行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
研究人類凝血酵素調節素調控凝血酵素訊息傳遞的作用機
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計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC94-2320-B-039-037- 執行期間： 94 年 08 月 01 日至 95 年 07 月 31 日 執行單位： 中國醫藥大學醫事技術學系 計畫主持人： 黃蕙君 共同主持人： 吳華林 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 95 年 10 月 27 日
行政院國家科學委員會補助專題研究計畫
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成 果 報 告 □期中進度報告研究人類凝血酶調節素調控凝血酶訊息傳遞的作用機轉
計畫類別：■ 個別型計畫 □ 整合型計畫
計畫編號：NSC
94-2320-B-039-037
執行期間： 94 年 8 月 1 日至 95 年 7 月 31 日
計畫主持人：黃蕙君
共同主持人：
計畫參與人員：
成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、
列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢
□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢
執行單位：
中國醫藥大學醫事技術學系
中 華 民 國
95 年 10 月 31 日
一、前言
凝血酶(Thrombin)是血液凝固過程催化血纖維蛋白原轉化成血纖維蛋白的蛋 白酶，陸續的研究發現此蛋白酶在發炎反應及細胞增生等過程也扮演重要的角 色。凝血酶調控細胞的作用是經由與凝血酶接受器，G 蛋白連結而被蛋白酶所激 活的接收器(G-protein coupled protease-activated receptors，PARs)結合，引發細胞訊 息傳遞路徑活化，目前已知的凝血酶接受器分別是PAR1，PAR3 和 PAR4 三種， 人類細胞中凝血酶訊息傳遞以PAR1 為主。凝血酶調節素（Thrombomodulin；TM） 則是凝血酶的另一類受器，目前的研究皆證明凝血酶調節素是抗衡凝血酶引發的 血液凝固、發炎或腫瘤生長等反應的重要因子，近來我們發現凝血酶調節素的表 現會影響thrombin-PAR1 下游 ERKs 訊息傳遞，但是尚未釐清凝血酶調節素調控的 機制，因此闡明PAR1 與 TM 在分子層次上如何彼此調控，將有助於了解凝血酶 調節素調降凝血酶的生理意義及進一部之臨床應用。本計劃的第一與第二個重點 在探討凝血酶結合凝血酶調節素傳遞之ERKs 生長相關修飾訊息，以及闡明這些 活化的訊息因子與凝血酶–PAR1 激活的訊息傳遞路徑間的交互作用(crosstalks)， 第三個目標是進一步探究凝血酶調節素是否利用引發的訊息傳遞而調控凝血酶造 成的細胞型態、生長、移行等生理作用。本計劃將利用不同試劑如凝血酶拮抗劑、 凝血酶調節素抗體、運用定點突變技術將TM cytoplsmic domain 上重要的胺基酸 進行突變、訊息傳遞路徑拮抗劑、構築小片段干擾核酸系統等工具，以表現人類 凝血酶調節素基因的胚胎腎臟細胞株 HEK293 為主要研究細胞模式，探討凝血酶 調節素調控凝血酶作用的分子機制。
二、材料與方法
1. 樣品來源(Sample Source) 動物細胞之細胞質蛋白質經丙同沉澱後之蛋白質沉澱物(protein pellet) 0 min：400 ug x 1 (2006/08/11) 20 min：400 ug x 1 60 min：400 ug x 1 B 0 min：250 ug x 2 (2006/09/11) B 20 min：250 ug x 2 B 60 min：250 ug x 2 由於iTRAQ 一次只能同時分析四種樣品，因此先安排 B 0 min (iTRAQ 114) 0 min (iTRAQ 115) 20 min (iTRAQ 116) 60 min (iTRAQ 117) 來進行定量蛋白體分析。 2. 溶解樣品處理(Sample Dissolution)溶於Dissolution Buffer (0.5 M triethylammonium bicarbonate, pH 8.5) (~5ug/ul) 0 min：400 ug (80 ul Dissolution Buffer)
20 min：400 ug (80 ul Dissolution Buffer) 60 min：400 ug (80 ul Dissolution Buffer) B 0 min：250 ug (50 ul Dissolution Buffer)
3. 經振盪，水浴超音波，磁珠(ceramic beads)研磨(Roche) ， 反覆操作來完全溶解。
為使樣品更能溶解，然後加入Denaturant (2% SDS)：
0 min：400 ug (80 ul Dissolution Buffer) + (2 ul Denaturant 2% SDS) 20 min：400 ug (80 ul Dissolution Buffer) + (2 ul Denaturant 2% SDS) 60 min：400 ug (80 ul Dissolution Buffer) + (2 ul Denaturant 2% SDS) B 0 min：250 ug (50 ul Dissolution Buffer) + (2 ul Denaturant 2% SDS)
振盪、水浴超音波、磁珠(ceramic beads)研磨(Roche)、反覆操作來完全溶解。經過一 星期的努力反覆操作仍無法完全溶解。(2006/09/25)
4 樣品雙硫鍵還原、烷基化與酵素水解 第一次：各取30 ul 樣品(~150 ug)
樣品進行雙硫鍵還原：
B 0 min + [3 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 0 min + [3 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 20 min + [3 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 60 min + [3 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 56oC, 2 小時，進行硫鍵烷基化：
