利用原子力顯微鏡探討細菌細胞壁結構的破壞
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(2) 摘要 大腸桿菌受到紫外光照射後，菌體形貌會產生變化，且隨著照射強度增加， 菌體形貌的變化也會增加，利用原子力顯微鏡在生物樣品量測的優勢，來了解為 什麼菌體會有如此變化。細胞壁是主要維持細胞形貌的因素，而組成細胞壁的結 構分別是肽聚醣層與脂多醣層，所以探究肽聚醣層與脂多醣層是否遭受紫外光照 射而破壞，是本研究的重點。 本研究利用原子力顯微鏡，在大氣環境下測得，大腸桿菌產生的吸附力做功 會隨著照射紫外光的能量提升而下降，這表示維持吸附力的脂多醣層的確受到紫 外光照射而破壞 在液態環境下測得，大腸桿菌的有效彈性常數與楊氏模數經由 紫外光照射後會下降，利用楊氏模數下降這可以證明紫外光照射，也會產生肽聚 醣的破壞。 使用恆定力輕敲式掃描模式系統進行實驗，利用其在液態環境優異的解析度， 讓我們在液態環境更精準的量測，實驗結果，其吸附力與楊氏模數的下降，與傳 統原子力顯微鏡的結果相同。 使用表面增強拉曼光譜進行實驗，可以發現受紫外光照射的大腸桿菌有許多 來自於 DNA 的訊號，未照射紫外光的大腸桿菌則沒有 DNA 的訊號，這表示， 細胞壁的確受到了損害。. 關鍵字：大腸桿菌、原子力顯微鏡、力與距離曲線、有效彈性常數、楊氏模數、 紫外光、脂多醣層、肽聚醣層、細胞壁、表面增強拉曼光譜 i.
(3) 目錄 Chapter1. 緒論............................................................................................................ 1. Chapter2. 樣品製備.................................................................................................... 2. 2.1 微生物 .................................................................................................................... 2 2.1.1 微生物的定義與分類 ...................................................................................... 2 2.1.2 大腸桿菌 ............................................................................................................ 3 2.1.3 細胞壁 ................................................................................................................ 3 2.1.4 生長曲線 ............................................................................................................ 4 2.1.5 紫外光殺菌 ....................................................................................................... 6 2.2 大腸桿菌的製備 ................................................................................................... 6 2.2.1 Luria-Bertani (LB)與青黴素的製備.............................................................. 6 2.2.2 大腸桿菌的培養 ............................................................................................... 7 2.3 基板的製作 ............................................................................................................ 8 2.4 紫外光照射與樣品的製作 .................................................................................. 8 Chapter3. 原子力顯微鏡............................................................................................ 9. 3.1 原子力顯微鏡基本原理與操作模式 ................................................................ 9 3.2 力與距離的曲線 ................................................................................................. 11 3.2.1 有效彈性常數的計算 .................................................................................... 15 3.2.2 楊氏模數的計算 ............................................................................................. 17 3.2.3 吸附力所作的功 ............................................................................................. 17 3.3 靜電力顯微鏡 ..................................................................................................... 18 3.4 原子力顯微鏡在生物方面的應用 ................................................................... 19 3.5 實驗操作過程 ..................................................................................................... 20 3.5.1 原子力顯微鏡操作過程 ................................................................................ 20 3.5.2 利用原子力顯微鏡取得力與距離的曲線 ................................................. 24 3.5.3 靜電力顯微鏡 ................................................................................................. 25 ii.
(4) 3.6 靜電力顯微鏡實驗結果 .................................................................................... 26 3.7 吸附力作功實驗結果 ........................................................................................ 29 3.7.1 毛細現象 .......................................................................................................... 29 3.7.2 水接觸角的量測與驗證 ................................................................................ 30 3.8 大氣環境中的有效彈性常數 ........................................................................... 32 3.9 液態環境中的有效彈性常數與楊氏模數...................................................... 34 Chapter4. 恆定力輕敲式掃描模式.......................................................................... 37. 4.1 基本原理 .............................................................................................................. 37 4.2 實驗操作過程 ..................................................................................................... 40 4.3 楊氏模數變化 ..................................................................................................... 44 4.4 吸附力變化 .......................................................................................................... 45 4.5 與傳統原子力顯微鏡比較 ................................................................................ 46 Chapter5. 表面增強拉曼.......................................................................................... 48. 5.1 拉曼光譜 .............................................................................................................. 48 5.2 表面增強拉曼光譜 ............................................................................................. 48 5.3 樣品製作 .............................................................................................................. 49 5.4 實驗操作過程 ..................................................................................................... 50 5.5 實驗結果與分析 ................................................................................................. 51 Chapter6. 結論與未來展望...................................................................................... 54. 參考資料...................................................................................................................... 55. iii.
(5) 圖目錄 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 1.1 正常大腸桿菌與照射紫外光 120 分鐘的大腸桿菌形貌比較........................ 1 2.1 大腸桿菌細胞分裂示意圖................................................................................ 5 2.2 大腸桿菌生長曲線示意圖................................................................................ 5 2.3 吸光度與濁度的測定示意圖............................................................................ 7 3.1 原子力顯微鏡構造圖........................................................................................ 9 3.2 探針懸臂曲折使得四象限二極體上雷射光點的偏移.................................. 10 3.3 探針與樣品距離與作用力關係圖.................................................................. 10 3.4 不同操作模式與掃描相同樣品的結果示意圖.............................................. 11 3.5 力與距離曲線和探針逼近樣品探針曲折示意圖.......................................... 12. 圖 3.6 力與距離曲線各部分資訊圖.......................................................................... 12 圖 3.7 進針曲線不同區域的分析.............................................................................. 13 圖 3.8 跳接與跳離示意圖.......................................................................................... 14 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 3.9 毛細現象與水橋示意圖.................................................................................. 14 3.10 探針與大腸桿菌假想彈簧的關係圖............................................................ 15 3.11 堅硬基板與軟樣品的進針曲線比較 ............................................................ 16 3.12 樣品凹陷深度示意圖.................................................................................... 16 3.13 探針與細胞凹陷深度示意圖........................................................................ 17 3.14 吸附力作功示意圖........................................................................................ 18 3.15EFM 成像示意圖 ........................................................................................... 18 3.16 探針與基板模擬示意圖................................................................................ 19. 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 3.17AFM 操作頭與控制系統 ............................................................................... 20 3.18 操作用電腦.................................................................................................... 20 3.19 探針外形示意圖 .......................................................................................... 21 3.20 探針與探針座................................................................................................ 21 3.21 操作頭的旋鈕................................................................................................ 21 3.22 雷射擊中懸臂所形成的繞射條紋................................................................ 21 3.23 雷射光點未在中心........................................................................................ 22 3.24 雷射光點已在中心........................................................................................ 22 3.25 共振頻率圖.................................................................................................... 22 3.26 液態專用探針座............................................................................................ 23. 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 3.27 液態環境雷射路徑示意圖............................................................................ 23 3.28Curves 模式下各功能介紹 ............................................................................ 24 3.29EFM 專用樣品座與固定樣品示意圖 ........................................................... 25 3.30 參數設定配置圖............................................................................................ 25 3.31 儀器線路配置圖............................................................................................ 26 3.32 照射紫外光前後的大腸桿菌的表面形貌.................................................... 26 iv.
