子計畫三：環氧氯丙烷及二甲基甲醯胺工人之生物標記研究 Study on the Biomarkers in Workers Exposed to Epichlorohydrin and
Dimethylformamide 計畫編號：NSC 86-2621-B-002-010-Z 執行期限：自民國 86 年 8 月 1 日起至民國 87 年 7 月 31 日止 主持人：鄭尊仁 執行機構及單位名稱：國立台灣大學公共衛生學院職業醫學與工業衛生研究所 中文摘要 環氧氯丙烷（epichlorohydrin, ECH） 是環氧樹脂製造過程中的原料，也是種能 與 DNA 等大分子結合之致烷基化劑，目 前被認為是人類可能的致癌物，其基因毒 性的研究目前在動物方面的證據較為明 確，而在人類方面仍不清楚；此外，合成 樹脂製造工人也可能會暴露到二甲基甲醯 胺（dimethylformamide, DMF），先前之研 究顯示 DMF 可造成肝臟危害，而其基因 毒性則尚未被證實。因此本研究欲探討 ECH 與 DMF 對於人類之基因毒性，並進 一步地分析其代謝酵素基因型與 ECH 及 DMF 基因毒性之間的關係。 本研究以台灣某家合成樹脂製造工廠 的 85 名男性員工為研究對象，其中 85 名 工人進行姊妹染色分體交換（SCE）實驗， 而 62 名工人進行微核（MN）實驗，並以 ECH 與 DMF 環境偵測的資料及員工之工 作項目來做為暴露分組之依據。所有受訪 員工均接受詳細的問卷調查，包括基本資 料和生活習慣（抽煙及喝酒情形等）及詳 細工作史等。SCE 及（MN）頻率分析是 依 據 標 準 細 胞 學 方 法 進 行 ， GSTM1 、 GSTT1 及 EPHX1 基因多型性是以聚合 鍊鎖反應（PCR）來分析。 結果顯示，抽煙者之 SCE 頻率明顯高 於沒有抽煙者（p<0.01）；在抽煙者中，高
ECH 低 DMF 組（SCE=9.3±1.6）,及低 ECH
高 DMF 組（SCE=8.6±0.7）之 SCE 頻率 均明顯高於無 ECH 低 DMF 組（SCE=7.2 ±0.7, p<0.05），但是此差異於非抽煙者中 並無同樣發現。進一步探討 ECH 及 DMF 對於基因毒性之單獨作用，在調整其他相 關因子的作用後，高 ECH 低 DMF 暴露組 具有較高的 SCE 頻率，並且具有統計上的 顯著相關（p<0.05），而具有 EPHX1 野生 型基因且為 GSTM1 無效型基因者，亦具 有較高之 SCE 頻率，然而在 DMF 暴露組 間的 SCE 頻率則未具有統計上顯著差 異；而 MN 頻率則無以上相同之發現。 綜言之，環氧氯丙烷之暴露可能造成 姊妹染色分體交換頻率之增加，而同時具 有 EPHX1 野生型基因及 GSTM1 無效型基 因之 ECH 工人，可能也會使姊妹染色分體 交換頻率增加。 關鍵詞：環氧氯丙烷、二甲基甲醯胺、 姊妹染色分體交換、微核 Abstract
Epichlorohydrin (ECH) is an aliphatic epoxide which is extensively used in the manufacture of epoxy resins, production of synthetic glycerine, and glycidyl ethers in industry. As an alkylating agent, ECH has been shown to cause malignancy in animals. However, the genotoxicity of ECH in human remains unclear. In addition, synthetic leather manufacturing workers were also
exposed to dimethylformamide (DMF), which is a well-known hepatotoxic chemical. Evidences of carcinogencity of DMF in human beings is limited. The study was designed to understand if genetic toxicity was associated with ECH and DMF exposure in workers. Furthermore, we also investigate whether the genetic metabolic variants affect the genetic toxicity caused by ECH and DMF.
A total of 85 male workers in an synthetic resin plant was included for this study. The study subjects were divided into five exposure groups based on their job titles
and the airborne ECH and DMF
concentration. The questionnaire included detailed occupational history, cigarette
smoking, alcohol consumption, and
medications. Standardized cytogenetic
method was used to determine the frequency of sister chromatid exchanges (SCE) and micronuclei (MN) in peripheral blood lymphocytes. GSTM1, GSTT1 and EPHX1
genotypes were identified using the
polymerase chain reaction (PCR).
