血管內皮細胞發炎反應的細胞與分子機制─在發炎物刺激下血管內皮細胞中剪流所扮演之保護角色: 剪流對干擾素引發Stat1訊息傳導及相關基因表現之調控(1/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

在發炎物刺激下血管內皮細胞中剪流所扮演之保護角色:

剪流對干擾素引發 Stat1 訊息傳導及相關基因表現之調控

(1/3)

中 華 民 國 94 年 6 月 2 日

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

□ 成 果 報 告

■期中進度報告

血管內皮細胞發炎反應的細胞與分子機制--

在發炎物刺激下血管內皮細胞中剪流所扮演之保護角色:

剪流對干擾素引發 Stat1 訊息傳導及相關基因表現之調控(1/3)

Protective role of shear flow in inflammatory agent-stimulated vascular

endothelial cells: Regulation of interferon-induced Stat1 signaling and

related gene expression by shear flow

計畫類別：□ 個別型計畫 ■ 整合型計畫

計畫編號：

NSC93-2321-B-002-034

執行期間：93 年 8 月 1 日至 94 年 10 月 31 日

計畫主持人：

謝學真

計畫參與人員：

蔡宇致、吳畹儀、謝玠揚

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本成果報告包括以下應繳交之附件：

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□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

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處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、

列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：

國立台灣大學 化學工程學系暨研究所

中 華 民 國 94 年 5 月 31 日

國科會專題研究計畫期中進度報告

血管內皮細胞發炎反應的細胞與分子機制--

在發炎物刺激下血管內皮細胞中剪流所扮演之保護角色:

剪流對干擾素引發 Stat1 訊息傳導及相關基因表現之調控(1/3)

Protective role of shear flow in inflammatory agent-stimulated vascular endothelial

cells: Regulation of interferon-induced Stat1 signaling and related gene

expression by shear flow

計畫編號：NSC93-2321-B-002-034 執行期間：93 年 8 月 1 日至 94 年 10 月 31 日 計畫主持人：謝學真 教授 計畫參與人員：蔡宇致、吳畹儀、謝玠揚 執行單位：國立台灣大學 化學工程學系暨研究所 一、摘要 血管壁的內皮細胞(ECs)持續受到血 液流動所產生的剪力刺激，穩定的剪力能保 護內皮細胞並抑制發炎反應相關的基因表 現。本研究探討在發炎反應中重要的細胞素 interferon-gamma (IFN-γ) 刺激下，剪力是否 對內皮細胞具有保護效果。採用牛的動脈內 皮細胞(BAEC)和人的臍帶靜脈內皮細胞 (HUVEC)為實驗對象，觀察內皮細胞受到 剪力(25 dyn/cm2 )作用時，細胞中訊息調控 及 基 因表 現 的改 變。以 細 胞素 IFNγ (2.5 ng/ml) 刺 激 內 皮 細 胞 會 活 化 JAK1/2 及 STAT1，造成 JAK1/2 及 STAT1 的酪氨酸 (Tyr 701)、絲氨酸(Ser727)磷酸化增加。Tyr 701 磷酸化在 30 分鐘達到最高點，而 Ser727 磷酸化在 30 分鐘後才開始明顯上升。以不 同濃度的 IFNγ刺激內皮細胞 30 分鐘，Tyr 701、Ser727 磷酸化程度會隨著 IFNγ濃度的 增加而上升。然而，剪力會部分抑制 IFNγ 所引發的 JAK1/2 及 Tyr 701 磷酸化，隨著 剪力施予的時間增加，抑制的效果也越明 顯。而隨著剪力大小的增加，抑制 IFNγ引 發的 Tyr 701 磷酸化，其效果也越明顯，但 並不會影響 Ser727 磷酸化的程度。由於 IFNγ透過活化 STAT1，可引發內皮細胞中 化學趨化蛋白 IP-10 的表現，本研究後續將 探討剪力對 IFNγ所引發的下游基因(包括 IP-10 等)表現之影響。綜合上述，剪力可藉 抑制發炎反應中重要的細胞素 IFNγ所引發

