克雷白氏肺炎桿菌 CG43 對多黏菌素的抗性調控分析

全文

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國立交通大學生化工程研究所

碩士論文

克雷白氏肺炎桿菌 CG43 對多黏菌素的抗性調控

分析

Regulation of polymyxin resistance in

Klebsiella pneumoniae CG43

研究生:陳顗峰

Student:Yi-Fong Chen

指導教授:彭慧玲 博士

Advisor:Hwei-Ling Peng, Ph.D

中華民國九十八年七月

July, 2009

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中文摘要

已知,由七個基因所組成的 pmr 操縱子和 ugd 所轉譯的蛋白共同參與 4-aminoarabinose 的合成,進而修飾脂多醣體的磷酸根以降低其陰電性,此修 飾行為能保護細菌免受於陽離子性抗生素多黏菌素的攻擊。比較克雷白氏肺 炎桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌以及鼠疫桿菌的 pmr 操縱子的上游序列,只在 克雷白氏菌及鼠疫桿菌的相對位置發現 PhoP 和 PmrA 的結合位;不同於鼠疫 桿菌,克雷白氏菌還擁有 pmrD 同源基因。首先,我們證實在添加 2 units/ml 多黏菌素的培養環境下,pmrH pmrF或 ugd 基因的缺損,會使克雷白氏 菌存活率下降;而 PhoP、PmrA 或 PmrD 的基因缺損時,菌株對多黏菌素的 抗性也會降低。進一步以 LacZ 為報導子分析 PpmrH的活性,結果顯示在 phoP 或 pmrA 突變株中其活性均會降低。然而,PhoP、PmrA 或 RcsB 的基因缺 損,並不影響 ugd 的啟動子 Pugd-1的活性。同時,我們利用反轉錄聚合酶鏈鎖

反應證實 ugd 和上游相鄰的 manC、manB 基因屬同一操縱子,暗示另一 ugd 啟動子的存在,我們命名為 Pugd-2。雖然 Pugd-2的活性在 rcsB 突變株中有明顯

下降,但是 rcsB 基因的缺損並不影響菌株對多黏菌素的抗性。最後,細胞內 存活率測試顯示 pmrF、phoP 或 pmrA 的基因缺損不利克雷白氏菌在已分化的 THP-1 或 RAW264.7 細胞內的存活。

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Abstract

It has been demonstrated that the seven-gene pmr operon and ugd respectively encode the proteins for the synthesis of 4-aminoarabinose to modify the phosphate residues of lipopolysaccharide (LPS). The decrease of the net negative charge by the LPS modification allows protection of the bacteria from the attack of the cationic antimicrobial peptide polymyxin B. In comparison of the pmr upstream sequences of Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica, Esherichia coli and

Yersinia pestis, the putative PhoP and PmrA binding boxes were identified in the

counterpart of K. pneumoniae and Y. pestis. Different from Y. pestis, the pmrD homologue was only present in the genome of K. pneumoniae. Deletion of either

pmrH, pmrF or ugd reduced the resistance to 2 units/ml polymuxin B. The deletion

mutants of phoP, pmrA, or pmrD also appeared to decrease their resistance to polymyxin B. Promoter activity measurement using LacZ as reporter revealed a reduction of PpmrH activity in phoP or pmrA mutant. However, deletion of phoP,

pmrA or rcsB had no apparent effect on the expression of Pugd-1 indicating a

different regulation of polymyxin B resistance in K. pneumoniae from that in

S.enteric. RT-PCR analysis demonstrated that the ugd with the upstream manC and manB are organized as an operon indicating the presence of another promoter of ugd, namely Pugd-2. The activity of Pugd-2 reduced in the rcsB mutant. However, the

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deletion of pmrF, phoP or pmrA was found to reduce the bacterial survival in the cells of either THP-1 or RAW264.7.

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致謝

2007 年夏天的 8 月 27 日我踏進了這裡,2009 年同樣是夏天的 7 月 24 日我要從這裡離開。兩年的碩士生涯將告一段落,有著不捨和一份難以割捨 的情懷,感謝一直陪伴和扶持的朋友,因為你們我的生活才如此精彩。 這一路上總會遇到很多的挫折和困難,但也總會遇到很多很多的貴人, 很感謝在我很無助的時候引領我進門的指導教授,彭慧玲老師。她用心和認 真的教導,讓我從一個甚麼都不懂得門外漢漸漸地可以對自己的研究侃侃而 談,從一個沒甚麼信心的人漸漸變得有自信,從一個只會接受的人漸漸變成 也有給的能力;思考和解決問題是我從老師身上獲得的最大收穫,她總說碩 士班學生最重要的不是實驗技巧,而是邏輯思維,這點,我想我在口試的那 天領會了,很感謝彭老師一切的付出。 感謝新耀學長,對一個當初完全對分生技術沒甚麼概念的我耐心指導, 讓我的實驗可以進行的這麼順利;平易近人的盈蓉學姐給予我實驗和觀念上 許多建議和幫助;風趣的健誠學長總是帶來許多歡樂;美麗氣質的靜柔和雅 淑學姐讓我覺得實驗室有溫暖;執著的秉熹學長是我討論的好對象;熱心的 志桓幫我解決不少電腦上的問題;溫柔的純珊是我的好鄰居;一路相伴的雅 雯總是情義相挺;可愛的佩君和家華學妹為實驗室增添許多活力;沉默是金 的承哲和陽光的哲充總是替實驗室默默的付出;開朗的朝彥和信文讓我的實

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驗生活不乏味;豪君、崴云和品瑄為實驗室注入新血。感謝這些和我一起打 拚、一起努力、一起歡笑、一起瘋狂、一起發牢騷、一起體驗生活之美的你 們,為我人生中寫下美好的一頁,我會珍藏在心,因為這些都是一次次美麗 的感動。 另外,也感謝清華大學的張晃猶老師及張老師實驗室的夥伴,在口試前 百忙抽空聽我預報,給予我許多指點和建議,讓我在口試中遊刃有餘。 感謝中興大學鄧文玲老師,在口試中點出我研究的盲點和不曾思考過的 問題,以及非常用心的修改指正我的碩士論文。 感謝交通大學楊昀良老師,給予我研究上新穎的討論觀點以及導正論文 中的錯誤。 非常感謝我的家人,我的父母、哥哥、和姐姐,一路上默默的付出和相 挺,我想這是我得以完成學業的最大動力,有你們一起見證我的光榮時刻真 的很感動,感恩! 要感謝的人實在太多,族繁不及備載,但最後,我要感謝我的大學同學 碧瑩,在我最低潮的時候一直鼓勵我,因為有你,我的碩士生涯才得以這麼 順遂,感謝! 結束,不是一個解脫,而是另一個責任的開始,我想我將要接下另一個 新的責任;有人問我,兩年來你獲得什麼,一時間不知如何回答,但在即將

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離開的這刻我明白了,以前,總是老師、學長給我什麼就接受什麼,一直以 來就只是扮演著被給予的角色,但是,現在我發現我也有給的能力了,就在 離開的這刻,我想這就是彭老師所謂的帶著自信離開吧!最後,由衷的祝福 大家在未來的日子裡都能順心,百尺竿頭、更進一步! 顗峰 民國九十八年七月十八號筆於交通大學竹銘館分子調控實驗室

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目錄

中文摘要--- i 英文摘要--- ii 致謝---iv 目錄---vii 圖表目錄---viii 縮寫表--- 1 前言--- 2 實驗材料與方法--- 10 結果--- 18 討論--- 26 參考文獻--- 32 圖表--- 42 附錄--- 64

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圖表目錄

表一、本實驗所使用的菌株基因型--- 42 表二、本實驗所使用的質體構築表--- 44 表三、本實驗所使用的引子序列--- 46 圖一、不同菌種間 pmr 操縱子上游序列比較分析--- 47 圖二、PCR 分析確認 pmrH 突變株---48 圖三、PCR 分析確認 pmrF 突變株--- 49 圖四、K. pneumoniae CG43S3、pmrH 和 pmrF 突變株生長曲線--- 50 圖五、pmrH、pmrF 和 ugd 突變株及互補株對多黏菌素的抗性分析--- 51 圖六、pmrA、phoP 和 pmrD 突變株及互補株對多黏菌素的抗性分析--- 53 圖七、pmrA/phoP基因缺損的pmrA或 phoP互補株對多黏菌素的抗性分析---- 55 圖八、pmr 操縱子的基因組成示意圖和 PpmrH::lacZ 的活性測試--- 56 圖九、pmrF、pmrA 和 phoP 突變株及互補株在 THP-1 的存活率測試--- 57