(6) 圖 3.33 未照射紫外光大腸桿菌施加不同偏壓的 EFM 圖譜 ................................. 27 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 3.34 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌施加不同偏壓的 EFM 圖譜 ....... 27 3.35 施加不同偏壓，電荷分布狀況示意圖........................................................ 27 3.36 靜電力最低點偏移示意圖............................................................................ 28 3.37 基板與未照射紫外光後的大腸桿菌，施加不同偏壓，探針偏移變化圖 28 3.38 基板與照射紫外光後的大腸桿菌，施加不同偏壓，探針偏移變化圖.... 28 3.39 為吸附力與照射強度關係圖........................................................................ 29 3.40 為脫離長度與照射強度關係圖.................................................................... 29 3.41 吸附力做功與紫外光照射強度關係圖........................................................ 30 3.42 真空過濾法配置簡圖.................................................................................... 31 3.43 真空過濾法儀器配置圖................................................................................ 31. 圖 3.44 大腸桿菌與照射能量為紫外光大腸桿菌的水接觸角的量測.................... 32 圖 3.45 有效彈性常數與照射時間關係圖................................................................ 33 圖 3.46 膨壓與滲透壓示意圖.................................................................................... 33 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 3.47 在大氣環境與液態環境所觀測大腸桿菌形貌的差異................................ 34 3.48 液態環境中基板與大腸桿菌進針曲線的比較............................................ 34 3.49 液態環境下大腸桿菌凹陷程度圖................................................................ 35 3.50 下壓菌體位置差異示意圖............................................................................ 35 3.51 未照射紫外光大腸桿菌有效彈性常數分佈圖............................................ 36 3.52 照射紫外光強度 17.2 J cm2 大腸桿菌有效彈性常數分佈圖 ................... 36 3.53 未照射紫外光大腸桿菌楊氏模數分布圖.................................................... 36 3.54 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌楊氏模數分布圖 ......................... 36. 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 4.1 探針驅動與時間變化關係圖.......................................................................... 37 4.2 高度圖所對應的吸附力、吸附力做攻、壓縮程度與 Sneddon 模數圖譜.. 38 4.3 DMT 模型示意圖 .............................................................................................. 39 4.4 Sneddon 模型示意圖 ......................................................................................... 39 4.5 操作用電腦...................................................................................................... 40 4.6 控制系統.......................................................................................................... 40 4.7 AFM 儀器本體與光學顯微鏡 ........................................................................ 40 4.8 探針外形示意圖.............................................................................................. 41 4.9 探針座.............................................................................................................. 41 4.10 控制頭俯視圖與各控制旋鈕........................................................................ 41. 圖 圖 圖 圖 圖 圖. 4.11 雷射光路徑示意圖 ........................................................................................ 42 4.12 儀器下方顯示器............................................................................................ 42 4.13 探針靈敏度力曲線圖.................................................................................... 42 4.14 探針偏折與電壓對應關係............................................................................ 42 4.15 探針共振頻率擬合圖.................................................................................... 43 4.16 未照射紫外光大腸桿菌楊氏模數分佈圖.................................................... 44 v.
(7) 圖 4.17 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌楊氏模數分佈圖 ......................... 44 圖 4.16 未照射紫外光大腸桿菌兩日實驗楊氏模數分佈圖.................................... 44 圖 4.19 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌兩日實驗楊氏模數分佈圖 ......... 44 圖 4.20 未照射紫外光大腸桿菌吸附力分佈圖........................................................ 45 圖 4.21 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌吸附力分佈圖 ............................. 45 圖 4.20 未照射紫外光大腸桿菌兩日實驗吸附力分佈圖........................................ 45 圖 4.23 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌兩日實驗吸附力分佈圖 ............. 45 圖 4.24 在大氣環境與液態環境，受紫外光照射之大腸桿菌 3D 比較圖 ............. 46 圖 4.25 探針下壓至肽聚醣層示意圖........................................................................ 47 圖 4.26 脂多醣層與吸附力做功的關係圖................................................................ 47 圖 5.1 六角最密堆積與聚苯乙烯小球舉離示意圖.................................................. 49 圖 5.2 去除聚苯乙烯小球前後拉曼訊號比較.......................................................... 49 圖 5.3 江海邦老師實驗室所使用的共焦拉曼顯微鏡.............................................. 50 圖 5.4 舉離後聚苯乙烯小球分布與掃描範圍示意圖.............................................. 50 圖 圖 圖 圖. 5.5 未照射紫外光大腸桿菌拉曼訊號.................................................................. 51 5.6 照射紫外光強度 8.64 J cm2 大腸桿菌拉曼訊號 ......................................... 51 5.7 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌拉曼訊號 ....................................... 52 5.8 各強度拉曼訊號統計圖.................................................................................. 52. vi.
(8) 表目錄 表 表 表 表. 2.1 真細菌、古細菌與真核生物的比較 ............................................................... 2 3.1 大腸桿菌表面水接觸角比較 ......................................................................... 31 4.1 蒲松比與楊氏模數關係表 ............................................................................. 39 5.1 大腸桿菌拉曼訊號 ......................................................................................... 53. vii.
(9) Chapter1 緒論 在人們的生活環境存在了各種危害人們的病菌，可以引發疾病的生物稱為病 原體，病原體包含了細菌、真菌、病毒等等，細菌正是最主要的病原體之一，所 以人們找出了許多消滅病原體的方法。 消滅病原體的方法有很多種，例如直接破壞細菌的生殖能力，或者是破壞細 菌的表面，使得細菌裂解死亡等等，不過，有許多殺菌的方式，對於詳細的衰亡 原因，人們還是不太了解。 2010 年，本實驗室的楊黃捷學長為了了解細菌的衰亡機制，使用了大腸桿 菌進行了紫外光殺菌的研究[1]，研究中指出，大腸桿菌遭受紫外光照射後死亡， 利用原子力顯微鏡進行觀測，發現了表面形貌會產生改變，菌體的兩端隆起且中 間凹陷(圖 1.1)，這是相當特別的變化，統計數據後發現，隨著照射紫外光時間 越長，細胞峰值越高且塌陷程度也越深，也對於這種現象相當的感興趣。 對於生物樣品觀測有極佳優勢的原子力顯微鏡，有著許多方法可以了解細菌 變化的因素，將利用靜電力顯微鏡，力與距離曲線的量測，藉由觀察有效彈性常 數、楊氏模數與吸附力作功的變化，來探討維持細胞外形的細胞壁結構的改變。 另一方面，利用拉曼光譜對於分子結構研究的優勢，探討細菌照射紫外光前後的 差異，這也更加確定了細胞壁的破壞與改變。 利用這些方法，將可以對於細胞結構的變化有更深入了解。這也對於各種不 同的殺菌方法與其細胞的衰亡機制有著相當大的幫助。. 圖 1.1 正常大腸桿菌與照射紫外光 120 分鐘的大腸桿菌形貌比較. 1.
(10) Chapter2 樣品製備 2.1 微生物 2.1.1. 微生物的定義與分類. 微生物(Microorganism)為單一細胞或群聚，以細胞為基礎，可以自行完成生 命功能之微小生物，稱為“微生物”。其構造簡單，體積甚小，用顯微鏡就可見之 生物。為單細胞，或細胞聚落。且內部構造未分化。 三域系統(three-domain system)是 Carl Woese 於 1977 年所提出的生物分類， 分別是真細菌域(bacteria domain)、古細菌域(archaea domain)與真核生物域 (eukarya domain)，是以核醣體 16S ribosomal RNA、168 ribosomal RNA 序列的差 異其分類，新的分類的分類地位高於界。 一般所稱的細菌也就是真細菌，通常真細菌與古細菌沒有真正細胞核，只有 原核細胞結構，沒有細胞內膜，沒有細胞核膜，但是依舊有遺傳基因，通常 DNA 會伴隨些許核糖體與蛋白質以游離的方式存在於細胞質內。真細菌的細胞膜是具 有酯鍵結(ester bonding)的脂雙層(lipid bilayer)，古細菌則是具有醚鍵結(ether bonding)的脂雙層。真細菌、古細菌與真核生物的植物、真菌、藻類和原核生物 都具有細胞壁，各自含的主要成分也都不同，只有動物細胞不具有細胞壁，通常 原核生物細胞內含有高滲透壓，細胞壁主要是用來抵抗滲透壓，使細胞不被撐破。 關於真細菌、古細菌與真核生物的比較如表 2.1 所示。. 特徵. 真細菌. 古細菌. 真核生物. 原核細胞結構. 是. 是. 否. 細胞核. 無. 無. 有. 細胞膜. 酯鍵結的脂雙層. 醚鍵結的脂雙層. 酯鍵結的脂雙層. 細胞壁. 有. 有. 有(動物細胞例外). 細胞壁主要成分. 肽聚糖. 假肽聚醣、多醣、. 纖維素、葡聚醣、. 醣蛋白、蛋白. 甘露聚醣、幾丁質. 表 2.1 真細菌、古細菌與真核生物的比較. 2.