的 JAK1/2 及 STAT1 Tyr701 磷酸化，進而 對內皮細胞產生保護效果。

關鍵詞：剪力、內皮細胞、細胞素、化學趨 化蛋白。

Abstract

Endothelial cells (ECs) are constantly exposed to blood flow-induced shear stress. Laminar shear stress protects ECs from endothelial dysfunction. In the present study, the effect of shear stress (SS) on IFNγ-induced responses including STAT1 and JAK1/2 phosphorylation in ECs was examined. SS had no effect on Tyr701 and Ser727 phosphorylation of STAT1 in ECs under basal condition. Further, IFNγ triggered the activation of JAK/STAT1 signaling pathway with the phosphorylation of JAK1/2 and phosphorylation of Tyr701 and Ser727 in STAT1. Under

IFNγ treatment, Tyr-701 phosphorylation

approached the highest level at 30 minutes and Ser-727 phosphorylation obviously rised after 30

minutes. IFNγ induced Tyr-701 and Ser-727

phosphorylation in a dose-dependent manner, which Tyr-701 and Ser-727 phosphorylation

approached their highest levels with IFNγ

concentration of 2.5 ng/ml. When SS was applied to IFNγ-treated ECs, it significantly inhibited the IFNγ-induced Tyr701 phosphorylation of STAT1 in a shear force- and time course-dependent manner whiles Ser727 phosphorylation was

unaffected. IFNγ, through STAT1 signaling pathway, induced downstream chemokine IP-10 expression. Whether SS affects IFNγ-induced downstream target gene expressions will be examined in the future study. To sum up, our results demonstrated that SS attenuates IFNγ-induced JAK1/2 and STAT1 activation that will provide a protective effect on ECs during inflammatory response.

Keywords: shear stress, endothelial cells,

cytokine, chemokine. 二、計畫緣由與目的 許多研究指出動脈粥狀硬化與血流動 力學有關，本人之前的研究發現穩定的層流 會導致內皮細胞 ROS 的增加，此外，層流 也會抑制 MCP-1 基因的表現而有保護效果 [1]。然而在身體血管內的轉彎分支處往往 是粥狀斑塊容易堆積的地方，而此處的血液 流動較為緩慢或伴隨著擾流的發生。動脈粥 狀硬化是一種慢性疾病，從初期的內皮細胞 功能異常發展到形成粥狀班塊進而導致血 栓，發炎反應在整個惡化的過程扮演相當重 要 的 角 色 ， 亦 有 研 究 發 現 有 些 細 胞 素 如 IFN-γ、TNF-α、IL-6，這些物質會刺激內 皮 細 胞 ， 誘 導 發 炎 相 關 基 因 的 表 現 如 MHC-II、IP-10、MCP-1，驅使血小板與白 血球更易黏著於內皮細胞層[2]。另一方 面，細胞素也會引發內皮細胞中的訊息傳 導，IFN-γ 和 IL-6 分別會活化 JAK/Stat1 及 JAK/Stat3 訊 息 傳 導 路 徑 [3] ， 轉 錄 因 子 Stat1、Stat3 可調控細胞中之發炎反應、生 長及死亡[4,5]。相關的研究指出，剪流可抑 制 內 皮 細 胞 中 由 血 清 或 IL-6 誘 導 的 JAK/Stat3 活化[6,7]。根據這些發現，我們 欲探討剪力在發炎反應中所扮演的調控角 色。 三、實驗方法 3.1 細胞株與細胞培養 本 實 驗 採 用 的 細 胞 為 bovine aortic endothelial cells（BAEC），以 DMEM (含 10％FBS、penicillin、streptomycin)培養。 從 臍 帶 初 級 培 養 取 下 的 human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)，以 M199 (含