圖十、pmrF、pmrA 和 phoP 突變株在 RAW264.7 的存活率測試---59

圖十一、Pugd-1的活性測試--- 60

圖十二、RT-PCR 分析確認 manC-manB-ugd 操縱子和 Pugd-2的活性測試--- 61

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縮寫表

CFU colony forming unit

LB Luria-Bertani medium PCR polymerase chain reaction bp base pair

Pmr polymyxin resistance LPS lipopolysaccharide

CPS capsular polysaccharide

PMA phorbol 12-myristate 13-acetate L-Ara4N 4-amino-4-deoxy-L-arabinose

pEtN phosphoethanolamine

ESBL extended spectrum-lactamase ONPG -nitrophenyl--galactopyranoside DMEM dulbecco's modified eagle medium Sm streptomycin

Ap ampicillin Km kanamycin Tc tetracycline

MOI multiplicity of infection FCL feedforward connector loop

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前言

克 雷 白 氏 肺 炎 桿 菌 ( Klebsiella pneumoniae ) 是 一 屬 腸 內 菌 科 (Enterobacteriaceae)的革蘭氏陰性菌,也是一伺機性病原菌,它造成的院 內感染僅次於大腸桿菌。在免疫力缺失的宿主經常造成嚴重的病灶,例如肺 炎(pneumonia)、敗血症(septicemia)、菌血症(bacteremia)、腦膜炎 (meningitis)、尿道和呼吸道感染(43, 47)。近來發現,在台灣的克雷白氏肺 炎桿菌和糖尿病病人體內好發的肝膿瘍(liver abscess)有著高度相關性 (11)。 目前,有五種克雷白氏肺炎桿菌的毒性因子已經被確定,包括莢膜多醣 體(capsule polysaccharide)、脂多醣體(lipopolysaccharide)、黏附蛋白 (adhesin)、螯鐵因子(siderophore)和血清抵抗因子(serum resistance factor)。另外,常見於大腸桿菌和克雷白氏肺炎桿菌中的廣泛抗藥性乙內醯 氨酶(extended spectrum-lactamase;ESBL)也可能和克雷白氏肺炎桿菌的 致 病 性 相 關(32);可產生廣泛抗藥性的乙內醯氨酶的克雷白氏肺炎桿菌 (ESBL-producing Klebsiella pneumoniae)的發現率有越來越高的趨勢,因而 增加了臨床上治療的困難度(27)。

脂多醣體是革蘭氏陰性菌外膜的主要結構之一,覆蓋細菌表面超過百分 之九十的面積,為細菌的主要屏障(1)。此高分子量的脂多醣體,主要由三個

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部分所組成、包括最外層的 O 抗原(O-antigen 或稱 O-polysaccharide )、連 接 O 抗原的核心部分(core region),和最內層具有高親脂性和內毒素毒性 的脂質 A(lipid A)(13, 53)。脂多醣體通常藉由脂質 A 鍵結在菌體的外膜上 (3),脂質 A 是由帶有兩個磷酸根的雙醣-D-GlcN-(1-6)-α-D-GlcN 所組成 (13),為脂多醣體主要帶負電荷的部位,也是陽離子性抗生素(cationic antibiotic)作用的主要部位。 多黏菌素(Polymyxin)類的抗生素,在臨床上被報導能有效治療克雷 白氏肺炎桿菌的感染(61)。多黏菌素是由多黏芽孢桿菌(Bacillus polymyxa) 所分離出來的一種脂縮氨酸(lipopeptide)類抗生素,由一聚陽離子縮氨酸環 (polycationic peptide ring)和尾端帶有脂肪酸的三縮氨酸支鏈(tripeptide side chain)所組成(24)。臨床上使用的多黏菌素主要有兩種:Polymyxin B 和 Polymyxin E(或稱 colistin),兩者差別在於聚陽離子縮氨酸環上的一個胺基 酸不同(33);前者主要是以硫酸鹽類(sulphate salt)劑型方式給藥,而後者 則為多黏菌素甲磺酸鹽的鈉鹽(sodium salt of colistin methanesulphonate)型 式(6)。

Polymyxin B 由至少四種成分相近的物質組成的混合物,這四種組成分 別為多黏菌素 B1 到 B4,而以 B1 和 B2 為主要成分,其間的差異在於脂肪酸 的構造不同(29, 42)。Polymyxin B 被報導對於具有多重抗藥性的腸道和非發

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酵 性 (non-fermentative ) 的 革 蘭 氏 陰 性 菌 特 別 有 效 (14, 25) 。 但 由 於 Polymyxin B 會對人體造成毒性副作用,例如:腎毒性(nephrotoxicity)和神 經毒性(neurotoxicity)(16),因此在臨床上已經停用五十幾年。目前對於它 的藥物動力學(pharmacokinetics)和藥物效力學(pharmacodynamics)的知 識很有限,由於近年來多重抗藥性(multidrug-resistance)的革蘭氏陰性菌所 引起的院內感染有增加的趨勢,因此 Polymyxin B 又被重新評估使用(33)。 Polymyxin B 是一典型的 antimicrobial peptides(AMPs),具有兩性離子和帶 正電的特性。Polymyxin B 能利用帶正電荷的特性和革蘭氏陰性菌體表面帶負 電 荷 的 脂 多 醣 體 結 合 , 藉 由 self-promoted uptake 穿 過 細 菌 外 膜 進 到 periplasmic space,並和 cytoplasmic membrane 作用。有關於 Polymyxin B 實 際對於細菌毒殺作用的機轉目前並不清楚,有兩種推測,一為 Polymyxin B 進到內膜後能在其上造成孔洞,使胞內物質流失而達到殺菌的效果;另一為 Polymyxin B 能 造 成 細 菌 的 內 膜 和 外 膜 產 生 分 子 接 觸 作 用 ( molecular contact)使得膜的脂質構造改變,最終導致物質流失和滲透壓不穩而死亡(2, 61)。 目前已知,細菌會透過對脂質 A 的修飾來降低脂多醣體的陰電性,減 少與 Polymyxin B 類的陽離子性抗生素的結合而產生抗藥性。例如,沙門氏 傷寒桿菌(Salmonella typhimurium),會在脂質 A 的磷酸根加上

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4-amino-4-deoxy-L-arabinose(L-Ara4N)和 phosphoethanolamine(pEtN)來降低脂多醣 體的陰電性(40, 63)。而此修飾過程是由 PhoP/PhoQ 和 PmrA/PmrB 兩套雙分 子系統(two-component system)所調控(19, 41)。

雙分子系統為細菌感應外界環境變化的調控系統,能幫助細菌抵抗外界 環境的壓力、調節毒性、代謝能量和取得養分(10, 15, 46, 48, 52)。雙分子系 統由組胺酸激酶(sensor histidine kinase)負責訊息的感應和反應調控子 (response regulator)負責調控基因的表現。感應組胺酸激脢位於細胞膜上, 具有組胺酸磷酸轉移酶(histidine phosphotransferase)區域(26),在感應到環 境 刺 激 時 , 此 區 域 的 組 胺 酸 殘 基 會 經 由 自 體 磷 酸 化 作 用 (autophosphorylation)加上一磷酸根,此磷酸根接著會被傳遞給位於細胞質 上的反應調控子上的天門冬胺酸(aspartic acid)殘基而活化反應調控子。經 活化的反應調控子會因為蛋白質結構的改變,再去活化或抑制下游基因的表 現(7)。目前已經有超過 180 種的雙分子系統被確定(57),這些不同的雙分子 系統間也會有交互作用,例如沙門氏菌中的雙分子系統 PhoP/PhoQ 會影響 PmrA/PmrB 的表現。

PhoP/PhoQ 為一套和毒性相關的雙分子系統(PhoQ 為感應子而 PhoP 為 反 應 調 控 子 ) , 最 早 在 沙 門 氏 菌 被 確 認 和 調 控 非 專 一 性 酸 性 磷 酸 酶 (nonspecific acid phosphatase)的表現有關,因此被命名為 pho。PhoP/PhoQ