(11) 2.1.2. 大腸桿菌[5][6][7]. 細菌細胞由細胞壁(cell wall)，細胞膜(cell membrane)，類核區(nucleoid)和細 胞質(cytoplasm)等所構成，在細胞質內有核糖體等構造，這些幾乎是所有細菌都 具有的結構，稱為細菌的基本結構。有些結構者是某些細菌才有，例如有些細胞 在細胞壁外有鞭毛（flagellum）、纖毛(fimbriae)、纖毛(pilus)、莢膜(capsule)或 黏液層(slime layer)。在細胞質內有內膜，氣泡等。又依外型區分為球菌(cocci)， 桿菌(bacilli)，弧菌(vibrio)，螺旋菌(spirilla)，及螺旋體等(spirochetes)等。 一位丹麥醫生 Hans Christian Gram 於 1884 年發明革蘭氏染色法(Gram staining)，利用細菌細胞壁上的主要成份不同，使用這種染色法，可將細菌分成 兩大類，即革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria)與革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)。 大腸桿菌的學名為 Escherichia coli，通常簡寫爲 E. coli，其屬名埃希氏菌 (Escherichia)是由德國細菌學家 Theodor Escherich 所發現。主要寄生於人和動物 腸道中，約占腸道菌中的 1%。是一種兩端鈍圓、能運動、無芽孢的革蘭氏陰性 短桿菌。大腸桿菌經常作爲細菌的模式生物廣泛用於科學研究。. 2.1.3. 細胞壁. 革蘭氏陰性菌細胞壁的結構，是由 2~7 nm 厚的肽聚醣(peptidoglycan)層、 7~8 nm 厚的外膜以及 1~46 nm 長的脂多醣(lipopolysaccharide or LPS)所組成。 肽聚糖的骨架主要是由 N-乙醯葡糖胺（GlcNAc）和 N-乙醯胞壁酸（MurNAc） 交替相連而形成的多糖鏈，這些鏈相互交聯形成肽聚糖。從每個 N-乙醯胞壁酸 引出一條寡肽鏈，與相鄰多糖鏈上的 N-乙醯胞壁酸相連，組成了堅固的網狀結 構[37]，肽聚醣層可以幫助細菌抵抗滲透造成的內壓。溶菌酶就是破壞 N-乙醯葡 糖胺與 N-乙醯胞壁酸間的鏈結，使肽聚醣骨架破壞，進而引起細胞裂解。 脂多醣是由脂質 A(lipid A)、核心多醣(core polysaccharide)和 O 側鏈(O side chain)所組成。是細胞壁最外層的物質，可以防止疏水性的分子入侵，保護細菌 膜受到攻擊，並維持細胞的完整性。乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid or EDTA)會使脂多醣解體，肽聚醣就會暴露出來，使得細菌容易受到溶菌酶水 解。. 3.
(12) 2.1.4. 生長曲線[8][9]. 通常細菌使是用二分裂法(binary fission)進行繁殖(圖 2.1)，二分裂法為無性 生殖，單一細胞形成新的橫隔膜或壁(septum)，再分裂成兩個細胞。也就是說由 一個細胞經由分裂形成兩個相同的子細胞，每個子細胞在分裂，又各自產生兩個 子細胞。如此類推，每分裂一次為一個世代(generation)，一個世代所需的時間就 是世代時間(generation time)，不過單一的菌體的質量與體積變化，不容易觀測， 所以通常是以微生物的群體作為研究對象。 將微生物放置於一個封閉空間，給予固定的培養液進行批次培養，在培養的 過程，因為沒有新的培養液供給，養分的濃度也隨之減少，每隔一段時間取樣計 算菌數。若以時間為橫軸，菌數為縱軸，就可以得出微生物的生長曲線(圖 2.2)， 曲線主要分為四個區域。 (1) 遲緩期(Lag phase) 當微生物被接種到新鮮培養基後，通常並不會立即分裂、繁殖，生長速率近於零， 細胞數目幾乎保持不變，這段時間稱為遲緩期或停滯期。遲緩期是細胞分裂開始 之前的適應和調整期，而不是生長的休眠或停留期。遲緩期之細胞具有許多的特 徵，包括細胞代謝旺盛，體積增大，能快速吸收各種營養物質。 (2) 指數期(Exponential phase) 指數期又稱為對數期(log phase)，由於這一段時間細菌細胞數目的增加以幾何級 數進行，故稱為對數期，此時期細胞分裂速度最快，世代時間最短，細胞代謝活 動旺盛且穩定，酶的活性也高，並且細胞內核糖體等組成成分也像細胞數目一樣， 以同樣的對數生長率增加，細胞合成核糖體及蛋白質越多，其生長速度也越快。 這時期的細胞是用來做研究最理想的材料。 (3) 穩定期(Station phase) 如果對數期的細胞分裂不受節制而持續進行、理論上一世代時間約為二十分鐘， 然而事實上這種情況並未發生，因在一個密閉的系統中的分批培養，微生物的對 數生長期只能維持一個短暫的時間而已，終究會使生長降低，世代時間延長，細 胞活力衰退而進入穩定期，又稱為平衡期。此時群體中細菌繁殖的細胞數目與死 亡的細胞數目相等，總數量達最大值，活菌數保持恆定。 (4) 死亡期(Death phase) 於穩定期一段時間後，細胞的死亡率逐漸增加，最後群體中活的細胞數目將以對 數速率急據下降，此階段稱為死亡期。死亡期活細胞數目之減少，鏡檢時可發現 細胞內顆粒狀物質增多，伴隨著細胞的分解或自身溶解。. 4.
(13) 圖 2.1 大腸桿菌細胞分裂示意圖 (圖片來源：維基百科). 圖 2.2 大腸桿菌生長曲線示意圖. 5.
(14) 2.1.5. 紫外光殺菌[10]. 自 1801 年紫外光被發現以來，經過長時間的研究，已証實紫外光具有極良 好的消毒殺菌作用，紫外光消毒燈已被廣泛的運用於醫用，是傳染性病毒消毒殺 菌的最好方法。 遠紫外光(UVC)對於為害人體的細菌、病毒、微生物等，都有著強大的摧毀 作用。其殺菌原理是微生物經由遠紫外線照射，直接破壞其結構內的 DNA 及 RNA，使得構成該微生物體的蛋白質無法形成，立即死亡或喪失繁殖能力。一 般經遠紫外光照射 1~2 秒鐘內就可達到滅菌的效果。 近紫外光(UVA)的殺菌原理與遠紫外光的殺菌原理不太相同，微生物經由近 紫外光照射後，會誘發色胺酸(tryptophan)裂解產生有毒的光物質，光物質將會與 近紫外光共同作用，破壞結構內的 DNA，以達到殺菌的效果。. 2.2 大腸桿菌的製備 2.2.1. Luria-Bertani (LB)與青黴素的製備. LB 是 Giuseppe Bertani 所發明的，是微生物實驗最常用的培養基，用於培養 大腸桿菌等細菌，每 25g 的 LB Broth Miller 中含有 10g 的胰蛋白腖(tryptone)、5 g 的酵母菌萃取物(yeast extract)和 10g 的氯化鈉(sodium chloride)。液態 LB 配製的 過程為，量取 5g 的 LB Broth Miller 至容積為 250 mL 的血清瓶中，加入二次去 離子水至 200 mL，高溫高壓滅菌後放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限大約為六 個月左右。另外，也可以加入瓊脂(agar)使其成為固態的培養基，可以用來計數 與菌種的保存。 氨苄青黴素(ampicillin)是一種抗生素，能滲透革蘭氏陽性菌及部分革蘭氏陰 性菌，阻礙細菌合成細胞壁的第三和最終階段，造成細胞裂解死亡。在培養基加 入抗生素的原因，是用來去除不必要的微生物，有利於所需微生物的生長。氨苄 青黴素的配置過程為，量取保存在 4℃冷藏櫃中的氨苄青黴素粉末 0.5g 至容積為 15 mL 的離心管中，加入 5mL 95%的酒精與 5mL 的二次去離子水，接著放在振 盪機上攪拌直到氨苄青黴素完全溶解為止。將所配得的溶液倒入前端套有 0.2 μm 過濾篩的針筒內，分批倒入容積為 1.5mL 的離心管後，放入－20℃的冷凍櫃保 存。. 6.