In analysis, smoking was significantly associated with an increased SCE frequency (p<0.01). In smokers, SCE frequency was significantly higher in high ECH and low DMF exposure (SCE=9.3±1.6), low ECH and high DMF exposure (SCE=8.6±0.7) than those in none ECH and low DMF exposure (SCE=7.2±0.7, p<0.05). However, similar results were not observed in nonsmokers. After adjusting the effects of other confounders, individuals of high ECH and low DMF exposure, had significantly higher SCE frequency than those in none
presence of combined EPHX1 wild-type and GSTM1 null-type was also associated with elevation of SCE frequency. However, SCE frequency was not associated with DMF exposure. MN frequency was also not associated with ECH and DMF exposure. We concluded that ECH exposure and the presence of EPHX1 wild-type and GSTM1 null-type may be able to increase SCE frequency in ECH workers.
Keywords: epichlorohydrin (ECH), di-methylformamide (DMF), sister chromatid exchange (SCE), micronuclei (MN). 壹、計畫緣由及目的 環 氧 氯 丙 烷 （ epichlorohydrin, ECH），是環氧樹脂製造過程所需的原料， 在工業上常用來製造環氧樹脂、殺蟲劑、 造紙及藥品等。目前已被公認為是動物致 癌物，但是對人類造成癌症之證據尚且不 足；而在動物及人類的體外試驗的結果， 均 顯 示 ECH 會 造 成 染 色 體 變 異1,2
（chromosome aberration, CA）及姊妹染色
分體交換頻率3（sister chromatid exchange,
SCE）的增加，但是暴露於 ECH 之工人， 是否產生較高基因毒性，目前仍不清楚。 此外，合成樹脂製造工人也會同時暴 露到二甲基甲醯胺 （dimethylformamide, DMF）。DMF 是一種肝毒性物質4,5，而其 基因毒性尚未被證實，目前 IARC 將二甲 基甲醯胺歸類為 2B 的致癌物質6。 另一方面，從動物實驗得知 ECH 可 能經由環氧水解 （microsomal epoxide hy-drolase, mEH）或麩胺基硫（glutathione, GSH ） 作 用 ， 代 謝 成 尿 中 代 謝 物 2,3-dihydroxy-1-S-propyl-cysteine 7,8,9。而 DMF 可能經由肝臟酵素 P450 2E1 及 GSH 作用
進 行 代 謝 ， 最 後 產 生 acetyl-S- （ N-methylcarbamoyl）-cysteine （AMCC）， 由尿中排出10，所以對於 ECH 和 DMF 代 謝能力的差異可能導致健康危害的不同。 因此，本研究以台灣某家合成樹脂製 造廠工人為研究對象，利用生物標記的技 術，分析體內早期效應標記（biomarker of early response）—姊妹染色分體交換及微 核（micronuclei, MN）頻率與外在暴露的 關係。並進一步探討不同的易感性標記， 如 GSTM1、GSTT1、EPHX1 基因多型性 與 ECH 及 DMF 所產生的基因毒性之間的 關係。 貳、結果 1.描述性統計 本研究對象共計 85 名男性合成樹脂 製造工人，年齡為 24∼44 歲（31.9±5.2 歲），工作年資平均約為 6 年 （0.5∼21.0 年），現今抽煙者有 42 人 （49%），有喝 酒習慣者有 24 人（28%），此 85 人之 GSTM1 及 GSTT1 無效基因型者各佔有 54.1%及 50.6%，而具有 EPHX1 野生型基 因者佔有 81.2%，異型合子突變型基因者 佔 17.6% ， 同 型 合 子 突 變 型 基 因 者 佔 1.2%，其中 85 名進行姊妹染色分體交換 頻率分析，而 62 名進行微核頻率分析。 