20％FBS、penicillin、streptomycin)培養， 並置於於 37℃、5％CO2含飽和濕度的培養 箱中。繼代培養時，以緩衝液洗過，再用 1X trypsin-EDTA 將細胞取下，離心收集， 移去上清液，加入上述培養基使細胞懸浮分 散，再接種到附有 gelatin 的玻片上。 3.2 剪流實驗 將 培 養 細 胞 的 培 養 基 裝 入 玻 璃 瓶 內 層，並且通入含 5%CO2的空氣，以保持培養 基之 pH 值為 7.4。外層以恆溫水流通，保 持溫度為 37℃。開啟轉動式幫浦（roller pump），輸送培養基至波動調節器（pulse dampener） 以消除流體的脈動，並且阻止 氣泡進入流動室。待調節器內液面達適當高 度時，將調節器平放。此時培養基便經由塑 膠管流回瓶中，而成為一循環狀態之流動系 統。整個系統以恆溫水域槽控溫，保持流動 系統溫度為 37℃。將長滿單層細胞的玻璃 片裝置在設計好之平行板流動室（parallel plate flow chamber），連接上流動管路，調 節幫浦轉速至所需流量後，在恆溫下開始流 動實驗。 3.3 細 胞 內 蛋 白 質 含 量 測 定 ( 西 方 墨 點 Western blot) 經實驗處理後的細胞以 cord buffer 清洗 過之後，吸乾殘留之液體，加入 lysis buffer (RIPA buffer，with proteinase inhibitor、0.1% SDS)，充分溶解細胞後，將 sample 離心取 上清液。以 BCA 蛋白質定量液於 530 nm 之 吸光值來計算總細胞之蛋白質含量。取同量 之蛋白質並調成同體積，加入還原劑，於 95℃ 加 熱 五 分 鐘 ， 之 後 以 8~10 % polyacrylamide gel 進行電泳約二到三個小 時，取出凝膠，將蛋白質轉移到 nitrocellulose 膜片上。然後以含 5%脫脂奶粉及 0.2% Tween-20 的 TBS 溶液(TBS-T)浸泡膜片一 小時，然後依序再以欲定量之單株或多株抗 體浸泡搖晃二小時，然後再以 TBS-T 洗三 次，每次五分鐘，倒掉 TBS-T 後加入含二 次抗體之 TBS-T 浸泡搖晃一小時，然後以 TBS-T 洗三 次， 每次 五分鐘 ，最 後則以 Western-Star Chemiluminescence Detection System 來 測 量 其 強 度 ， 使 用 CDP-Star chemiluminescence substrate 當受質。

3.4 萃取細胞 RNA 與 Northern blot： 經實驗處理後的細胞以 cord buffer 清 洗 過 之 後 ， 吸 乾 殘 留 之 液 體 ， 加 入 4M guanidine thiocyanate 溶 液 溶 解 細 胞 ， 以 phenol-chloroform 有機溶液萃取細胞中之 total RNA，再以酒精沈澱的方式分離出 RNA，並且溶於 DEPC 處理過的 H2O 中。

由細胞中所分離出之 RNA (10 µg/lane) 將

以 1 % MOPS-formaldehyde agarose gel，在 1 x MOPS 溶液中進行電泳 (100 V) 約 2.5 小時，以 vacuum bloting 方式將 gel 上之 RNA 轉移到 nylon membrane 膜片上，並以 UV 光交聯使 RNA 固定在膜片上。將膜片 浸泡在預雜交溶液中(42℃) 16~20 小時，再

將膜片與32

P-labeled IP-10 cDNA probe 雜交 (42℃) 24 小時，雜交完之膜片在室溫下以 wash buffer (1x SSC，1% SDS) 清洗 2~3 次，每次 30 分鐘，清洗完的膜片置於-70℃， 以 x-ray film 感光 2~3 天。 四、實驗結果與討論 4.1 剪 力 不 影 響 內 皮 細 胞 在 基 礎 狀 態 下 STAT1 的活性 STAT1 是一種可被 IFNγ引發的細胞內 重要的訊息轉錄因子，與細胞的生長，凋亡 和 發 炎 反 應 有 關 ， STAT1 的 Tyr701 及 Ser727 磷酸化程度與其活性有關，本研究首 先要探討剪力是否會影響 STAT1 的活化狀 態。如 Fig. 1 所示，實驗發現對未受細胞素 (cytokine) 刺 激 的 內 皮 細 胞 施 予 剪 力 (25 dyn/cm2)之情況下，並不會引起 STAT1 酪 氨酸(Tyr 701)的磷酸化，也不會改變 STAT1 絲氨酸(Ser727)已有的磷酸化。以 2.5 ng/ml IFNγ刺激內皮細胞 30 分鐘後，可以看到 Tyr 701 及 Ser727 磷酸化增加。同時並觀察剪力 對 ERK1/2 及 Akt 之調控，剪力刺激會造成 ERK1/2 磷酸化在 10 分鐘達到最高點，並在 兩小時後回到基礎狀態下的磷酸化程度，同 時並觀察到 Akt 受到剪力的刺激之後也會 產生短時間的磷酸化增加，ERK1/2 及 Akt 的結果與其他報導所觀察到的現象一致。 4.2 IFNγ刺激內皮細胞中 STAT1 之活化 當內皮細胞受到細胞素的影響後，會產 生一連串的訊息傳導過程以調控下游的基 因，引發內皮細胞異常並導致發炎反應， IFNγ是由 T cell 所釋放出來的一種干擾素， 會活化 JAK/STAT1 的訊息傳導路徑，活化 的 STAT1 會與其目標 DNA 結合並促進目 標基因的轉錄，最後導致目標基因的表現。 如 Fig. 2A 所示，本實驗以細胞素 IFNγ (2.5 ng/ml)刺激內皮細胞，IFNγ會活化 STAT1，