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是第一個在細菌中被發現負責感應環境中鎂離子濃度的調控系統:微莫耳濃 度的鎂離子可以活化這套系統及下游基因的表現,然而毫莫耳濃度的鎂離子 則會抑制它的表現;錳和鈣離子也有類似的效果。PhoP/PhoQ 能感應二價陽 離子是由於 PhoQ 的 periplasmic domain 擁有許多酸性胺基酸,被認為可能和 感應二價陽離子有關(17, 19, 30, 50)。弱酸環境亦可活化受到 PhoP/PhoQ 系統 調 控 的 下 游 基 因 表 現 , 但 此 活 化 過 程 不 經 由 PhoQ 感 應 調 控 (5, 17) 。 PhoP/PhoQ 是一套可自我調控的雙分子系統,所活化的下游基因包括 pmrD、

mgtA 以及 pagP。最近的報導顯示沙門氏菌的 PhoP/PhoQ 能藉由調控 PmrD

的表現來影響 PmrA/PmrB 的活性表現(19, 21, 51)。

PmrA/PmrB 可使細菌躲避巨噬細胞的毒殺、抵抗高濃度的鐵離子及抗 生素Polymyxin B,因此被命名為 pmr(polymyxin resistance);PmrA 是這套 系 統 中 的 反 應 調 控 子 而 PmrB 是 感 應 子(9, 22, 62)。 已 知 沙 門 氏 桿 菌 的 PmrA/PmrB 可 受 兩 個 訊 號 刺 激 而 活 化 : ( i ) 低 濃 度 的 鎂 離 子 活 化 PhoP/PhoQ ,而被 PhoP 活化而表現的 PmrD 可和磷酸化的 PmrA 結合,使 PmrA 不被 PmrB 去磷酸化而使受到 PmrA 調控的基因得以持續活化表現(附 錄四,Luo and Cheng,unpublished results)。(ii)PmrB 感應高濃度的鐵離 子和弱酸性(pH 5)訊號的變化後,能將磷酸根傳給 PmrA,再由磷酸化的 PmrA 活化下游基因的表現(45, 59)。PmrA/PmrB 也是一套自我調控的雙分子

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系統,所調控的下游基因包括 pmr(也稱 arn 或 pbg)操縱子(operon)、

ugd 以及 pmrCAB,其中 pmr 操縱子 和 ugd 的表現已經被報導和 Polymyxin B

的抗性有關(54, 62)。pmr 操縱子是由七個基因所組成並且一起轉錄,命名為

pmrHFIJKLM。pmrHFIJKLM 主要產物為 L-Ara4N,其合成途徑是由一開始

的 PmrI 將 UDP-glucuronic acid 進 行 氧 化 脫 羧 反 應 而 ( oxidative decarboxylation)產生 UDP-4-ketopentose,此物質接著會被 PmrH 進行轉胺作 用(transamination)加上一麩胺酸(glutamic acid)而形成 UDP--L-Ara4N; PmrF 接著會將此物質運送到內膜和十一異戊二烯磷酸根(undecaprenyl phosphate)結合,此產物很快就會被 PmrJ 去甲基化(deformylation),再藉 由一未知機轉送到內膜的外表面(outer surface of the plasma membrane),最 後由 PmrK 將最終產物送到脂質 A 進行修飾。PmrL 和 PmrM 的功能目前並不 清楚,但是報導指出缺少這兩個酵素會使得細菌對 Polymyxin B 的抗性下降 許多(8, 60)。 不同細菌的 PmrA/PmrB 雙分子系統對於下游基因 pmrHFIJKLM 的調控 方式也不一樣,已知有三個類型:(i)在沙門氏菌中,pmrHFIJKLM 除了可 受 PmrA/PmrB 的直接調控外,也可經由 PmrD 間接受到 PhoP/PhoQ 調控,因 此低濃度鎂離子和高濃度鐵離子的環境均可活化 pmrHFIJKLM。(ii)大腸桿 菌的 PmrD 並不會跟 PmrA/PmrB 共同作用,因此其 pmrHFIJKLM 僅可受到

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PmrA/PmrB 的直接調控,而不受 PhoP/PhoQ 所調控(56)。(iii)在葉赫氏鼠 疫桿菌(Yersinia pestis)中,雖然缺少 PmrD,但 PhoP/PhoQ 和 PmrA/PmrB 均可直接調控 pmrHFIJKLM (57)。

Ugd(UDP-glucose dehydrogenase)為尿嘧啶雙磷酸葡萄糖去氫酵素, 其主要功能可催化合成 colanic acid 和 L-Ara4N 的前驅物 UDP-glucuronic acid (UDP-GlcA),colanic acid 是組成莢膜多醣體的重要成分,莢膜多醣體在克 雷白氏菌中已被報導和多黏菌素的抗性有關,主要是干擾抗生素和外膜上的 目標位置作用而達到提高耐受性的目的(47)。在大腸桿菌中,ugd 是位於 cps 基因組上,這個基因組是由超過 20 個基因所組成,主要功能也是合成莢膜多 醣體所需的 colanic acid,研究中指出,ugd 會受這基因組上的 wzc 基因產物 磷酸化,當 wzc 不活化時會使得 colanic acid 的產量減少(18, 23, 38, 39)。在沙 門 氏 菌 中 , ugd 被 發 現 和 多 黏 菌 素 的 抗 性 相 關 , 分 別 受 到 PhoP/PhoQ、 PmrA/PmrB 和 RcsC/YojN/RcsB 這三套雙分子系統的調控;在低鎂離子環境 下,能藉由 PhoP 活化其下游基因 PmrD 和 PmrA 作用後進而去調控 ugd,也 能在高濃度鐵離子的環境下活化 PmrA 去調控 ugd;RcsC/YojN/RcsB 則不和 PhoP/PhoQ 或 PmrA/PmrB 作用而直接調控 ugd 的表現(38, 39)。

分析克雷白氏肺炎桿菌 CG43、大腸桿菌、沙門氏傷寒桿菌以及葉赫氏 鼠疫桿菌的 pmrHFIJKLM 啟動子序列,如圖一所示只有克雷白氏肺炎桿菌

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CG43 的 pmrHFIJKLM 啟動子同時擁有 PhoP 和 PmrA 兩個調控子的結合位 (binding box),由於克雷白氏肺炎桿菌中還擁有 PmrD 同源蛋白,因此推 測 pmrHFIJKLM 的調控方式極有可能為第四種類型,也就是除了 PmrA/PmrB 直 接 調 控 和 PhoP/PhoQ 間 接 調 控 外 , PhoP/PhoQ 亦 可 以 直 接 調 控

pmrHFIJKLM 表現。本論文首先欲證明克雷白氏肺炎桿菌中 PmrHFIJKLM 是

否和 Polymyxin B 的抗性有關,進一步探討 pmHFIJKLM 和 PmrA/PmrB、 PhoP/PhoQ 這兩套雙分子系統的調控關係。另外,由於實驗室先前研究發現 在克雷白氏肺炎桿菌 CG43 中 ugd 並非像在沙門氏菌一樣受 PmrA/PmrB、 PhoP/PhoQ 和 RcsC/YojN/RcsB 這三套雙分子系統的調控;分析 ugd 及其上下 游的基因組成,如圖十二所示,發現有兩個可能的假定啟動子分別為 Pugd-1

Pugd-2,分析其序列發現 Pugd-1 並未擁有任一 PhoP、PmrA 或 RcsB 結合位,

Pugd-2 則擁有一個假設的 RcsB 結合位(putative RcsB binding box),因此,為

了尋找克雷白氏肺炎桿菌 CG43 ugd 的調控子,我們計畫用跳躍子突變transposon mutagenesis)方式篩選調控 ugd 的調控子。

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實驗材料與方法

質體、菌株和生長條件

本實驗所使用之菌株和質體列於表一和表二。本實驗室所配置的 Luria-Bertani(LB)培養基及培養液中的 trypton、yeast extract 及 agar 購自 Difco。 除了特別指出,菌株都是在 37℃的環境下於加入適當抗生素的 LB 培養液振 盪培養。

重組質體 DNA 的製備

重組質體 DNA 是參考 Molecular coloning 實驗手冊標準步驟製備(28)。 聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction;PCR)所使用到的引子列於表 三。質體 DNA 是用 High-speed plasmid mini kit(Geneaid,Taiwan)按照說 明書使用製備。限制內切酶(restriction endonucleases)是購自 New England Biolab(Beverly,MA,USA)或 MBI (Fermentas,Hanover,MD),並且根 據使用說明書操作使用。

