台灣地區外來種亞洲錦蛙族群來源與生態研究

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(1)附錄一：微棲地利用調查表鳳山水庫不同蛙種生態區位利用情形. 日期. 氣候. 陸域編號. 蛙種. 個數. 水域. 行為離燈距離. 柏油路. 草地. 樹上林下草地. 土壤. 01 02 03 04 05. 39. 林下土壤. 斜坡. 離水距離. 覆蓋物遮蔽度. 沉澱物厚度. 水深.

(2) 趾骨切片標本製作步驟： i、. 將採回趾骨固定於福馬林(formalin)中，保存。. ii、以 3%硝酸進行趾骨脫鈣，以震盪器搖晃 12 小時。 iii、脫鈣後，立刻浸泡清水，同樣以震盪器搖晃 12 小時。 iv、完成脫鈣的趾骨，可保存於福馬林或酒精中，等待切片。 v、切片。利用冷凍切片機，以 OCT 將趾骨固定於切片台上，以鋼刀切片，厚度約為 20µm。 vi、將切下的薄片標本沾黏於玻片上，以 Erich’s haematoxylin 染色半小時。 vii、半小時後以清水退染。並將染色完成之趾骨切片以甘油 1:1 水溶液包埋，封片準備觀察。在顯微鏡下觀察每片骨片生長停滯環(lines of arrested growth, LAGs)各數，以此判斷個體年齡。生長停滯環一般認為出現在個體蟄伏渡冬或渡過乾季，一年一環，可用以判斷年齡。. 40.

(3) 附錄三：亞洲錦蛙 DNA 萃取純化流程： 1. 取 0.5mL 左右的組織樣本，至於 1.5mL 微量離心管(micro centrifuge tube)。 2.. 加入含 0.5 mg/ml 蛋白酶(Kproteinase K)之 300 µl 緩衝液(digestion buffer)。. 3.. 置於 55 ℃定溫加熱器上，靜置隔夜。. 4.. 分解完後加入 600 µl 氯仿(chloroform)以及 5M 鋰鹽(LiCl) 300 µl，均勻搖晃 30 分鐘。. 5.. 而後進行 4℃低溫離心，以 14,000rpm 離心 15 分鐘，抽取上清液約 500 µl 至新微量離心管。. 6.. 加入 95%冰酒精(alcohol) 1,200 µl，至於-20℃冰箱中冰 20 分鐘。. 7.. 再次進行 4℃低溫離心，以 14,000rpm 離心 15 分鐘，倒去上清液。. 8.. 加入 70%酒精(alcohol) 200 µl，輕彈離心管使沉澱物懸浮。. 9.. 4℃低溫離心，以 14,000rpm 離心 3 分鐘，去上清液，並晾乾。. 10. 加入 200 µl 滅菌二次水，至 4℃冰箱保存半天，換至-20℃冰箱保存。緩衝液配方 100 mM NaCl 10 mM Tris, pH 7.6. TE: 10mM Tris, pH 7.6 1mM EDTA, pH 8.0. 25 mM EDTA, pH 8.0 0.5% SDS. 41.

(4) 附錄四：PCR 反應溫度條件設定溫度. 時間. 重複次數. Cycle 1. 94℃. 1:00. 1x. Cycle 2. 94℃. 1:00. 45℃ 72℃. 1:30 1:30. 94℃. 1:00. 50℃ 72℃. 1:30 1:30. 72℃. 1:00 ∞. Cycle 3. Cycle 4. 4℃ Cycle 5 PCR 反應體積 20 µl. 42. 5x. 35 x 1x.

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