B 0 min +(TCEP) + [1.5 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 0 min + (TCEP) + [1.5 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 20 min + (TCEP) + [1.5 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 60 min + (TCEP) + [1.5 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 適溫下10分鐘後，進行Trypsin水解：
B 0 min + (10 ug Trypsin, Promega) 0 min + (10 ug Trypsin, Promega) 20 min + (10 ug Trypsin, Promega) 60 min + (10 ug Trypsin, Promega)
37oC, 16 小時，打質譜儀評估水解結果；結果質譜訊號低，表示水解切不完全。 再加10 ug Trypsin (Appiled Biosystems)繼續水解：
B 0 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 0 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 20 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 60 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 37oC, 16 小時，以質譜儀分析評估水解反應是否進行。
第二次：各取20 ul 樣品(~100 ug)
樣品進行雙硫鍵還原：
B 0 min + [2 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 0 min + [2 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 20 min + [2 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 60 min + [2 ul, 50 mM tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)] 56oC, 2 小時，進行硫鍵烷基化：
B 0 min +(TCEP) + [1 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 0 min + (TCEP) + [1 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 20 min + (TCEP) + [1 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 60 min + (TCEP) + [1 ul, 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS)] 適溫下10分鐘後，進行Trypsin水解：
B 0 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 0 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems)
20 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 60 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems)
37oC, 16 小時，以質譜儀分析評估水解反應是否進行。
第一次樣品：(~150 ug 樣品)
B 0 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 0 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 20 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 60 min + (10 ug Trypsin, Promega) + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 第二次樣品：(~100 ug 樣品)
B 0 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 0 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 20 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems) 60 min + (10 ug Trypsin, Appiled Biosystems)
3. 樣品 iTRAQ 標定(Sample i-TRAQ Label)
第一次樣品：(~150 ug 樣品)
B 0 min + 70 μL (iTRAQ 114) in ethanol 0 min + 70 μL (iTRAQ 115) in ethanol 20 min + 70 μL (iTRAQ 116) in ethanol 60 min + 70 μL (iTRAQ 117) in ethanol
適溫下10 分鐘後，取(??)樣品做質譜儀分析評估水解反應是否進行。 第二次樣品：(~100 ug 樣品)
B 0 min + 70 μL (iTRAQ 114) in ethanol 0 min + 70 μL (iTRAQ 115) in ethanol 20 min + 70 μL (iTRAQ 116) in ethanol 60 min + 70 μL (iTRAQ 117) in ethanol
4. 樣品 iTRAQ 標定品質控制(Sample i-TRAQ Label Quality Control) 第一次樣品：(~150 ug 樣品)
B 0 min + 70 μL (iTRAQ 114) in ethanol 0 min + 70 μL (iTRAQ 115) in ethanol 20 min + 70 μL (iTRAQ 116) in ethanol 60 min + 70 μL (iTRAQ 117) in ethanol
