可明顯的提高 GUS 的表現，因此可以此條件作為日後快 速檢測細胞在轉殖後，其表現是否仍 穩定存在於轉殖系中的方法。此外， GUS 活性與所轉入之 ABRC 套數間 的 關 係大 致 上與 轉 入 大 麥 幼 胚 中 相 似，即多套數的 GUS 活性比單套數 者高，所以可依欲轉入基因之不同需 要，而選擇接上不同套數的 ABRC 調 控序列。 五、參考文獻

4 1. Chen, T.H.H., and Gusta, L.V.

（ 1993 ） Abscisic acid induced freezing resistance of cultured plant cells. Plant Physiol.73：71-75

2.. Dae, J ., and Campell, W.F.（1981）

Response of tomato plants to stressful temperatures. Plant Physiol. 67：26-29

3. Guiltinan, M.J ., Mar cotte, W.R., J r ., and Quatr ano, R.S. (1990). A plant

leucine zipper protein that recognizes an abscisic acid response element. Science 250, 267-271

4. Lee, T.M., Lur , H.S., and Chu, C

（1991）Involvement of abscisic acid in chilling tolerance of rice （Oryza sativa L.）seedling. Plant Physiol.

5：1113-5. Lee, T.M., Lur , H.S., and Chu, C

（1993）Role of abscisic acid in chilling tolerance of rice（Oryza sativa L.）seedlings. I. Endogenous

abscisic acid levels. Plant, Cell and Env. 16：481-490

6. Lee, T.M., Lur , H.S., and Chu, C

（1995）Abscisic acid and putrescine accumulation in chilling-tolerant rice cultivars. Crop Sci. 35：502-508

7. Mar cotte, J .W.R., Russel, S.H., and Quatr ano, R. （ 1989 ） Abscisic

acid-responsive sequences from the

Em gene of wheat. Plant Cell 1,

969-976.

8. Mundy, J ., and Chua, N.H. (1988).

Abscisic acid and water-stress induce the expression of a novel rice gene.

EMBO J. 7, 2279-2286.

9. Philips, R. L., Kaeppler S.M., Olhoft, P. （ 1994 ） Genetic

instability of plant tissue cultures： Breakdown of normal controls. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5222-5226.

10. Shen, Q., Uknes, S.J ., and Ho, T.H.D. (1993) Hormone response

complex of a novel abscisic acid and cycloheximide inducible barley gene. J. Biol. Chem. 268,23652-23660.

11. Shen, Q., and Ho, T.H.D. (1995)

Functional desiccation of an abscisic acid (ABA)- inducible gene reveals two independent ABA-responsive complexes each containing a G-box and a novel cis-acting element. Plant

Cell 7, 295-307.

12.. Skr iver , K., and Mundy, J . (1990)

Gene expression in response to abscisic acid and osmotic stress. Plant Cell 2, 503-512.

13. Skr iver , K., Olsen, F.L., Roger s, J .C., and Mundy, J . (1991)

Cis-acting DNA elements responsive to gibberellin and its antagonist abscisic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 ,7266-7270

14.Vilar dell, J ., Goday, A., Fr eir e, M.A., Tor r ent, M., Mar tinez, M.C., Tor ne, J .M., and Pages, M. (1990) Gene sequence, developmental expression, and protein phosphorylation of RAB-17 in maize. Plant Mol. Biol. 14, 423-432.