造成 STAT1 的 Tyr 701、Ser727 磷酸化增

加，加入 IFNγ刺激內皮細胞之後，Tyr 701 磷酸化在 5 分鐘就開始上升，並在 30 分鐘 達到最高點，而 Ser727 磷酸化在 30 分鐘後 才開始明顯上升。如 Fig. 2B 所示，以不同 濃度的 IFNγ刺激內皮細胞 30 分鐘，Tyr 701、Ser727 磷酸化程度會隨著 IFNγ濃度的 增加而上升，在 2.5 ng/ml 高濃度 IFNγ的刺 激之下，Tyr 701、Ser727 磷酸化程度達到 最高。 4.3 剪力會抑制由 IFNγ所引發的 JAK1/2 及 STAT1 Tyr 701 磷酸化 已有許多報導說明剪力對內皮細胞具 有保護效果[ ]，本研究欲觀察剪力對受到發 炎反應因子 IFNγ刺激的內皮細胞是否同樣 具有保護作用。如 Fig. 3A 所示，對臍帶靜 脈 內 皮 細 胞 (HUVEC) 施予剪力，會抑制 IFNγ所引發的 Tyr 701 磷酸化，在預處理 2.5 ng/ml IFNγ 10 分鐘之後，再繼續施予剪力 (25 dyn/cm2) 10 或 20 分鐘，與靜止狀態下 加入 IFNγ的細胞相比，有施予剪力的內皮 細胞其 Tyr 701 磷酸化會被抑制，隨著剪力 施予的時間增加，抑制的效果也越明顯。如 Fig. 3B 所示，由 IFNγ所引發的 Tyr 701 磷 酸化，隨著剪力大小的增加，抑制效果也越 明顯，施予 5 dyn/cm2_{大小的剪力並不影響} Tyr 701 磷酸化程度，當施予 12.5 dyn/cm2 剪力，Tyr 701 磷酸化會有比較明顯的抑制 效果，增加剪力大小到 25 dyn/cm2_時，抑制 效果最明顯，與 IFNγ所引發的 Tyr 701 磷 酸化程度相比，約可抑制 50%，另一方面， 剪力並不會對 Ser727 磷酸化有影響。而在 牛的動脈內皮細胞(BAEC)也可以看到剪力 的保護效果，如 Fig. 4 所示，剪力也同樣會

並且也抑制 IFNγ所引發的 JAK1/2 磷酸化。 由上述實驗可以證明剪力對於兩種來源不 同的內皮細胞，都具有抑制 JAK/STAT1 訊 息傳導活化的效果。 4.4 IFNγ透過活化 STAT1，引發內皮細胞 中化學趨化蛋白 IP-10 的表現 IFN-γ會引發內皮細胞中 MHCII、CXC chemokines 基因的表現，這些基因也都透過 JAK/STAT1 訊息傳導路徑的調控，其表現 出之蛋白則會刺激內皮細胞導致後續的發 炎反應。本研究欲探討 CXC chemokines 對 內皮細胞的影響， CXC chemokine 家族中 包括 IP-10、Mig、I-TAC 這三種，已有報導 指出在動脈硬化的斑塊表面，內皮細胞會表 現大量的 CXC chemokine 並且會吸引許多 活化的 T cell 沾黏到班塊表面並轉移到斑塊 的組織裡面，並在此處放出許多細胞素，擴 大發炎反應[8]。如 Fig. 5 所示，IFNγ (2.5 ng/ml)會刺激內皮細胞，使 IP-10 mRNA 的 表現量隨刺激時間增長而上升，在刺激 4 小時後達到最高點。由之前所得的結果，證 實剪力會抑制 IFNγ所引發的 JAK/STAT1 訊 息傳導路徑，未來我們將探討，剪力是否同 樣會抑制 IFNγ所引發的下游目標基因群表 現，如 MHCII、CXC chemokines，以達到 保護內皮細胞免於細胞素刺激的效果。 五、結論 1. 以發炎反應中重要的細胞素 IFNγ刺激 內 皮 細 胞 會 造 成 STAT1 Tyr701 及 Ser727 磷酸化上升，引發 STAT1 之活 化。 2. 剪 力 作 用 可 抑 制 由 IFNγ所 引 發 的 JAK1/2 及 STAT1 Tyr 701 磷酸化，因 而血管中血液流動所產生的剪力可以 保護內皮細胞，緩和細胞素刺激所引發 的後續發炎反應。 3. IFNγ的刺激會引起內皮細胞表現 CXC chemokines，吸引活化的 T cells 沾黏到 內皮細胞表面，導致動脈硬化斑塊區域 的發炎反應，因此我們將進一步欲探討 剪力是否會抑制 CXC chemokines(例 如：IP-10 等)的表現。 六、參考文獻