染色體 DNA 的製備

將 K. pneumoniae CG43S3 以 LB 培養液培養 16 小時,離心去除上清 液,加入800 l lysis solution (200 mM NaCl, 20 mM EDTA,40 mM

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Tris-HCl,0.2% Triton X-100,5 mM DTT,80 g lysosome)後劇烈振盪,並在 37 ℃下作用 30 分鐘以打破菌體,之後在 Proteinase K 濃度為 0.1 mg/ml,溫度 50℃的水浴槽作用隔夜,此時需密封防止溶液蒸發。之後放置冰上 10 分鐘, 加入 250 l 飽和食鹽水,輕微搖晃,繼續放置冰上 10 分鐘後,以 16000 × g 離心 10 分鐘,取 400 l 上清液分別加入兩個 1.5 毫升離心管中,每管各加入 1000 l 絕對酒精輕輕翻轉 3 次,放置冰上 20 分鐘後,以 16000 × g 離心 15 分鐘,倒掉上清液,加入 75%酒精,16000 × g 離心 10 分鐘,在 37℃烘乾去 除多餘水分,在尚未完全乾燥前加入 50 l 二次水, 放置隔夜後即可使用或 繼續放置-20℃冰箱保存。 建構 pmrH 及 pmrF 突變株 利 用 pmrH01/pmrH03 和 pmrH02/pmrH04 以 及 pmrF01/pmrF03 和 pmrF02/pmrF04 四對引子從 K. pneumoniae CG43S3 以 PCR 的方式分別增殖 pmrH 及 pmrF 區域上下游兩段大約 1 kb 的片段,接著再分別將兩兩片段結

合,接入質體 pKAS46(suicide vector)(49),送入大腸桿菌 S17-1 pir (12) 中。將帶有建構好質體的大腸桿菌作隔夜培養,同時亦將 K. pneumoniae CG43S3 隔夜培養,分別取 1 ml 的隔夜培養液於 1 ml 新鮮的 LB 中,在 37℃ 培養 1 小時,再分別取 1 ml 的培養液於無菌的 1.5 毫升離心管中,以適當的

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轉速將菌體離心下來,使用無菌0.85% NaCl 重新懸浮細胞,重複至少兩次, 將洗淨的克雷白氏肺炎桿菌和帶有質體的大腸桿菌 S17-1pir 以 1:2 的比例 混合,再離心去除上清液,用 80 l 0.85% NaCl 重新懸浮,再把這 80 l 的 懸浮液小心滴在 LB 培養基上無菌的硝化纖維膜上,將培養基放於 37 ℃培養 箱中培養 12-16 小時,之後用滅過菌的夾子將纖維膜夾起放入 LB 培養液中, 將菌體振盪下來,吸取 1 ml 離心去除上清液後再用 0.85% NaCl 重新懸浮, 吸取 100 l,經系列稀釋後(1X,1/100X)塗於 M9 培養基中(含 Ap100、 Km25、0.2% glucose)。隨機挑選五顆單一菌落,分別培養於 4 ml 的 LB 中 12-16 小時後,吸取 1 ml 的菌液抽取菌體染色體 DNA,其餘的菌液則暫時保 存於 4 ℃中。用引子 pmrH01/pmrH02 及 pmrF01/pmrF02 進行 PCR 確認,任 選一株質體有成功進入菌體 DNA 的克雷白氏菌,吸取 100l 隔夜的菌液接 種於4 ml LB(含有 Sm500 )中置於 37℃振盪培養 8 小時,吸取 100 l 的菌 液,系列稀釋後(1X,1/100X,1/10000X)塗於 LB 培養基(含 Sm500), 用牙籤隨機挑選至少 50 個菌落,分別劃於含 Sm500 與 Ap100/Km25 的 LB 培 養基上,挑選對 streptomycin 有抗性但對 ampicillin/kanamycin 沒有抗性的菌 落,抽取染色體 DNA 後,進行 PCR 檢查,找尋只含有突變片段的菌落即為 突變株。

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建構互補株

利用引子 pmrAp03/pmrA06、phoP01/phoP02 和 ppmrF01/ppmrF02 從 K.

pneumoniae CG43S3 以 PCR 的方式分別增殖出包含核醣體結合位(ribosomal

binding site)的完整 pmrA、phoP 以及 pmrF 基因片段,分別接至 pRK415 質 體中,轉型(transform)至大腸桿菌 S17-1 pir 菌株,利用接合作用送入突 變株。 生長曲線測試 將隔夜培養的菌液加至新鮮含抗生素的 LB 培養液,調整濃度在 OD600 的吸光值約 0.1,並在 37℃培養箱振盪培養,每隔一小時測量 OD600的吸光 值。 啟動子活性測試 引子 pmrHp01/pmrHp02 從 K. pneumoniae 以 PCR 的方式增幅出 pmr 操 縱子假定啟動子片段,接至帶有 lacZ 報導基因的 pLacZ15 (34) 質體上,轉型 至大腸桿菌S17-1pir 菌株,利用接合作用送入 K. pneumoniae CG43S3Z01、 Z01pmrA 和 Z01phoP 菌株中。啟動子活性測試是根據 Miller 的方法(36)。 將隔夜培養的菌液加至新鮮含氯黴素(chloramphenicol)的 LB 培養液,直至

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OD600的吸光值約 0.4-0.6,取 100 l 菌液和 900l 的 Z buffer、17 l 0.1%的 SDS 以及 35 l 的氯仿(chloroform)混合並且在 30℃培養 20 分鐘。加入 200 l 4 mg/ml 的-nitrophenyl--galactopyranoside(ONPG)混合均勻,培養在 30℃直到出現黃色,最後加入 500l 1 M 的 Na2CO3終止反應,並測量OD420 的吸光值。 多黏菌素抗性測試 將隔夜培養的菌液取1 ml 至無菌的 1.5 毫升離心管,以 21130 × g 轉速 離心 5 分鐘,去除上清液,用 0.85% NaCl 重新懸浮細胞兩次,以 1:100 的 比例加到新鮮不含離子或含1 mM Fe3+的LB 培養液,在 37℃培養 3-4 小時, OD600的吸光值約 0.6,用 0.85% NaCl 重新懸浮細胞兩次,再以新鮮的 LB 培 養液系列稀釋至2 × 104 CFU/ml,取 100 l 加到 96 孔微滴定盤。加入等體積 配製好不同濃度的多黏菌素,使最後濃度為 2、4 units/ml(1 unit 為 0.1218 g),在 37℃振盪培養 1 小時。取 100l 的菌液直接塗於 LB 培養基培養 16 小時,隔天計算菌數。

(24)

細胞培養

測 試 細 胞 株 包 含 人 類 單 核 白 血 球 細 胞 株 THP-1 和 鼠 類 巨 噬 細 胞 RAW264.7(交大生科所袁俊傑老師實驗室)。THP-1 培養於 RPMI 1604 含

10% 胎牛血清、2 g/l 碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、4.5 g/l 葡萄糖、 1 mM 丙 酮 酸 鈉 ( sodium pyruvate ) 以 及 1 % 盤 尼 西 林 / 鏈 黴 素

(penicillin/streptomycin),而 RAW264.7 則以 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)含 10% 胎牛血清、3.2 g/l 碳酸氫鈉以及 1% 盤尼西林/鏈黴素 培養液培養,這兩株細胞株培養於 37℃含有 5% CO2的培養箱中。為了活化 THP-1 細胞吞噬活性,將 THP-1 細胞株培養於含 3 M/ml PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)的 RPMI 1640 培養液中,在 37℃含有 5% CO2的培養箱 中培養48 小時。 巨噬細胞存活率測試 將已活化的 THP-1 或 RAW264.7 細胞株分別種於 24 孔的培養盤中,培 養至約80% 滿(2 × 105 的細胞),用 PBS 洗二次,加入 1 ml 不含血清的培 養液,再加入約細胞數 30-40 倍的細菌,在 37℃含有 5% CO2的培養箱中培 養 2 小時,然後以 PBS 洗三次,加入 1 ml 的培養液(含 100 g/ml 的