(15) 2.2.2. 大腸桿菌的培養. 本實驗使用的大腸桿菌是由台大管永恕老師所提供的大腸桿菌 TOP 10，其 內含有質體 pBluescript II SK(+/-)，帶有能抵抗氨苄青黴素的基因。 首先取保存在 4℃冷藏櫃中的菌源，在無菌操作台內操作，利用火烤消毒過 後的 tip 沾取菌液，利用平板劃線法(streak plate method)在固態 LB 上劃線，放入 振盪培養箱，在 37℃的環境下隔夜培養，在固態 LB 上會形成線狀的菌落。培養 後的菌落若日後還需使用，可放入 4℃的冷藏櫃保存，保存期限大約為一個月左 右。 由於實驗必須取生長曲線中對數期的細菌，所以要在實驗前一天培養所需的 菌種。取 5mL 的 LB 液至容積為 15mL 的試管中，加入 5μL 的氨苄青黴素，在 無菌操作台內操作，用火烤消毒過後的 tip 挑起前述所培養的菌落後連同 tip 一 起放入試管內，放入振盪培養箱，在 37℃、200 轉的環境下隔夜培養即完成。 大量培養菌液，取前述所培養好的菌種 1mL 至容積為 125mL 的錐形瓶中， 加入 49mL 的 LB 液與 50μL 的氨苄青黴素，接著放入振盪培養箱，在 37℃、200 轉的環境下培養 3~4 個小時即可得到生長曲線中對數期的菌液。 通常可以利用濁度(turbidity)來估算細菌數，因為光照射至細胞上會產生散 射(圖 2.3)[19]，且細胞個體的大小幾乎一致，所以光散射的程度會與細胞濃度成 正比。吸光度(absorbance)的定義 A log10 ( I 0 I ) ，I o 為入射光強，I 為出射光強。 又稱光密度(optical density 簡稱 OD 值)，得到 OD 值 0.6 的對數期的菌液，其培 養的時間大約需要 3~4 小時。. 圖 2.3 吸光度與濁度的測定示意圖 7.
(16) 2.3 基板的製作 實驗上是使用鍍有氧化銦錫(ITO)薄膜的玻璃，主要是利用其導電性，可以 在實驗上在細菌上施加電壓進而觀察其特性。所採取固定細菌的方式，是利用聚 -L-離胺酸所帶的正電與大腸桿菌所帶的負電，互相吸引使其固定。取 200μL 的 聚-L-離胺酸滴於 ITO 玻璃上，形成約 1~1.5cm 直徑的區域，隨後將 ITO 玻璃放 至烘箱，設定烘烤溫度 50℃及烘烤時間 2 小時後即完成基板的製作。. 2.4 紫外光照射與樣品的製作 實驗上所使用的紫外線操作箱是 STRATAGENE 生產的 UV Stratalinker 2400， 照度大約為 24 J cm2 sec ，波長為 254nm。先將紫外光操作箱熱機約 30 秒，再 取吸光值 0.6 的菌液 5mL 倒入培養皿中，放置於紫外光操作箱中，選擇不同照 射時間，啟動照射即可。 樣品的製作，取未照射紫外光的菌液或者照射紫外光後的菌液 20μL，平鋪 在聚-L-離胺酸改質的 ITO 玻璃上，靜置約 20 分鐘讓菌液可以吸附在基板上，隨 後利用二次去離子水沖洗，再使用氮氣吹乾即完成樣品的製作。若需要在液態的 環境下工作，為了保持近生理條件，所以必須使用磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer saline 簡稱 PBS)沖洗樣品，且必須將樣品置於 PBS 中，直到在原子力顯微鏡成 像[20]。. 8.
(17) Chapter3 原子力顯微鏡 3.1 原子力顯微鏡基本原理與操作模式[11][12] 原子力顯微鏡(atomic force microscope，縮寫為 AFM)，是由 IBM 公司蘇黎 世研究中心的 Gerd Binnig 與史丹福大學的 Calvin Quate 於 1985 年所發明的，利 用探針懸臂與樣品原子之間的作用力，來呈現樣品的表面特性，所以原子力顯微 鏡可以量測導體以及非導體，相較於掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope，縮寫為 STM)與掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，縮 寫為 SEM） ，原子力顯微鏡擁有極大的優點，既不需要使用高能量電子束，也不 需要對樣品做任何特殊的處理，也不需要在真空環境下操作。對於生物樣品而言， 原子力顯微鏡可以在大氣或者液態下進行操作，使得生物樣品可以維持在近生理 環境下進行操作，這個優點是相當不錯的。 原子力顯微鏡主要是由下列五個部分所組成(圖 3.1)，分別是雷射(Laser)、懸 臂(Cantilever)及探針(Tip)、壓電陶瓷掃描器(PZT Scanner)、回饋電路(feedback electronics)、四象限感光二極體(photodiode)。原子力顯微鏡在掃描樣品時，探針 與樣品之間的作用力會使探針偏折，使得反射至四象限二極體的雷射光點產生上 下移動(圖 3.2)，回饋電路根據四象限二極體上的雷射光點移動將壓電材料膨脹 或收縮，帶動探針的上下移動，在將驅動壓電材料膨脹或收縮的電壓作圖，就可 以得到樣品表面的高低起伏。. 圖 3.1 原子力顯微鏡構造圖 (圖片來源：維基百科) 9.
(18) 圖 3.2 探針懸臂曲折使得四象限二極體上雷射光點的偏移 原子力顯微鏡的操作模式主要分為三種，分別是接觸式(contact mode)、非接 觸式(non-contact mode)和暫接觸式(semi-contact mode)。是以探針與樣品間的距離 與作用力關係作為區分(圖 3.3). 圖 3.3 探針與樣品距離與作用力關係圖 (1) 接觸式(contact mode) 是直接將探針與樣品接觸作掃描，主要是利用探針與樣品間的庫倫排斥力 (Coulomb repulsive force)，斥力的大小是主要的回饋來源。因為斥力對距離的變 化相當敏感，所以容易獲得原子級的解析度，但是過大的作用力會使得樣品受 損。 (2) 非接觸式(non-contact mode) 是將探針距離樣品一段距離作掃描，主要是利用探針與樣品之間的凡得瓦力 (van der Waals force)，吸引力是主要的回饋來源。由於探針與樣品並沒有直接的 接觸，所以並不會損害樣品，但因為在大氣下掃描時，容易受到空氣擾動所影響， 所以獲得的解析度較差，必須在真空環境下，才可以獲得較好的解析度 10.
(19) (3) 暫接觸式(semi-contact mode) 是將探針以一定頻率振盪，當探針振盪至最低點的時與樣品接觸，探針以輕敲的 方式接觸樣品又稱輕敲式(tipping mode)，此時是以振幅的改變作為回饋的來源， 獲得的解析度雖比接觸式的差，但是樣品較不容易受到破壞。所以生物樣品通常 是以暫接觸式作為掃描模式。 不過因為實驗目的的不同，選擇不同的掃描模式也是常有的，例如說，掃描 細菌時，雖然暫接觸式的探針與樣品間的作用力與側向力都比接觸式的小，但是 垂直且持續的敲擊，反而容易使細菌遭到刺穿而破損，所以常常是以接觸式作為 掃描模式，圖 3.4 為不同操作模式與掃描相同樣品的結果示意圖。. 圖 3.4 不同操作模式與掃描相同樣品的結果示意圖 (黃色線為成像結果). 3.2 力與距離的曲線 力與距離曲線(force-distance curve)，可以得知樣品表面的機械性質，利用原子力 顯微鏡的優異的成像能力，就可以針對特定區域進行探討，就可以獲得樣品的彈性常 數、楊氏模數(Young’s modulus)等等的資訊。選定特定點，將探針沿著 Z 軸進行移 動，將探針的偏折與距離作圖，就可以獲得力與距離曲線(圖 2.7)。 圖 3.5 中紅線是探針逼近樣品，藍線是探針遠離樣品，探針沿著 Z 軸向樣品 逼近(點 a)，直到與樣品接觸(點 b)，探針開始曲折直到設定值(setpoint)(點 c)，隨 後開始遠離樣品，直到準備與樣品分離(點 d)，但是受到探針與樣品間的作用力 影響，探針並沒有完全與樣品分離，直到與樣品完全分離(點 e)，直到完全遠離 樣品為止(點 f)。. 11.
(20) 圖 3.5 力與距離曲線和探針逼近樣品探針曲折示意圖. 在力與距離曲線中，因為不同距離探針與樣品的交互作用不同，所以可以獲 得相當多的資訊(圖 3.6)，主要可以分作兩個部分作為探討，進針曲線與退針曲 線。. 圖 3.6 力與距離曲線各部分資訊圖. 12.