2.姊妹染色分體交換頻率及其與代謝基因 多型性的關係 全體 85 人之姊妹染色分體交換頻率 為 7.9±1.3（標準差），HFC（high frequency cell）為 13.6±2.5，其高 ECH 低 DMF 組 21 人、低 ECH 高 DMF 組 14 人、低 ECH 低 DMF 組 21 人、無 ECH 高 DMF 組 20 人與無 ECH 低 DMF 組 9 人，其 SCE 頻率 分別為 8.3±1.5、7.7±1.2、7.8±1.1、7.8 ±1.4 及 7.4±1.1，結果顯示高 ECH 低 DMF 組比低 ECH 低 DMF 組有較高之姊 妹染色分體交換頻率，且達到統計邊際顯 著差異 （p=0.05）；而 HFC 在各組間並無 明顯差異。 進一步以抽煙習慣作分層，發現有抽 煙 習 慣 者 比 沒 有 抽 煙 習 慣 者 高 出 1.2 SCE/cell （p<0.001）。而在沒有抽煙習慣 者中，各暴露組間之 SCE 頻率並無明顯差 異，但在有抽煙習慣者中，高 ECH 低 DMF 組（SCE=9.3±1.6）,及低 ECH 高 DMF 組 （SCE=8.6±0.7）之 SCE 頻率均明顯高於 無 ECH 低 DMF 組 （ SCE=7.2 ± 0.7, p<0.05）。此外，無抽煙習慣者中，具有 EPHX1 野生型基因者比具有 EPHX1 突變 型基因者，有顯著較高之 SCE 頻率（7.4 ±0.9, p<0.01），而有抽煙習慣者中，具有 EPHX1 野生型基因者比具有 EPHX1 突變 型基因者，有較高之 SCE 頻率，但未達統 計顯著意義。 以 HFC 取代 SCE 分析，結果大致亦 如同 SCE 與各因子間的關係。 分析 GSTM1、GSTT1 及 EPHX1 基 因多型性對各暴露組之 SCE 及 HFC 的影 響 發 現 ， SCE 及 HFC 在 各 暴 露 組 與 GSTM1、GSTT1 基因型之分佈在調整抽 煙後仍然沒有顯著之差異。而具 EPHX1 野生型基因者之 SCE 及 HFC 頻率在各暴 露組間均高於具突變型基因者，雖然也未 達到統計的顯著性。 以單變項線性迴歸進行分析，結果顯 示抽煙習慣、飲酒習慣、高 ECH 低 DMF 暴露、具有 EPHX1 野生型基因者均會使 SCE 頻率增加，並達到統計上的顯著差 異；另外，若同時具有 EPHX1 野生型基 因及 GSTM1 無效型基因者，則 SCE 頻率 呈統計上顯著增加 （β=1.16, p<0.05）。 以 HFC 分析同樣發現，抽煙習慣、飲酒習 慣、EPHX1 野生型基因及同時具有 EPHX1
野生型基因及 GSTM1 無效型基因均會使 HFC 頻 率 增 加 ， 並 有 統 計 顯 著 差 異 （p<0.05）。 表 1，進一步探討 ECH 及 DMF 對於 基因毒性之單獨作用，模式 1 特別選出高 ECH 低 DMF 組、低 ECH 低 DMF 組及無 ECH 低 DMF 組等三組與其他相關因子進 行多變項迴歸分析，加以探討在低 DMF 暴露組狀況下，不同的 ECH 暴露情形與 SCE 之間的關係。結果發現，抽煙習慣及 高 ECH 低 DMF 暴露組均會使 SCE 頻率增 加 ， 並 且 具 有 統 計 上 的 顯 著 相 關 （p<0.05）。而具有 EPHX1 野生型基因且 為 GSTM1 無效型基因者，亦具有較高之 SCE 頻率（β=1.24, p=0.06）。模式 2 則以 探討在較低之 ECH 暴露組狀況下，不同 DMF 暴露與 SCE 頻率之間的關係。結果 亦發現抽煙習慣會使 SCE 頻率顯著增加 （β=1.26, p<0.01），然而並未發現 DMF 暴 露 組 間 具 有 SCE 頻 率 的 顯 著 差 異 （p=0.43,0.27），但具有 EPHX1 野生型基 因且為 GSTM1 無效型基因者，其 SCE 頻 率的增高仍是具有統計上的顯著相關（β =1.16, p=0.01）。 3.微核頻率及其與代謝基因多型性的關係 微核分析之樣本數一共有 62 名男性 工人，分別在 ECH 低 DMF 組 6 人、低 ECH 高 DMF 組 14 人、低 ECH 低 DMF 組 13 人、無 ECH 高 DMF 組 20 人與無 ECH 低 DMF 組 9 人，其微核頻率分別為 13.0±6.1、11.9±3.9、16.2±5.3、16.1± 4.0 及 15.1±8.0，因此各組之微核頻率並 無統計上顯著差異。 