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gentamicin)分別培養 4 和 8 小時,最後加入 0.1% 的 Triton X-100 混合 10 分 鐘後,取作用後的混和液作系列稀釋並塗盤以計算菌數。 反轉錄聚合酶鏈鎖反應(Reverse-transcription PCR) 將隔夜培養的 K. pneumoniae CG43S3 重新培養於含抗生素的新鮮 LB 培 養液中,到達 OD600吸光值約 0.6-0.7,離心去除上清液,用 200 l 10 mM 的 Tris 重新懸浮細胞,加入 20 l 10 mg/ml 的 lysozyme,在 37℃下培養半小 時。RNA 的抽取是用 High pure RNA isolation kit(Roche)按照說明書使用製 備。測量 RNA 的 OD260及 OD280的吸光值並計算濃度,OD260及 OD280的比值 要介於 1.6-2.1 之間。取 1g 的 RNA 加入 DNase(Promega)在 37℃作用 1 小時,之後再加入 DNase 終止反應溶液在 65℃作用 15 分鐘。用 23S RNA 引 子 PCR 確認 RNA 已經沒有 DNA 的殘留,再將剩餘的 RNA 利用反轉錄酶翻 轉 成 cDNA,反轉錄聚合酶鏈鎖反應是用 RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis kit(Fermentas)按照說明書操作使用。

轉位子誘導突變篩選測試

將隔夜培養的大腸桿菌S17-1 pir [pUT mini-Tn5 luxCDABE Km2](58)及

(26)

養 30 分鐘後,離心去除上清液,以等體積之 0.85% NaCl 洗去 LB 培養液, 將質體提供者與接受者以1 ml:0.5 ml 的比例混合後,濃縮成 0.1 ml 後,將 菌液平鋪在 LB 培養皿上的硝化纖維膜上,靜置 10 小時,取出硝化纖維膜, 將膜上細菌懸浮至新鮮 LB 培養液中,以表面塗有 X-gal 並添加抗生素的 LB 培養基篩選出抗 chloramphenicol 與 kanamycin 的 K. pneumoniae,挑選 X-gal 呈色反應不同的菌株。

轉位子插入位置分析

為了分析 pUT mini-Tn5 luxCDABE Km2 在染色體的插入位置,將製備 完成的染色體 DNA 以限制內切酶 PstI 作用隔夜。切碎的染色體基因片段藉 連 結 酶 (ligase )轉殖到 pUC19 , 轉 殖 後 的 產 物 藉 由 電 穿 孔 的 方 式 轉 型 (transform)到大腸桿菌 JM109 菌株,並以 kanamycin 抗生素篩選出含有抗 kanamycin 基因片段的質體。最後,以轉位子序列為引子確認轉位子插入位置 附近的序列。

(27)

結果

不同菌種間 pmr 操縱子的上游序列比較分析

利用 BPROM of Softberry(http://www.softberry.com/)分析克雷白氏肺 炎桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及鼠疫桿菌這四株菌種間的 pmr 操縱子上游 序列並確認-10 及-35 boxes。如圖一,在克雷白氏肺炎桿菌及鼠疫桿菌中都同 時擁有 PhoP 和 PmrA 兩個結合位,大腸桿菌及沙門氏菌只發現 PmrA 結合 位。 pmrH 和 pmrF 基因缺損株的建構 pmrH 為 pmr 操縱子的第一個基因,其轉譯蛋白在合成 L-Ara4N 的過程 主要負責轉胺作用;pmrF 為 pmr 操縱子的第二個基因,其轉譯蛋白在合成 L-Ara4N 的過程主要負責運送作用。為了建構 pmrH 和 pmrF 突變株,利用 PCR 的方式將目標基因上下游各 1 kb 的片段增殖並接到質體 pKAS46 (49), 命名為 pKAHm034 及 pKAFm034。接著,利用接合作用將質體送入克雷白氏 肺炎桿菌 CG43S3,經過同源互換後,在選擇性培養基上篩選突變菌株,挑 選可以在 Sm500 培養基生長而不在 Ap100/Km25 培養基生長的菌株,分別利 用引子 pmrH01/pmrH02 和 pmrF01/pmrF02,以 PCR 分析去確認所得到的突 變株。引子 pmrH01/pmrH02 在野生株 PCR 增殖的片段約為 3,183 bp,若

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pmrH 基因缺損,增殖片段約為 1,936 bp(圖二);引子 pmrF01/pmrF02 在野 生株PCR 增殖的片段約為 2,977 bp,若 pmrF 基因缺損,增殖片段約為 2,071 bp(圖三) pmrF 或 pmrH 基因缺損不會影響菌株生長 將隔夜培養的 K. pneumoniae CG43S3、pmrH 和 pmrF 突變株重新培養 於新鮮的 LB 培養液或外加高濃度鐵離子(1 mM Fe3+)、高濃度鎂離子(10 mM Mg2+)的LB 培養液,並且每隔一小時測量 OD600的吸光值。在任一生長 條件下,pmrH 或 pmrF 突變株和野生株的生長情形並無明顯差異(圖四)。 pmrH、pmrF 或 ugd 基因缺損會降低菌株對多黏菌素的抗性 PmrH 和 PmrF 主要功能分別為在合成 L-Ara4N 時進行轉胺及運送作 用;Ugd 則是能合成 L-Ara4N 的前驅物 UDP-glucuronic acid。為了確認 PmrHFIJKLM 及 Ugd 和多黏菌素抗性的關係,以多黏菌素抗性測試分析

pmrH、pmrF 以及 ugd 突變株。結果如圖五 A,pmrH、pmrF 或 ugd 突變株,

在濃度 2 units/ml 的多黏菌素環境下,存活率均有明顯下降,pmrF 突變株下 降的情形較 pmrH 為明顯,約只剩 20%的存活率;ugd 突變株的存活率幾乎

(29)

為零。pmrF 互補株可以回復菌株對多黏菌素的抗性,存活率可提高至約 80 %(圖五B)。

phoP、pmrA 和 pmrD 基因缺損會降低菌株對多黏菌素的抗性

PhoP 和 PmrA 已 被 報 導 能 調 控 和 多 黏 菌 素 抗 性 相 關 的 下 游 基 因

pmrHFIJKLM 的表現,而 PmrD 是一個能被 PhoP 活化進而促進 PmrA 表現的

連接蛋白(56),為了瞭解 PmrA、PhoP 以及 PmrD 和多黏菌素的抗性關係,分 別構築了 pmrA、phoP 和 pmrD 突變株。結果如圖六,在濃度 4 units/ml 的多 黏菌素環境下,pmrA、phoP 和 pmrD 三株突變株的抗性均有顯著下降,其中 phoP 突變株的抗性下降最為明顯,存活率和野生株相差約 30 倍。phoP、 pmrA 或 pmrD 互補株均能回復菌株對多黏菌素的抗性,其中 phoP 互補株回 復抗性的能力最顯著,抗性可比野生株高約4 倍。

phoP/pmrA 雙基因缺損的 phoP 互補株能較 pmrA 互補株有較高的多黏菌素抗

由於 PhoP 和 PmrA 對於 pmr 操縱子的調控上有不同程度的差別,為了 探討 PhoP 和 PmrA 在克雷白氏肺炎桿菌中對多黏菌素抗性上所扮演角色的重 要程度,進一步比較 phoP/pmrA 雙基因缺損株以 phoP 或 pmrA 互補株回補

(30)

時,分別對多黏菌素的抗性回復能力的影響。結果如圖七,在濃度 4 units/ml 的多黏菌素環境下,pmrA 互補株的抗性並無顯著提升,而 phoP 互補株則有 明顯提高,其回復抗性的能力比 pmrA 互補株高出約 4 倍。 pmrA 或 phoP 基因缺損會降低 PpmrH的活性 在多黏菌素抗性測試中,pmrA 或 phoP 基因缺損時,都會降低克雷白氏 肺炎桿菌對多黏菌素的抗性,因此進一步探討 PmrA 或 PhoP 是否藉由調控 pmr 操 縱 子 的 表 現 而 影 響 對 多 黏 菌 素 的 抗 性 。 首 先 , 利 用 引 子 pmrHp01/pmrHp02 將 pmr 操縱子的假定啟動子 PpmrH以 PCR 的方式增殖,再 將此片段接到帶有 lacZ 報導基因的質體 pLacZ15 (34) 上,此質體被命名為 pHY072,接著,將此質體送入到 K. pneumoniae CG43S3Z01 菌株後,在不同 生長條件下測量其啟動子活性。結果如圖八,當 PpmrH在高濃度鐵離子或低濃 度鎂離子的活化條件下,活性均能比在高濃度鎂離子的抑制條件下高,代表 PpmrH的表現可能受這兩個調控子的調控。進一步在 Z01pmrA 和 Z01phoP 菌株中測試 PpmrH的活性,結果顯示在兩株突變株中 PpmrH的活性表現均比野 生株低,而在 phoP 突變株中,PpmrH活性下降更為明顯,和野生株相差約 4 倍,此結果代表PhoP 可能在此調控模式中扮演著一個比較主要的角色。