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[8] Mach F, Sauty A, Iarossi AS, Sukhova GK, Neote K, Libby P, Luster AD, “Differential

expression of three T lymphocyte-activating CXC chemokines by human atheroma-associated cells”, J.

七、圖表

Fig. 1 Shear stress (SS) does not affect the basal STAT1 Tyr 701 and Ser727 phosphorylation in HUVECs. HUVECs were in static condition or

exposed to SS (25 dyn/cm2) for 10, 30, 60, 120 minutes. ECs were stimulated by IFNγ (2.5 ng/ml) for 30 minutes as positive controls. Arrows indicate STAT1α and STAT1β.

Fig. 2 IFNγ stimulates STAT1 tyrosine and serine phosphorylation. A, IFNγ induced Tyr 701 and Ser727 phosphorylation of STAT1 in a time-dependent manner. HUVECs were treated with IFNγ (2.5 ng/ml) for 5, 10, 30, 50, 120 minutes. B, IFNγ induced tyrosine and serine phosphorylation of STAT1 in a concentration-dependent manner. ECs were treated with IFNγ at the indicated concentration for 30 minutes.

Fig. 3 Shear stress (SS) suppresses IFNγ-induced STAT1 Tyr701 phosphorylation in HUVECs. SS suppresses IFNγ-induced STAT1 Tyr701 phosphorylation in a time- and force-dependent manner. A, HUVECs pretreated with IFNγ (2.5 ng/ml) for 10 min were either maintained static or exposed to following SS (25 dyn/cm2) in medium containing IFNγ for an additional 10 or 20 minutes. After stimulation, cell lysates were subjected to western blot analysis and the Tyr701 phosphorylation was examed. The intensity of Tyr701 phosphorylation was normalized to the level of STAT1α and is presented as mean ± SE of three independent experiments. * P < 0.05 vs. respective IFNγ-treated ECs under static conditions. B, HUVECs pretreated with 2.5 ng/ml IFNγ for 10 min were maintained static or exposed to SS in medium containing IFNγ for 20 minutes with increasing shear stress as indicated, and the Tyr701 and Ser727 phosphorylation of STAT1 was examined. STAT1 phosphorylation was normalized to the level of STAT1 and is presented as mean ± SE of three independent experiments. * P < 0.05 vs. respective IFNγ-treated ECs under static conditions. #P < 0.05 vs. ECs under SS of 5 dyn/cm2. +P < 0.05 vs. ECs under SS of 12.5

A B 0 10 20 30 0 25 50 75 100 125 150 IFNγ IFNγ + SS pT y r-S TA T1 α /S TA T1 α R e lative In te n s ity (% ) 10 Time (min) 20 IFNγ SS * *

A

dyn/cm2.

Fig. 4 Shear stress (SS) suppresses IFNγ-induced JAK/STAT1 activation in BAECs. SS suppresses

IFNγ-induced JAK/STAT1 tyrosine phosphorylation in a time- dependent manner. BAECs pretreated with IFNγ (0.5 ng/ml) for 30 min were either maintained static or exposed to following SS (25 dyn/cm2) in medium containing IFNγ for an additional 10 or 20 minutes.

Fig. 5 IFNγ induces IP-10 expression in HUVECs.

Time course study of IFNγ-induced IP-10 mRNA levels. HUVECs were in static condition or treated with IFNγ (2.5 ng/ml) for 1, 2, 3, 4, or 6 hours.