(21) 進針曲線受到了庫倫力與凡得瓦力所影響，當探針與樣品接觸後，則會受到 所樣品所抵抗的作用力影響，所以才會有如此形狀，主要可以分為四個區域(圖 3.7)[22]，分別是無交互作用區域(A)、未接觸區域(𝐶𝑒 )、接觸區域(𝐶𝑠 )與接觸且穩 定區域(𝐷𝑎 )，無交互作用區域(A)指的是探針未受到任何交互作用所影響，所以 探針此時並不會曲折，通常此時的梯度會是 0。未接觸區域(𝐶𝑒 )，此時雖探針尚 未接觸樣品，但已經受到探針與樣品間的交互作用，使探針產生偏折。接觸區域 (𝐶𝑠 )，指的是當探針與樣品開始接觸，但是受到樣品表面的物質所影響，所以反 抗的作用力尚未達到定值，此段區域為非線性區域，可以利用此段區域計算楊氏 模數。接觸且穩定區域(𝐷𝑎 )，指的是探針與樣品接觸直到了樣品的反抗作用力達 到了穩定程度，此段區域為線性區域，可以利用此段區域計算樣品的有效彈性常 數，梯度通常會是定值。 進針曲線在大氣與液態環境也會有些許的差別，在大氣環境下，當探針逼近 樣品時，當距離小到一定程度，受到彼此之間的凡得瓦力影響，探針會突然吸向 樣品，此現象稱為跳接(jump-to-contact)(圖 3.8)[23]，圖中點 1 至點 2 的部分，此 現象在液態環境並不會發生。. 圖 3.7 進針曲線不同區域的分析. 13.
(22) 圖 3.8 跳接與跳離示意圖 退針曲線的形成，當探針由接觸狀態準備脫離樣品時，因為受到探針與樣品 之間的作用力，導致不會馬上的脫離樣品，直到探針遠離的力道克服吸附力的作 用，才會脫離樣品，稱為跳離(jump-off contact) (圖 3.8) [23]，圖中點 3 至點 4 的 部分。主要是受到毛細現象(capillary action)、凡得瓦力和探針與樣品間鍵結的破 壞等因數有關。 然而在大氣環境與液態環境，會有相當大的差異。在大氣環境下，因為環境 含有水氣的關係，當探針脫離樣品時，會形成一水橋(meniscus)(圖 3.9)，產生毛 細現象，此時吸附力主要的貢獻都來自於毛細現象，也就是說，探針必須拉斷此 水橋，才可以脫離樣品。若在液態環境，毛細現象就會消除。. 圖 3.9 毛細現象與水橋示意圖 14.
(23) 也有研究對於大氣環境下吸附力研究[30]，研究指出，吸附力主要來自於毛 細力、凡得瓦力、靜電力與化學鍵結的影響，在不考慮靜電力的狀況，毛細力可 以下列公式表示(式 1)：. Fc 2 R(cos cos ....................(1) 𝛾為表面張力，R 為探針尖端球體半徑， 為探針與液面的水接觸角，𝜃為樣品與 液面的水接觸角，由於毛細力與相對濕度有關，且相對濕度對毛細力的影響是很 大的，毛細力的大小莫約為 35~55 nN。. 3.2.1. 有效彈性常數的計算. 有效彈性常數(effective spring constant)的計算，首先是假設探針與大腸桿菌 皆為理想的彈簧(圖 3.10)[24,25]，當探針與大腸桿菌接觸後，將探針與大腸桿菌 視為兩個互相串聯的彈簧，將可以利用一個公式來計算出大腸桿菌的有效彈性常 數(式 2) k m kb t ....................(2) 1 m 此公式可由虎克定律 F k x 所推導出來，這裡的 kb 即為大腸桿菌的有效彈 性常數， kt 為探針的彈性常數，𝑚則是由大腸桿菌所測量到的進針曲線，接觸部 份的斜率，將以上參數代入公式中，即可以計算出大腸桿菌的有效彈性常數。本 實驗中測量力曲線的時候，會重複測量十次，並選擇十次測量到的數據都非常接 近，才認定該數據為可信的數據。因為探針非常的尖銳，在進行量測的同時，可 能將大腸桿菌刺破，若刺穿大腸桿菌，所獲得的數據則失去了可性度。. 圖 3.10 探針與大腸桿菌假想彈簧的關係圖. 15.
(24) 在分析數據的同時，會把探針與樣品所接觸的那一點，平移至原點，視為探 針接觸到樣品後，其下壓多少距離。若將一堅硬基板與一軟樣品，兩者平移之後 的力曲線圖，就可以很簡單的以斜率比較彼此的軟硬(圖 3.11)。在同一高度下， 基板與大腸桿菌的進針曲線相減，就可以獲得大腸桿菌的凹陷深度 (indentation)(圖 3.12)[24,25]，並且可以將凹陷深度與距離作圖。 100. Deflection (nm). sub cell. 50. 0 -300 -200 -100 0 piezo movement (nm). 圖 3.11 堅硬基板與軟樣品的進針曲線比較. 圖 3.12 樣品凹陷深度示意圖 實驗上將測量未照射紫外光的大腸桿菌，照射強度 4.32、8.64、12.96 與 17.28 J cm2 紫外光的大腸桿菌，並利用所測量到的進針曲線，來計算各別的有效彈性 常數，進行比較。. 16.
(25) 3.2.2. 楊氏模數的計算. 楊氏模數(Young’s modulus)[26]是由進針曲線其探針與樣品剛接觸的非線性 部分所計算出來，通常是利用赫茲模型(Hertz model)，假設一小硬球壓在平面上， 且此兩物體並無吸引力。赫茲模型已被廣泛的利用於計算細菌之楊氏模數。. F. 2 E tan( ) 2 K A....................(3) (1 2 ). 其中 F 為所探針施加於大腸桿菌的力，E 為大腸桿菌之楊氏模數(式 3)，γ 為蒲松比(Poisson ratio)，軟性物質通常一般設為 0.5，，α 為探針之半錐角 ( half-cone angle)，δ 為凹陷深度，K 為探針的彈性常數，A 為一常數。探針下壓 大腸桿菌的關係，可以畫成一示意圖(圖 3.13). 圖 3.13 探針與細胞凹陷深度示意圖. 3.2.3. 吸附力所作的功. 因為力與距離曲線下所包含面積就是能量，W = 𝐹 × 𝑑，進針曲線所包含之 區域與退針曲線所包含之區域相減後(圖 3.14)，也就是圖中黃色的區域，此三角 形面積就是吸附力所做的功。可以更改施加於探針與樣品間的電壓，來測量電力 對吸附力的影響，也可以觀測毛細現象對吸附力的影響。 實驗上將探針與大腸桿菌間，施加不同偏壓，並測量大腸桿菌的力曲線，利 用退針曲線計算吸附力所作的功，來觀測變化。且觀測未照射紫外光的大腸桿菌， 照射強度 4.32、8.64、12.96 與 17.28 J cm2 紫外光的大腸桿菌，並利用所測量到 的退針曲線，進行比較。 17.
(26) 圖 3.14 吸附力作功示意圖. 3.3 靜電力顯微鏡 靜電力顯微鏡(EFM)的工作原理是測量探針與樣品間的庫侖作用力(圖 3.15)。 非接觸式原子力顯微鏡是測量探針與樣品之間的凡得瓦力類似。在探針與樣品之 間施予電位差 ΔV 使兩者間形成一等效電容 C，則系統的總能量 U C (V )2 / 2， 在掃描過程中，ΔV 維持固定，其靜電力 F U z C 2z (V )2 ，因為庫侖 作用力則屬於長程力，故探針與樣品間的工作距離通常為 100nm。然而，即使運 用較大的工作距離，有時仍不能完全忽略凡得瓦力的存在。其解決的辦法是將電 位差改為交流電壓，在處理訊號時，只處理相關頻率的交流訊號，即可把凡得瓦 力的影響排除在外。. 圖 3.15EFM 成像示意圖 18.
(27) 根據文獻研究[29]，根據探針的形狀可以模擬出探針與基板之間所產生的靜 電力(圖 3.16)(式 4)， F ò0V 2 g ( D)....................(4) g ( D) gcone gapex gcant ....................(5). g ( D) 是與探針外形有關的函數分別與尖端部分 g cone 、錐形部分 g apex 與懸臂. 部分 g cant 所組成(式 5)，若將其簡化可以得到下式(式 6). F ò0. R 2V 2 ....................(6) D( D R ). 𝜖0 為真空介電常數，R 為探針尖端圓球半徑，R 為樣品與探針間的距離。. 圖 3.16 探針與基板模擬示意圖. 3.4 原子力顯微鏡在生物方面的應用 原子力顯微鏡在生物方面最大的優點，就是不同的環境中，皆可進行非破壞 性的觀測，也可以在液態中使生物接近生理環境下作即時的觀測。所以，利用原 子力顯微鏡對生物樣品的觀測擁有著很好的優勢。 不過要對生物樣品做研究，必須要能在液態環境下工作，在液態中操作不需 使用很大的力就可以達到成像，原因是水是一個極性物質，它會將大氣中探針與 樣品間的遠距力(long-range force)抵銷，所以大氣環境與液態環境的設定值(set point)的選擇並不相同。 在液態中成像是有一定程度的難度，因為探針在掃描樣品時，無論是輕敲或 者接觸，都會產生一個側向力，這會造成沒有固定於基板的物體隨著探針移動， 使得成像困難，所以在掃描細菌時，通常會將細菌固定於基板上，將細菌固定於 基板上的方法通常有兩種，分別是為機械捕捉方法(mechanical trapping)，和化學 改質表面方法(chemically modified)。. 19.