(31)

pmrFpmrA 和 phoP 基因缺損會降低菌株在 THP-1 細胞株內的存活率 在細胞內含有許多陽離子性縮氨酸,能抵抗細菌的入侵,而陽離子性縮 氨酸的抑菌機制和多黏菌素類似(35)。因此,為了探討 pmrF、pmrA 及 phoP 這些和多黏菌素類陽離子性抗生素相關的基因,在細菌感染寄主時扮演的角 色,我們利用 THP-1 細胞株進行吞噬試驗,觀察這些菌株在被吞噬後的存活 率是否有差別。wza 是和莢膜多醣體生合成相關的基因,此基因缺損會使莢 膜多醣體的產量降低而利於吞噬(18),在此以 wza 基因缺損的突變株當作野 生株。結果如圖九,在吞噬後 0 小時,各菌株間的回收率均在 0.8% 上下, 代表野生株和突變株被吞噬的量差不多。在吞噬後 4 小時,pmrF、phoP 及 pmrA 突變株的回收率均較野生株低,其中 pmrF 突變株的回收率最低。在吞 噬後 8 小時,野生株和突變株的回收率均下降至一開始吞噬的量,之間並無 顯著差異。進一步測試 pmrF、phoP 及 pmrA 互補株在細胞內的存活率,在吞 噬後8 小時,三株互補株均能將存活率提高 1 倍以上。

pmrFpmrA 和 phoP 基因缺損會降低菌株在 RAW264.7 細胞株內的存活率 為了確認 pmrFpmrA 和 phoP 基因確實會影響克雷白氏菌在細胞內的

存活率,我們再利用另一株巨噬細胞株 RAW264.7 進行細菌存活率測試。結 果如圖十,在吞噬後的 4 小時,pmrFpmrA 和 phoP 突變株和 THP-1 結果一

(32)

樣均較野生株有較低的回收率,其中 pmrF 突變株的回收率也最低。另外由 結果也發現 RAW264.7 有較高的吞噬效果,可能是由於 THP-1 無法百分百的 分化成巨噬細胞所造成的差異。 pmrA、phoP 或 rcsB 基因缺損不會影響 Pugd-1的活性 在先前沙門氏菌的研究中,ugd 會同時受到 PmrA/PmrB、PhoP/PhoQ 及 RcsC/YojN/RcsB 三套雙分子系統的調控,為了瞭解 ugd 在克雷白氏肺炎桿菌 中是否也會受到PmrA、PhoP 及 RcsB 的調控,首先利用 BPROM of Softberry 分析Pugd-1序列並確認-10 和-35 boxes,結果只找到和抑制 N-acetylglucosamine

合成相關的 NagC 結合位(44),並未發現 PhoP、PmrA 或 RcsB 結合位(附錄 一)。同時,我們也利用引子 ugd03/ugd04 將 ugd 的假定啟動子 Pugd-1以 PCR

的方式增殖,再將增殖片段接到帶有 lacZ 報導基因的質體 pLacZ15 上,並命 名為 pHY069。接著,將此質體分別送入到 Z01、Z01pmrA、Z01phoP 及 Z01rcsB 菌株中。活性測試結果發現不論在 Z01、Z01pmrA、Z01phoP 或 Z01rcsB 菌株中,Pugd-1的活性都沒有明顯差異(圖十一)。

(33)

mamC-manB-ugd 為一操縱子 在 Pugd-1啟動子的測試中,並沒有找到確切的調控子,進一步分析已公 佈資料庫的克雷白氏肺炎桿菌的基因組(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),發 現 manC、manB 及 ugd 基因間的距離非常相近,並且轉錄的方向均相同(圖 十二 A)。因此,推測 manC-manB-ugd 可能為一操縱子,進一步利用 RT-PCR 的方法來證明。如圖十二 A 所示,431、443 和 510 bp 的 RT-PCR 產物分別 為 gnd-manC、manC-manB 和 manB-ugd 基因間的距離,以 RNA 為模板並未 得到任何 PCR 產物,而以 genomic DNA 及 cDNA 為模板均可得到此片段大 小的PCR 產物(圖十二 B),此結果證明 manC-manB-ugd 為一操縱子。

rcsB 基因缺損會降低 Pugd-2的活性

知道 manC-manB-ugd 為一操縱子後,我們推測 ugd 可能擁有第二個啟

動子 Pugd-2位於 manC 的上游非轉譯區(圖十二 A)。分析 Pugd-2序列,發現

一個假定 RcsB 結合位(14 個核甘酸序列 4 個配對錯誤)(附錄二)。因 此,進一步測試 Pugd-2的活性是否會受 PhoP、PmrA 或 RcsB 的影響。活性測

試的結果顯示 Pugd-2的活性只在 rcsB 突變株中才有明顯下降,約和野生株相

(34)

rcsB 基因缺損會輕微降低菌株對多黏菌素的抗性

在 Pugd-2的活性測試中,發現 RcsB 缺損會降低其活性表現,因此進一

步測試 rcsB 基因缺損對多黏菌素抗性的影響。結果如圖十三,在多黏菌素濃2、4 units/ml 的條件下,rcsB 突變株的存活率和野生株並無明顯差異,而

(35)

討論

雙分子訊息傳遞系統廣泛地存在於革蘭氏陽性和陰性菌中,能感應外界 訊息的變化使細菌做出適當反應以存活在不同的環境或寄主中。PmrA/PmrB 是一套已經被確定和多黏菌素抗性相關的雙分子系統(20),能調控下游 ugd 基因和 pmrHFIJKLM 基因組的表現,以合成 L-Ara4N 對 LPS 進行修飾(54, 62) 進而增加對多黏菌素的抗性。這樣的抗性機制在不同菌種有著不同的調控模 式。在沙門氏菌中,能藉由 PmrA/PmrB 直接調控 pmrHFIJKLM 基因組的表 現,或 PhoP/PhoQ 活化 PmrD 和 PmrA 作用後,間接去調控 pmrHFIJKLM; 在大腸桿菌中,主要只有 PmrA/PmrB 的直接調控(56);在鼠疫桿菌中, PmrA/PmrB 和 PhoP/PhoQ 均能直接調控 pmrHFIJKLM (57)。

在克雷白氏肺炎桿菌中,根據 pmr 操縱子的上游序列分析結果,發現 了兩個 PhoP 以及一個 PmrA 結合位(圖一),同時,克雷白氏菌還擁有 PmrD 同源蛋白。因此,我們推測不同於上述三種類型,在克雷白氏肺炎桿 菌中對於 pmr 操縱子的調控方式,可能為第四種類型,除了 PmrA/PmrB 直接PhoP/PhoQ 間接的調控外,PhoP/PhoQ 亦可以直接調控 pmr 操縱子。 我們首先在抗性分析上證實了 PmrHFIJKLM 確實負責多黏菌素的抗 性,所建構的 pmrH 和 pmrF 兩株突變株對多黏菌素的抗性均較野生株低,其 中 pmrF 突變株的抗性又較 pmrH 突變株低(圖五 A),這可能是因為在合成

(36)