第二次樣品：(~100 ug 樣品)
B 0 min + 70 μL (iTRAQ 114) in ethanol 0 min + 70 μL (iTRAQ 115) in ethanol 20 min + 70 μL (iTRAQ 116) in ethanol 60 min + 70 μL (iTRAQ 117) in ethanol
取(??)樣品做質譜儀分析評估水解反應是否進行；結果質譜訊號如預期強度，表
示iTRAQ 標定已進行完全。(見結果 4)
5. 強陽離子交換層析區分(Fractionation by Cation Exchange Chromatograph
強陽離子交換層析管柱(200-μL)： POROS® 50 HS, 50-μm particle size, 4.0 mm × 15 mm]
Load Buffer: 10 mM potassium phosphate (KH2PO4) in 25% acetonitrile at pH 3.0
Elution Buffer 1: 10 mM potassium phosphate (KH2PO4) in 25% acetonitrile/50 mM KCl at pH 3.0 Elution Buffer 2: 10 mM potassium phosphate (KH2PO4) in 25% acetonitrile/125 mM KCl at pH 3.0 Elution Buffer 3: 10 mM potassium phosphate (KH2PO4) in 25% acetonitrile/350 mM KCl at pH 3.0 Clean Buffer: 10 mM potassium phosphate (KH2PO4) in 25% acetonitrile/1M KCl at pH 3.0
Storage Buffer: 10 mM potassium phosphate (KH2PO4) in 25% acetonitrile/0.1% NaN3 at pH 3.0
第一次樣品：(~150 ug 樣品)
A. B 0 min(iTRAQ 114)+0 min (iTRAQ 115)+20 min(iTRAQ 116)+60 min(iTRAQ 117) 混合在一起後加入10倍體積的Load Buffer，在以6N HCl調整pH至pH=2.2(以pH meter測定)後準備進行陽離子交換層析分離。
B. 陽離子交換層析管柱先以0.5 ml Clean Buffer清洗，再以1 ml Load Buffer平衡，再 將iTRAQ標定樣品以注入層析管柱(1 drop/sec)，再以0.4 ml Load Buffer清洗，然後 再以0.5 ml Elution Buffer及Clean Buffer沖提，分別收集為E與Clean沖提樣品區分。 C. 再以1 ml Storage Buffer清洗管柱與保存管柱。
第二次樣品：(~100 ug 樣品)
A. B 0 min(iTRAQ 114)+0 min (iTRAQ 115)+20 min(iTRAQ 116)+60 min(iTRAQ 117) 混合在一起後加入10 倍體積的 Load Buffer，在以 6N HCl 調整 pH 至 pH=2.2(以 pH meter 測定)後準備進行陽離子交換層析分離。
B. 陽離子交換層析管柱先以0.5 ml Clean Buffer 清洗，再以 1 ml Load Buffer 平衡， 再將iTRAQ 標定樣品以注入層析管柱(1 drop/sec)，再以 0.4 ml Load Buffer 清洗， 然後分別以0.3 ml Elution Buffer 1、Elution Buffer 2、Elution Buffer 3 及 Clean Buffer 沖提，分別收集為E1, E2, E3 與 Clean 沖提樣品區分。
C. 再以1 ml Storage Buffer 清洗管柱與保存管柱。
D. 第一次樣品： 1. 取100 ul收集液E，再加入400 ul二次去離子水稀釋氰甲烷濃度。 2. 以20 ul 100 %氰甲烷清洗C18 Zip-Tip三次，再以20 ul 二次去離子水清洗C18 Zip-Tip三次，將上述樣品流入C18 Zip-Tip，再以20 ul 二次去離子水清洗C18 Zip-Tip三次，再以20 ul 95 %氰甲烷(含0.01%甲酸)將樣品從C18 Zip-Tip沖提 出來並收集。 E. 第二次樣品：
1. 各取100 ul收集液E1, E2, E3與Clean，再加入200 ul二次去離子水稀釋氰甲烷 濃度。
2. 各樣品分別進行以下去鹽與濃縮程序：以20 ul 100 %氰甲烷清洗C18 Zip-Tip
三次，再以20 ul 二次去離子水清洗C18 Zip-Tip三次，將上述樣品流入C18
Zip-Tip，再以20 ul 二次去離子水清洗C18 Zip-Tip三次，再以15 ul 95 %氰甲
烷(含0.01%甲酸)將樣品從C18 Zip-Tip沖提出來並收集各樣品(E1Z, E2Z, E3Z
與CleanZ)。
6. 液相層析質譜儀分析(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)
取 5 ul C18 Zip-Tip純化後樣品加入 5 ul 5 %氰甲烷(含 0.01%甲酸)
混合，置樣品製於自動進樣器，每次注入5ul樣品進入nano-HPLC進行分離，再透過電灑 游離源(electro-spray source)將胜肽游離成氣態帶電離子後進入質譜儀進行質譜分析 (MS/MS)( Applied Biosystems/ MDS SCIEX QSTAR® Hybrid LC/MS/MS Quadrupole TOF System)(參見圖三)。HPLC條件：移動相A：0.1% formic acid in 5% acetonitrile and 95 % Milli-Q® water；移動相B：0.1% formic acid in 80 % acetonitrile and 20 % Milli-Q® water； 濃度梯度：5 to 60% B 120 min；流速：200 nl/min，游離源：ESI Nano-spray；QSTAR® Hybrid
LC/MS/MS質譜儀條件參照Applied Biosystems 所提供之iTRAQ™ Reagents Chemistry Reference Guide 來設定。