(28) 機械捕捉方法，是利用特定尺寸濾網或者孔洞，將細菌卡在上面進行觀測， 例如：聚碳酸酯樹酯濾網(polycarbonate filter) [18]，不過只有特定尺寸大小的細 菌才會被捕捉，但是不會捕捉到任何化學物，所以不用考慮化學物對細菌的影 響。 化學改質表面方法，通常是利用細菌表面所帶的負電，改變基板表面所帶的 電性，利用正負相吸的原理來固定細菌，通常是使用聚-L-離胺酸(poly-L-lysine) [13,14]或者是利用氨乙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)，帶 有許多氨基集團(NH3 group)的化學物，將其沉積在一般原子力顯微鏡常使用的 雲母(mica)或蓋玻片(cover glass slide)基板表面上。改質過的表面就可以達到固定 細菌且抵抗掃描時產生的側向力。但當利用正負電相吸固定細菌時，必須有適當 的乾燥才能夠達到固定細菌的目的。另一種化學表面改質方法，是利用膠狀的明 膠(gelatin) [13,15,16]或是瓊脂(agar) [17]在基板表面形成一層膠狀物，使細菌陷在 膠狀物上，並且可以使用旋轉塗佈法得到一個平坦的平面，但使用帶有鹽類的緩 衝液時，就會失去固定的效果。. 3.5 實驗操作過程 3.5.1. 原子力顯微鏡操作過程[21]. 實驗上所使用的儀器為 NT-MDT 生產的 Solver P47H，包含 AFM 操作頭與 控制系統(圖 3.17)、操作用電腦(圖 3.18)。. 圖 3.17AFM 操作頭與控制系統(NT-MDT). 圖 3.18 操作用電腦. 原子力顯微鏡的操作過程分為大氣環境與液態環境。在大氣環境中，通常選 用的是輕敲式的探針(圖 3.19)，實驗上所使用的是 NANOSENSORS 公司所提供， 長度為 10~15 μm，懸臂的長度為 225±10μm，共振頻率 96~175 kHz，彈性常數 為 5~37 N/m。或者是具有導電功能的探針，長度為 10~15 μm，懸臂的長度為 225±10μm，共振頻率 45~115 kHz，彈性常數為 0.5~9.5N/m。 20.
(29) 圖 3.19 探針外形示意圖 (圖片來源：NANOSENSORS 公司) 首先開啟電腦與控制系統，打開電腦桌面的軟體 Nova，選擇操作模式為 SemiContact 模式，放置樣品與安裝探針於探針座(圖 3.20)，調整操作頭上方的旋 鈕(圖 3.21)，將雷射打在懸臂上，使其產生繞射條紋(圖 3.22)，此時四象限二極 體上已有雷射光點(圖 3.23)，將雷色光強調為最大且將雷射光點調至四象限二極 體的中央(圖 3.24)，偵測共振頻率(圖 3.25)是否正確，且調整掃描參數 Mag 值至 10 左右，設定 setpoint 為 Mag 值的一半後進針，在 Scan 模式下選擇掃描範圍與 掃描速度，按下 Run 鈕，即可獲得樣品形貌。. 圖 3.20 探針與探針座. 圖 3.21 操作頭的旋鈕. 圖 3.22 雷射擊中懸臂所形成的繞射條紋. 21.
(30) 圖 3.23 雷射光點未在中心. 圖 3.24 雷射光點已在中心. 圖 3.25 共振頻率圖 在液態環境中的操作中，通常選用接觸式的探針，實驗上們所使用的是 NANOSENSORS 公司所提供，長度為 10~15 μm，懸臂的長度為 450±10μm，共 振頻率 6~21 kHz，彈性常數為 0.02~0.77 N/m。或者是 μmach 公司所提供，長度 為 10μm，懸臂的長度為 350μm，共振頻率 7~14 kHz，彈性常數為 0.03~0.08 N/m。 首先開啟電腦與控制系統，打開電腦桌面的軟體 Nova，選擇操作模式為 SemiContact 模式，放置樣品且在樣品上滴上緩衝液，安裝探針於液態專用探針 座(圖 3.26)，必須在液態中，調整操作頭上方的旋鈕(圖 3.21)，將雷射打在懸臂 上(圖 3.27)，使其產生繞射條紋(圖 3.22)，此時四象限二極體上已有雷射光點(圖 3.23)，將雷色光強調為最大且將雷射光點調至四象限二極體的中央(圖 3.24)，設 定 setpoint 值的為 0.5，在 Scan 模式下選擇掃描範圍與掃描速度，按下 Run 鈕， 即可獲得樣品形貌。. 22.
(31) 圖 3.26 液態專用探針座. 圖 3.27 液態環境雷射路徑示意圖. 23.
(32) 3.5.2. 利用原子力顯微鏡取得力與距離的曲線. 在 3.5.1 節中，獲得樣品形貌的同時，同時可以切換至 Curves 模式(圖 3.28) 去取得力與距離曲線，選擇特點定，選擇 Z 軸的範圍，選擇取一次曲線所需時 間，選擇取曲線的次數，按下 Run 鈕，就可以獲得力與距離曲線。. 圖 3.28Curves 模式下各功能介紹 不過有個重要的點必須注意，因為所輸出的檔案為 DFL 值與 Z 軸高度(距離) 作圖，DFL 值所指的就是探針的偏折以電流形式輸出，單位為安培(A)，所以必 須利用一些換算，將 DFL 值換算成力。首先，每次量測前都必須先量測一個最 硬的東西當作基準，通常就是以基板作為基準。量測基板的力與距離曲線數次， 取進針曲線，探針與基板接觸其間的斜率，此時探針的偏折僅僅就是探針的偏折， 因為量測其他物品時，會牽扯到物品的變形，進針時，探針與樣品同時變化，所 以需要基板作為校正。所取得的基板斜率 s，稱為靈敏度(sensitivity)，單位為(A/m)， 將 DFL 值除上靈敏度，就可以轉換成偏折程度(Deflection)，單位為(m)。在利用 虎克定律 F = k × x = k × DFL/s，就可以在將探針的偏折轉換成力，這裡的 k 為 探針的彈性常數。最後，就可以獲得力與距離的曲線。. 24.
(33) 3.5.3. 靜電力顯微鏡. 靜電力顯微鏡的操作方式與原子力顯微鏡大致相同，使用的必須是導電的探 針，且必須使用導電基板，並使用專用的樣品座使其與儀器連結。 首先開啟電腦與控制系統，打開電腦桌面的軟體 Nova，選擇操作模式為 SemiContact 模式，放置樣品於專用的樣品座(圖 3.29)，安裝探針於探針座(圖 3.20)， 調整操作頭上方的旋鈕(圖 3.21)，將雷射打在懸臂上，使其產生繞射條紋(圖 3.22)， 此時四象限二極體上已有雷射光點(圖 3.23)，將雷色光強調為最大且將雷射光點 調至四象限二極體的中央(圖 3.24)，偵測共振頻率(圖 3.25)是否正確，且調整掃 描參數 Mag 值至 10 左右，設定 setpoint 為 Mag 值的一半後進針，在 Scan 模式 下選擇 Electrostatic Force Mode(圖 3.30)，選擇抬起高度 ΔZ，並將探針選擇為接 地(圖 3.31)，樣品選擇連接樣品，最後選擇掃描範圍與掃描速度，按下 Run 鈕， 即可獲得樣品形貌的 AFM 圖譜，與 EFM 圖譜。. 圖 3.29EFM 專用樣品座與固定樣品示意圖. 圖 3.30 參數設定配置圖. 25.
(34) 圖 3.31 儀器線路配置圖. 3.6 靜電力顯微鏡實驗結果 實驗上將未照射紫外光大腸桿菌與照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌， 分別施以不同偏壓(1V、5V、10V)，來觀測其 EFM 圖譜。由於 EFM 的掃描，是 先掃描出樣品的形貌，再將探針抬起 100nm，在相同的路徑再掃一次，所以可以 同時獲得表面形貌與 EFM 圖譜。受紫外光照射的大腸桿菌依舊有兩端隆起中間 塌現的現象(圖 3.32)，隨著電壓增加，庫倫力也隨之增大，EFM 圖譜較為清晰(圖 3.33 圖 3.34)，由 EFM 圖譜當中，明顯的可以看出在大腸桿菌兩端凸起的部分， 電力較強，表示電荷集中於兩端，接下來，將使用力曲線來探討特定區域電力的 探討。. 圖 3.32 未照射紫外光與照射紫外光強度 17.28 J cm2 的大腸桿菌的表面形貌. 26.