L-Ara4N 的機轉上,PmrH 主要功能為轉胺作用,而 PmrF 則負責將中間產物 運送到內膜上進一步作修飾(8),PmrF 在整個合成機轉上可能扮演著一個比 較關鍵的角色。 進一步測試 pmrHFIJKLM 的上游調控子 PhoP、PmrA 及之間的連接蛋PmrD 對多黏菌素的抗性,結果顯示不論 phoP、pmrA 或 pmrD 基因缺損均 會造成抗性降低,而 phoP 突變株抗性降低的情形最為明顯(圖六 A);在互 補株試驗中,phoP、pmrA 及 pmrD 互補株均能回復對多黏菌素的抗性,其中 phoP 互補株回復抗性的能力為最高(圖六 B),此也凸顯了 PhoP 在多黏菌 素抗性上的重要性。進一步在 phoP/pmrA 基因缺損株下分別回補 phoP 或 pmrA 互補株,比較抗性回復的能力,發現只有 phoP 互補株能將抗性有效回 復,而 pmrA 效果則較不明顯(圖七)。綜合以上以及根據 pmr 操縱子上游 序列分析所發現的兩個 PhoP 和一個 PmrA 結合位的結果,顯示 PhoP 在克雷 白氏肺炎桿菌中對多黏菌素的抗性上可能扮演著一個比較主要的角色,一旦 phoP 基因缺損就會使得整個抗性陡降,即使在菌內過度表現 PmrA,能回復 的抗性也很有限,因此在克雷白氏肺炎桿菌中 PhoP 在 pmr 操縱子調控上的 重要性較PmrA 高。 在啟動子活性測試中,我們證實了 PhoP 和 PmrA 對於 pmr 操縱子的調 控關係。PpmrH在低濃度鎂離子及高濃度鐵離子的條件下均有較高的活性(圖

(37)

B),進一步在 phoP 及 pmrA 突變株下測試,PpmrH的活性均有明顯降低

(圖八 C),而在 PhoP 缺損下降低的情形更為明顯,證實 PpmrH確實會受到

PhoP 及 PmrA 的調控,此也符合多黏菌素抗性測試的結果。在最近的研究 中,利用 DNase footprinting 實驗證實在克雷白氏肺炎桿菌中 PhoP 能直接調 控 pmr 操縱子,因此除了先前已知 PhoP 間接及 PmrA 直接的調控外,克雷白 氏肺炎桿菌還擁有 PhoP 的直接調控,此調控模式被命名為 FCL(feedforward connector loop) (37) ,證實在克雷白氏肺炎桿菌中對於 pmr 操縱子的調控方 式不同於前述的三種類型,而是第四種類型-FCL。 ugd 為另一個影響多黏菌素抗性的重要基因,它的產物 UDP-glucuronic acid 是合成 L-Ara4N 的前驅物(18, 38),因此在對多黏菌素的抗性上也扮演著 一個重要的角色。當 ugd 基因缺損時,克雷白氏菌對濃度 2 units/ml 的多黏菌 素幾乎沒有抗性(圖五 A),濃度要低於 1 units/ml 以下才可觀察到存活率 (附錄三),報導指出 ugd 在克雷白氏菌中影響的層面除了 LPS 外,還包括 也和多黏菌素的抗性相關的 CPS (31),因此 ugd 一旦不活化就會使得克雷白 氏菌對多黏菌素的抗性幾乎降至為零。 在先前沙門氏菌報導中指出 ugd 基因的上游序列含有 PhoP、PmrA 及 RcsB 的結合位並且會受到 PhoP/PhoQ、PmrA/PmrB 和 RcsC/YojN/RcsB 這三 套雙分子系統調控(38),但在克雷白氏肺炎桿菌 ugd 的啟動子 Pugd-1序列分析

(38)

中並沒有發現到 PhoP、PmrA 或 RcsB 結合位(附錄一),進一步在三株突變

株下測試 Pugd-1的活性也沒有明顯差異(圖十一),此結果和在沙門氏菌中的

發現並不相同;利用生物資訊的方法分析克雷白氏肺炎桿菌中 ugd 及上下游 基因的組成,發現 ugd 和上游的 manC 以及 manB 彼此基因間的距離很相近, 並且有相同的轉錄方向(圖十二 A),推測有可能為一操縱子,我們利用 RT-PCR 的方法證明了 manC-manB-ugd 確實為一操縱子(圖十二 B),暗示

ugd 可能還擁有另一個啟動子 Pugd-2位於 manC 的上游非轉譯區。分析 Pugd-2

列,發現一個 RcsB 結合位(附錄二),推測此結合位可能會受到 RcsB 的調 控而影響到 Pugd-2的活性表現。測試 Pugd-2的活性表現,發現只在 rcsB 基因缺

損的情形下活性才有明顯下降(圖十二 C),但 RcsB 是否會直接調控 Pugd-2

的活性表現則需再進一步的實驗證明。進一步測試 RcsB 和多黏菌素的抗性 關係,發現 rcsB 基因缺損相對於野生株只會稍微降低菌株對多黏菌素的抗性 (圖十三)。RcsB(regulation of capsule synthesis)被報導主要和莢膜多醣體 的合成有關(55),當其缺損時雖然會降低莢膜多醣體的產量,但此降低的情 形可能不足以對克雷白氏菌在多黏菌素的抗性上造成很大的影響。另一方 面,雖然在 rcsB 基因缺損會降低 Pugd-2的活性,但 RcsB 實際對 Pugd-2表現的

(39)

最後,我們利用細胞吞噬試驗來探討這些基因是否能幫助細菌增加在感 染寄主時的存活率;由於在細胞內含有一些陽離子性縮氨酸能幫助增加免疫 反應,這些陽離子性縮氨酸的抑菌機制大致和多黏菌素相似(35),我們使用 的巨噬細胞株為免疫反應上的第一道防線,主要負責將侵入物吞噬後進行溶 解並呈現抗原及分泌一些刺激因子促進後續的免疫反應,因此細菌在受到巨 噬細胞吞噬後,可能主要還是受到陽離子性縮氨酸的毒殺。在我們的結果中 顯示,pmrF、phoP 及 pmrA 突變株在 THP-1 和 RAW264.7 吞噬後均比野生株 有較低的存活率(圖九、圖十),但此降低的情形不是很明顯,這可能是由 於我們拿來當作野生株的 wza 基因缺損株本身就會影響細菌對陽離子性抗生 素的抗性,使得我們是在抗性已經降低的情形下去比較 pmrF、phoP 及 pmrA 基因缺損所造的影響,導致差異效果不明顯,但是,這些和陽離子性抗生素 抗性相關的基因 pmrHFIJLMpmrA 及 phoP 缺損時確實較不利於細菌在細胞

內存活。目前雖然沒有證據可以證明此存活率降低的情形主要是由細胞內的 陽離子縮氨酸所造成的,但可以證明 pmrHFIJLMpmrA 及 phoP 基因缺損的

突變株是比較無法抵抗細胞的毒殺作用。

另外,之前實驗室的研究發現嗜中性白血球對於細菌的吞噬並不會受到 莢膜多醣體的干擾,因此就可去除 wza 基因缺損的影響,但取得嗜中性白血

(40)

球的方法須藉由抽取人體血液再進行分離或是誘導 HL-60 細胞株分化,但此 兩種方法所得到的嗜中性白血球數量均有限,不符我們試驗需求。

在 克 雷 白 氏 肺 炎 桿 菌 對 多 黏 菌 素 的 抗 性 調 控 中 , 我 們 證 實 了 PmrHFIJKLM 及 Ugd 確實和多黏菌素的抗性相關,而 PhoP 和 PmA 則主要調 控整個抗性機制。克雷白氏菌對於 pmr 操縱子的調控不同於沙門氏菌、大腸 桿菌以及鼠疫桿菌而擁有三條調控路徑,包括(i)低濃度鎂離子下,PhoP-PmrD-PmrA 的間接調控以及(ii)高濃度鐵離子下,PmrA 的直接調控,近來 的研究也證明(iii)PhoP 能直接調控 pmr 操縱子。這三條不同的調控路徑也 凸顯了 PhoP 對於克雷白氏菌在多黏菌素抗性上的重要性;另一部分,克雷白 氏菌對於 ugd 的調控也不同於沙門氏菌受到 PhoP、PmA 或 RcsB 的調控,雖 然我們所建構的啟動子 Pugd-2會受到 rcsB 缺損的影響,但其調控的方式為何 則還需進一步的證明。最後,我們以細胞內存活率的方法,證實這些和陽離 子抗生素抗性相關的 PmrHFIJKLM、PhoP 及 PmA 確實能幫助細菌提高在感 染細胞時的存活率。

(41)

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(51)