不論在單變項或是多變項的模式分 析中，均無法發現各因子對微核有顯著之 影響。 參、討論 本研究結果顯示，環氧氯丙烷的暴 露和抽煙習慣與姊妹染色分體交換頻率 之增加有關，而與微核頻率之增加並未 達統計上顯著性。過去已有許多研究指 出，抽煙習慣與姊妹染色分體交換或微 核頻率具有相關性11,12，但也有研究指出 抽煙習慣並不會影響微核頻率13，然而本 研 究 也呈 現 出抽 煙 習 慣 具 有相 似 的 結 果。 抽煙者在各暴露組之姊妹染色分體 交換頻率均明顯高於不抽煙者，其中高 ECH 低 DMF 組及低 ECH 高 DMF 組之 姊 妹 染色 分 體交 換 頻 率 又 明顯 高 於 無 ECH 低 DMF 組 （ 9.3 & 8.6 vs. 7.2, p<0.05）；不抽煙者若為高 ECH 低 DMF 組，其姊妹染色分體交換頻率似乎較其 他組略高 ，但各組間 均無統計顯著 差 異。由模式 1（表 1）來看，在低 DMF 暴露組中，若工人為高 ECH 暴露時則會 使 SCE 頻率的增加具有顯著意義，而模 式 2 中，在較低的 ECH 暴露狀況下，DMF 暴露並未使 SCE 頻率增加達到統計顯著 意義，而這結果呼應先前許多研究，認 為 DMF 並非為一基因毒性物質，而在合 成樹脂製造工人之 SCE 頻率增加的因 素，應是來自於 ECH 的暴露及抽煙習慣 的影響。 而在微核頻率方面，本研究的結果 都無法顯示與合成樹脂製造工人之職業 暴露相關，可能是環氧氯丙烷及二甲基 甲 醯 胺 並 不 屬 於 致 染 色 體 斷 裂 物 質 （clastogenic agent），或許是微核頻率對 於這些化學物質目前的職業暴露量的敏 感性不夠，並且可能是樣本數不足，所 以造成的統計檢驗力薄弱；此外，目前 在這方面的研究並不多，當然日後還需 要更多的研究來加以證明。
在一篇低劑量暴露環氧乙烷（與環 氧氯丙烷結構類似）之生物標記研究14指 出，8 年間環氧乙烷的濃度均低於 1 ppm （環境暴露標準值），可發現環氧乙烷之 血紅素加成物、姊妹染色分體交換頻率 和高頻率細胞之姊妹染色分體交換頻率 （HFC）及 DNA 修復能力與工作暴露有 顯著相關，且抽煙同樣是一重要影響因 子，而染色體變異、微核及 DNA 單鍊斷 裂與暴露（包括及不包括抽煙時）並沒 有顯著相關，與本研究之結果相類似。 另一方面，環氧氯丙烷可能在進入人 體後由環氧水解 （mEH）與 GSTμ進行 代謝作用，形成毒性較低的物質，但並非 所有人均能有效地進行代謝作用，可能是 因為 mEH 的調控基因 EPHX1 在 exon 4 發生突變則酵素活性增加至少 25%，野生 型 則 無 改 變15； 而 GST μ 的 調 控 基 因 GSTM1 若為非無效基因型，則具代謝酵 素的活性，若為無效型基因，則不具代謝 酵素活性的關係。本研究以模式分析在低 DMF 組中，當以無 ECH 暴露且同時具有 EPHX1 突變型基因及 GSTM1 非無效型基 因之迴歸係數為基準（β=0），則同時具 有相同 EPHX1 基因型及 GSTM1 基因型 者，其調整過後的迴歸係數則隨 ECH 暴露 濃度的增高而增加；同樣地，當工人具有 相當之 ECH 暴露時，也顯示出工人具有 EPHX1 野生型基因者及 GSTM1 無效基因 型者、EPHX1 野生型基因者且 GSTM1 非 無效基因型者或 EPHX1 突變型基因者且 GSTM1 無效基因型者、EPHX1 突變型基 因者且 GSTM1 非無效基因型者，依序具 有較高的 SCE 頻率。可見同時具有 EPHX1 野生型基因及 GSTM1 無效型基因，可能 會增加合成樹脂工人之基因毒性，但是基 因型與暴露之間的交互作用並不明顯，可 能由於目前的暴露濃度並不高或是樣本數 較少的緣故，因此有關基因型方面還需更 進一步的研究，以便釐清與暴露之間的關 係。 本研究結果亦發現暴露於 ECH 之 工人，具有較高之高頻率細胞之姊妹染 色分體交換頻率（HFC），與姊妹染色分 體交換頻率之結果相似，HFC 之增加暗 示著可能與較長時間或是較高濃度之暴 露於 ECH 有關，但還需更進一步研究， 才能釐清與暴露之間的關係。 所以 本研 究 顯示 合成 樹 脂製 造 工 人，暴露於 ECH 者具有較高的姊妹染色 分體交換頻率及高頻率細胞之姊妹染色 分體交換頻率，而具有 EPHX1 野生型基 因且具有 GSTM1 無效型基因之合成樹 脂製造工人具有較高的姊妹染色分體交 換頻率。 肆、成果自評 本研究進行基因毒性研究，與原計畫 預期結果一致，對瞭解環氧氯丙烷及二甲 基甲醯胺基因毒性有所幫助。但對於易感 性基因方面需更進一步之研究。 伍、參考文獻 1
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