(35) 圖 3.33 未照射紫外光大腸桿菌施加不同偏壓的 EFM 圖譜. 圖 3.34 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌施加不同偏壓的 EFM 圖譜. 可以利用儀器中的功能，觀測特定點上的靜電力，設定所加的偏壓-10V 至 10V，來觀測其探針懸臂偏移的情況，也就是靜電力的變化，因為大腸桿菌帶的 是負電荷，若改變所施加的偏壓，靜電力的變化也會不同(圖 3.35)，由示意圖可 以看出，靜電力最小的地方，應該是施加偏壓所產生的電荷與大腸桿菌所帶的電 荷剛好抵消的時候(圖 3.36)。實驗測量了基板和未照射紫外光大腸桿菌(圖 3.37)， 以及基板與照射紫外光能量 17.28 J cm2 的大腸桿菌(包含了凹陷點與凸起 點)(圖 3.38)，探針懸臂的偏移情況。. 圖 3.35 施加不同偏壓，電荷分布狀況示意圖. 27.
(36) Force -10. -5. 0 5 Bias(V). 10. 圖 3.36 靜電力最低點偏移示意圖. Deflection. 基板 大腸桿菌. -10. -5. 0 Bias(V). 5. 10. 圖 3.37 基板與未照射紫外光後的大腸桿菌，施加不同偏壓，探針偏移變化圖 右圖為大腸桿菌形貌圖. Defection. 凹陷處 基板 凸起處. -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 Bias(V) 圖 3.38 基板與照射紫外光後的大腸桿菌，施加不同偏壓，探針偏移變化圖 右圖為大腸桿菌形貌圖(包含凸起點與凹陷點) 28.
(37) 實驗數據可以看出，數據的確有隨著施加偏壓的平方成正比，但所有的數據 都很接近，代表的意思是基板所帶的電荷遠遠的大於大腸桿菌的帶電量，所以並 沒有辦法分辨細菌的電荷分佈是否有改變。. 3.7 吸附力作功實驗結果 毛細現象. 3.7.1. 實驗上對未照射紫外光的大腸桿菌，與照射不同能量強度的大腸桿菌(4.32、 8.64、12.96 與 17.28 J cm2 )進行力曲線的量測，對 10 隻大腸桿菌，每次量測 5 次力曲線，將吸附力(圖 3.39)與脫離長度(圖 3.40)都計算出來，並畫出分佈圖。. Force(nN). 50. Breaking distance (nm). 凸起處 凹陷處 Fit of 凸起處 FIt of 凹陷處. 60. 40 30 20 10 0. 凸起點 凹陷點 Fit of 凸起點 Fit of 凹陷點. 200 150 100 50 0. 0. 5 10 15 UV Intensity (J/cm2). 20. 圖 3.39 為吸附力與照射強度關係圖. 0. 5 10 15 UV Intensity (J/cm2). 20. 圖 3.40 為脫離長度與照射強度關係圖. 吸附力的範圍大約是 30~50 nN，這與文獻[30]上不同溼度大約毛細力大小 30~50 nN 相當接近，所以可以推測量到的吸附力，毛細力仍然是主要的貢獻。 在脫離長度的部分，可以看出無論是大腸桿菌的凸起點與凹陷點，都有減少的趨 勢，這表示，水橋所持續的時間減少了。若把吸附力做功的分佈圖也畫出來(圖 3.41)。. 29.
(38) 凸起點 凹陷點 Fit of 凸起點 Fit of 凹陷點. Energy(10-15J). 5 4 3 2 1 0 0. 5 10 15 2 UV Intensity (J/cm ). 20. 圖 3.41 吸附力做功與紫外光照射強度關係圖 橫軸為照射強度，縱軸為吸附力所作的功，可以發現，吸附力做功有往下降 的趨勢，這表示，大腸桿菌與探針的毛細現象受到了改變，並且減小了。. 3.7.2. 水接觸角的量測與驗證. 為了更了解毛細現象的變化，利用水的接觸角(contact angle)量測，大腸桿菌 表面的親疏水特性做定性研究。當大腸桿菌表面脂多醣層會遭受到破壞，大腸桿 菌表面水接觸角會變大，也就是傾向於疏水[28]。 實驗方法為：將 30 mL 的大腸桿菌，使用離心機 4000 轉，離心 15 分鐘， 將上方的液體抽出，並重新懸浮於 PBS 中，重複上述步驟兩次。隨後使用 0.2 μm 的濾膜，將大腸桿菌用真空過濾法(圖 3.42 3.43)過濾。利用幫浦抽氣，將多餘的 液體抽出，由於大腸桿菌的寬度約為 0.5 μm，長度約為 3 μm，所以大腸桿菌並 無法穿透濾膜，並且在濾膜上形成一層細胞所堆積的薄膜，將其置在大氣中乾燥 60 分鐘後[27]，隨後將 10 μL 的去離子水滴在樣品上，並使用攝影機截取畫面， 則可以計算出其水接觸角。. 30.
(39) 圖 3.42 真空過濾法配置簡圖. 圖 3.43 真空過濾法儀器配置圖 (箭頭處為濾膜放置處) 實驗上將未照射紫外光的大腸桿菌與照射紫外光能量為 8.64 J cm2 與 17.28 J cm2 的大腸桿菌製成了可以觀測水接觸角的樣品，並且也觀測了水接觸角(圖 3.44)，一個樣品各取五次量測，可以發現，未照射紫外光的大腸桿菌的水接觸角 約為 18° ± 2°，與文獻研究大腸桿菌水接觸角 17° ± 1°接近，然而受到紫外光照 射 60 分鐘的大腸桿菌，水接觸角增加至約 27° ± 2°，受到紫外光照射強度 17.28 J cm2 的大腸桿菌，水接觸角增加至約 32° ± 3°，數據整理於表 3.1。. 大腸桿菌處理. 未照射紫外光. 照射紫外光強度 8.64 J cm2. 照射紫外光強度 17.28 J cm2. 水接觸角. 18° ± 2°. 27° ± 2°. 32° ± 3°. 表 3.1 大腸桿菌表面水接觸角比較 31.
(40) 圖 3.44 未照射紫外光的大腸 桿菌與照射能量為 8.64. J cm2 與 17.28 J cm2 紫外光 大腸桿菌的水接觸角的量測. 由水接觸角的實驗可以得知，紫外光的確會破外大腸桿菌表面的脂多醣層， 且在吸附力的量測也可以看出，隨著照射強度的增加，吸附力做功與脫離距離都 有減少的現象。 所以可以推論，大腸桿菌受到紫外光照射，表面的脂多醣層受到破壞，進而 影響大腸桿菌表面的親疏水性變化，且傾向於疏水，使得表面與探針間的水橋， 提早斷裂，使得探針提早遠離大腸桿菌。也就是說，可以利用吸附力做功的量測， 來判斷大腸桿菌表面的脂多醣層是否遭受破壞。. 3.8 大氣環境中的有效彈性常數 由 3.2.1 的介紹，可以利用力曲線計算出大腸桿菌的有效彈性常數，實驗上 對未照射紫外光的大腸桿菌，與照射不同強度的大腸桿菌(4.32、8.64、12.96 與 17.28 J cm2 )進行力曲線的量測，對 10 隻大腸桿菌，每次量測 5 次力曲線，並 將其有效彈性計算出來，並畫成關係(圖 3.45)。. 32.
(41) kb (N/m). 凸起處 凹陷處 Fit of 凸起處 Fit of 凹陷處. 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 0. 5 10 15 2 UV Intensity (J/cm ). 20. 圖 3.45 有效彈性常數與照射時間關係圖 以實驗數據，發現所計算出的大腸桿菌有效彈性常數相當的大，與文獻上所 得到結果 0.037±0.014 N/m[28, 31]，差了大約 100~200 倍。因為有效彈性常數與 細胞內的膨壓(turgor pressure)有關(圖 3.46)，細菌內所含的細胞質，為了維持細 胞形狀，為了抵抗外部滲透壓，細胞會有向外且施加在細胞壁上的壓力，稱為膨 壓。但由於這些樣品都是於大氣下所觀測，缺乏外部的滲透壓，這使得，實驗上 所測量出的彈性常數相當的大。所以，若需要計算出正確的有效彈性常數，必須 在液態環境下有膨壓的狀態下觀測才行。. 圖 3.46 膨壓與滲透壓示意圖. 33.