表一、本實驗所使用的菌株基因型

Strain Genotype or relevant property Reference or source E.coli: JM109 S17-1pir K.pneumoniae: CG43 CG43S3 CG43S3-Z01 CG43S3-Z01pmrA CG43S3-Z01phoP CG43S3-Z01rcsB CG43S3ugd CG43S3pmrH CG43S3pmrF CG43S3pmrA CG43S3phoP CG43S3pmrD CG43S3pmrA/phoP

RecA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 rolA1 thiΔ(lac-proAB)

Tpr Smr recA, thi, pro, hsdR

M+ [RP4-2-Tc::Mu:Kmr Tn7]( pir ) K2 serotype rspL mutant,Smr lacZ mutant in CG43S3 pmrA mutant in CG43S3-Z01 phoP mutant in CG43S3-Z01 rcsB mutant in CG43S3-Z01 ugd mutant in CG43S3 pmrH mutant in CG43S3 pmrF mutant in CG43S3 pmrA mutant in CG43S3 phoP mutant in CG43S3 pmrD mutant in CG43S3 pmrA/phoP mutant in CG43S3 Laboratory stock (12) (43) (43) (34) This study This study Laboratory stock Laboratory stock This study This study This study Laboratory stock Laboratory stock This study

(52)

CG43S3wza/pmrF CG43S3wza/pmrA CG43S3wza/phoP

wza and pmrF mutant in CG43S3 wza and pmrA mutant in CG43S3 wza and phoP mutant in CG43S3

This study This study This study

(53)

表二、本實驗所使用的質體構築表

Plasmid Relevant characteristic Reference or source

yT&A pLacZ15 pKAS46 pRK415 pYTHm034 pKAHm034 pYTFm034 pKAFm034 pKAS46-wza -pHY006 PCR cloning vector, Apr

A derivative of pYC016, containing a promoterless lacZ from K.pneumoniae CG43S3 as the reporter, Cmr

Suicide vector, rspL, Apr, Kmr

Broad-host-range IncP cloning vector, Tcr

946-bp and 984-bp PCR product of the region upstream and downstream of pmrH cloned into yT&A

XbaI/SacI digested fragment of pYTHm034 cloned into pKAS46

1034-bp and 1037-bp PCR product of the region upstream and downstream of pmrF cloned into yT&A

EcoRI/XbaI digested fragment of pYTFm034 cloned into pKAS46

A 2.0-kb fragment containing a 500-bp deletion in wza locus cloned into pKAS46, A 2.0-kb fragment containing a 700-bp deletion in phoP locus cloned into pKAS46

Yeastern Biotech Co. (34) (49) (4) This study This study This study This study Laboratory stock Laboratory stock

(54)

pHY025 pHY029 pHY034 pFcYT pFcRK pAcYT pAcRK pPcYT pPcRK pHY069 pHY072 pHY123 porf162Y porf162Z15

A 2.0-kb fragment containing a 660-bp deletion in pmrA locus cloned into pKAS46 A 2.0-kb fragment containing a 500-bp deletion in pmrD locus cloned into pKAS46 A 2.0-kb fragment containing a 1100-bp deletion in ugd locus cloned into pKAS46 1277-bp PCR product carrying pmrF cloned into yT&A

HindIII/BamHI digested fragment of pFcYT cloned into pRK415

1105-bp PCR product carrying pmrA cloned into yT&A

HindIII/XbaI digested fragment of pAcYT cloned into pRK415

900-bp PCR product carrying phoP cloned into yT&A

BamHI/EcoRI digested fragment of pPcYT cloned into pRK415

BamHI/BglII digested fragment of 253-bp PCR product amplified by primer sets

ugd03/ugd04 cloned into the BamHI site of pLacZ15

BamHI/BglII digested fragment of 477-bp PCR product amplified by primer sets

pmrHp01/pmrHp02 cloned into the BamHI site of pLacZ15 1181-bp PCR product carrying rcsB cloned into pRK415

A 400-bp PCR product of cps porf16-17 promoter region cloned into yT&A A BglII fragment of porf162Ycloned into the BamHI site of pLacZ15

Laboratory stock Laboratory stock Laboratory stock This study This study This study This study This study This study Laboratory stock Laboratory stock Laboratory stock Laboratory stock Laboratory stock

(55)

表三、本實驗所使用的引子序列

a

,restriction enzyme site Primer Sequence pmrAp03 pmrA06 pmrH01 pmrH02 pmrH03 pmrH04 pmrF01 pmrF02 pmrF03 pmrF04 phoP01 phoP02 ppmrF01 ppmrF02 ugd03 ugd04 pmrHp01 pmrHp02 WzaD1 WzaD4 5’-CAA,TTG,GAT,CaCA,GGG,CTG,TAC-3’ 5’-GAG,CCA,TGGa,TCT,ATT,CCG,TG-3’ 5’-TGA,TTC,AGC,AGT,AGT,TCG,CCA,GCC-3’ 5’-AAC,AGC,ACG,GCG,AAG,AGC,ATA,AAC,A-3’ 5’-GTC,ACG,AAA,AAG,AGA,ACA,GGA,ACG,C-3’ 5’-AAA,TAT,TAC,CGC,GAG,CGC,TTC,CCT-3’ 5’-ATG,CGA,TTG,CCG,TCA,GTT,CAG,C-3’ 5’-AGG,CGC,TCG,GTC,AGG,TGG,TTA,C-3’ 5’-GGG,ATA,ACC,ACC,GAG,ACC,TTC-3’ 5’-GGA,AAC,GGC,ATC,TAA,AGA,GGA,A-3’ 5’-CGC,TCG,CCG,TTC,GGA,TCCa,TG-3’ 5’-GCA,ACG,GTA,CCaT,TCA,TCA,GCG,C-3’ 5'-GAT,GGA,AAA,GCT,GAA,GGC,GAT,GG-3' 5'-CAG,CGA,TATa,CAT,ACC,CGG,CGT,C-3' 5’-GCA,GGA,TCCa,ATA,ATG,GAA,GC-3’ 5’-CGA,GAT,CTaA,GGG,CCA,CCA,C-3’ 5’-TCT,GGA,TCCa,TGG,TCA,TTA,ATT,GCC,CGG,C-3’ 5’-CTT,AGA,TCTa,CGC,TCA,TCA,TCA,TCC,TGT,TC-3’ 5’-TTT,CTA,TGG,GCA,GAT,GGT,TG-3’ 5’-GCT,GAC,TAT,CGG,GAA,GCA,TC-3’

(56)

圖一、不同菌種間 pmr 操縱子上游序列比較分析

比較克雷白氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌及鼠疫桿菌間的 pmr 操縱子上游序 列,並標示-10 box 和-35 box,PhoP 結合位以空心方塊表示,PmrA 結合位以 實心方塊表示。

(57)

(A) (B) 圖二、PCR 分析確認 pmrH 突變株 (A)pmrH 及上下游基因組成示意圖。引子 pmrH01/pmrH02 是用來確 pmrH 基因缺損。(B)利用引子 pmrH01/pmrH02 進行 PCR 分析確認 pmrH 基因缺 損。質體 pKAHm034 包含 pmrH 基因上下游序列以進行同源互換產生 pmrH 突變株。M:DNA 大小標準溶液,lane 1:K. pneumoniae CG43S3,lane 2: pKAHm034,lane 3:K. pneumoniae CG43S3pmrH。 1.0 3.0 2.5 2.0

2

3

1.5

1 2 3

M

kb

(58)

(A) (B) 圖三、PCR 分析確認 pmrF 突變株 (A)pmrF 及上下游基因組成示意圖。引子 pmrF01/pmrF02 是用來確認 pmrF 基因缺損。(B)利用引子 pmrF01/pmrF02 進行 PCR 分析確認 pmrF 基因缺 損。質體 pKAFm034 包含 pmrF 基因上下游序列以進行同源互換產生 pmrF 突變株。M:DNA 大小標準溶液,lane 1:K. pneumoniae CG43S3,lane 2: pKAFm034,lane 3:K. pneumoniae CG43S3pmrF。 3.0 2.5 2.0

1

2

3

1.5 1.0

M

kb

(59)

圖四、K. pneumoniae CG43S3、CG43S3pmrH和CG43S3pmrF 生長曲線圖

將隔夜培養的菌液以1:100 比例更新培養於 LB、LB+1 mM Fe3+及LB+10 mM Mg2+離子,在 37℃下振

(60)

(A)

數據

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參考文獻

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