(42) 3.9 液態環境中的有效彈性常數與楊氏模數 在液態環境下，首先遇到的問題，就是掃描出的表面形貌與大氣下掃描的形 貌相較之下非常模糊(圖 3.47)，解析度相當的差，這有可能是探針在掃描的過程 當中，所產生的側向力影響造成，也有可能是基板與大腸桿菌的吸附能力有關， 這都造成了觀測的難度。. 圖 3.47 在大氣環境(a) 與 液態環境(b) 所觀測大腸桿菌形貌的差異 力曲線的觀測，大氣環境中進針曲線跳接現象，在液態環境的狀況是完全消 失的(圖 3.48)，這表示將可以利用力曲線進行有效彈性常數與楊氏模數的計算， 不過所計算出的有效彈性常數，大約是 0.1~0.5 N/m 的範圍，雖然已經接近了文 獻上的數據，不過還是差了一個數量級，並且發現了細菌的凹陷程度大約為 25nm 與文獻上 100~150nm 的凹陷程度相比(圖 3.49)[26]，凹陷程度相對的小，造成這 等現象原因，應該是因為樣品的製作是在大氣下完成，經由乾燥的過程，已經將 其變成了標本，所以觀測到的有效彈性常數仍然較大，細菌的凹陷程度也較小。. 0.6 substrate E. coli. Loading force (nN). 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1. -240. -200. -160. -120. -80. -40. 0. piezo z positon shift (nm). 圖 3.48 液態環境中基板與大腸桿菌進針曲線的比較. 34.
(43) 0.6. Force (nN). 0.4. 0.2. 0.0. -5. 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. Identation (nm). 圖 3.49 液態環境下大腸桿菌凹陷程度圖 為了不讓樣品變成了標本，所以在製成樣品的時候，使用 PBS 作為保存， 使大腸桿菌可以維持生理狀態，由於，大腸桿菌為軟樣品，在掃描過程當中，會 隨著探針移動而擺動，也有可能隨著探針所移動，掃描出來的表面形貌解析度更 差，仍有需多因數需要克服。所以在製成樣品後，2~4 小時內完成掃描，並且隨 時以 PBS 作為保存。實驗上以未照射紫外光與照射紫外光強度 17.28 J cm2 的大 腸桿菌進行量測，不過一開始就遇到了解析度相當差的影響，這將會增加判斷菌 體位置的困難度。文獻中[25][36]有提到，進行力曲線量測的時候，最好選擇菌 體的中央部分，因為菌體的結構，若下壓菌體中央與側面(圖 3.50)，將會有相當 大的差異，也會造成誤差。. 圖 3.50 下壓菌體位置差異示意圖 依實驗數據計算出未照射紫外光大腸桿菌大約為 0.05 N/m(圖 3.51)，這與文 獻上的數據相當接近，同時也計算出照射紫外光 17.28 J cm2 強度的大腸桿菌彈 性常數大約為 0.03 N/m(圖 3.52)。. 35.
(44) UV. control. 40. Count. Count. 40 20. 20. 0. 0 0.00. 0.05 0.10 0.15 0.20 Effective Spring Constant (N/m). 0.00. 0.25. 0.05 0.10 0.15 0.20 Effective Spring Constant (N/m). 0.25. 圖 3.52 照射紫外光強度 17.2 J cm2 大腸桿菌有效彈性常數分佈圖. 圖 3.51 未照射紫外光大腸桿菌 有效彈性常數分佈圖. 也計算出，未照射紫外光大腸桿菌的楊氏模數大約為 0.21Mpa (圖 3.53)，照 射紫外光強度 17.28 J cm2 的大腸桿菌楊氏模數約為 0.08Mpa (圖 3.54)。. control. 8. UV. 6 4. Count. Count. 6. 2. 4 2. 0 0.0. 0.1 0.2 0.3 Young’s modulus (Mpa). 0 0.0. 0.4. 0.1 0.2 0.3 Young’s modulus (Mpa). 0.4. 圖 3.54 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌楊氏模數分佈圖. 圖 3.53 未照射紫外光大腸桿菌 楊氏模數分佈圖. 依實驗數據可以看出，受到紫外光照射的大腸桿菌彈性常數與楊氏模數都會 下降，由於計算楊氏模數的非線性區域的形成，是因為探針下壓至細胞壁上的肽 聚醣層(peptidoglycan)，由於肽聚醣層為細胞壁主要的成分，足以抵擋探針的下 壓，使得接下來的下壓為線形狀況。藉由楊氏模數的下降，可以判斷大腸桿菌表 面的肽聚醣層也因為受到紫外光照射而產生破壞。. 36.
(45) Chapter4 恆定力輕敲式掃描模式 4.1 基本原理 接觸式掃描是利用即時力量控制做為回饋訊號的來源，但掃描時會有嚴重的 側向力。輕敲式掃描雖有較低側向力影響，但是回饋訊號是來自於頻率調制的偏 折量。恆定力輕敲式掃描模式(Peak Force Tapping Mode)是整合接觸式與輕敲式 的優點，利用快速的上下移動探針，減輕掃描造成的側向力，就如同在平面上每 個點快速的執行力與距離曲線。 輕敲式掃描是利用是以探針懸臂樑之自然共振頻率振盪，Peak Force Tipping Mode 則是以遠低於探針共振之頻率作上下輕敲振盪，也就是工作於非共振模式 下，也因為如此，在液態環境中掃描，並不會受到流體造成的共振頻率偏移的影 響，降低了在液態環境中掃描的難度。 輕敲式掃描的回饋訊號為懸臂振幅，是受到長程作用力和短程作用力交互影 響而得，一般懸臂振幅約為數十奈米，若樣品具有黏性或者過軟，探針無法擺脫 表面束縛，使得掃描影像不清晰。恆定力輕敲式掃描模式回饋訊號與短程作用力 有關，掃描時成像只受到探針與樣品表面的短程作用力影響，所以這是高解析成 像的原因，對於軟性樣品與黏性物質也有穩定的表現。圖 4.1 是輕敲式與恆定力 輕敲式掃描模式探針驅動與時間變化的關係圖。. 圖 4.1 探針驅動與時間變化關係圖 (a)恆定力輕敲式掃描模式(b)輕敲式 37.
(46) 由於恆定力輕敲式掃描模式的成像過程是利用，探針在樣品上每個點快速的 執行力與距離曲線，使得在獲得影像的同時，也可以獲得每個點上的力與距離曲 線，在 3.2 節當中，所提到的力與距離曲線，可以得知樣品表面的機械性質，利用 獲得的力與距離曲線，經由 DMT 模型與 Sneddon 模型的擬合，利用電腦的計算， 就可以同步的獲得樣品上每一個點的機械性質，彈性模數、吸附力、吸附力作功 等等的資訊(圖 4.2)，這對樣品的分析有極大的幫助[38][39][40]。. 圖 4.2 高度圖所對 應的吸附力、吸附力 做攻、壓縮程度與 Sneddon 模數圖譜. 對於探針與樣品間，楊氏模數的計算，通常會以經由 DMT 模型與 Sneddon 模型 進行擬合，DMT 模型[40](圖 4.3)通常是將探針尖端視為球體，對樣品進行擠壓，楊氏 模數與下壓力道關係如式 1 F. 4 E R 3 2 .....................(1) 3 (1 2 ). E 為楊氏模數，F 為下壓力道，δ 為凹陷深度，R 為針尖半徑， 為蒲松比。. 38.
(47) R 圖 4.3DMT 模型示意圖 Sneddon 模型[39](圖 4.4)則視將探針尖端視為圓錐狀，對於樣品進行擠壓，楊氏 模數與下壓力道關係如式 2 F. 2. E tan( ) 2 .....................(2) 2 (1 ). E 為楊氏模數，F 為下壓力道，δ 為凹陷深度，α為半錐角， 為蒲松比。. 圖 4.4Sneddon 模型示意圖 蒲松比的設定上也視相當重要的環節，當樣品的楊氏模數不同，蒲松比的設 定也要跟著改變，蒲松比與楊氏模數的關係圖如表 4.1，軟物質通常會設定為 0.5。 楊氏模數 E. 蒲松比 . E > 100Mpa. 0.5. 0.1Gpa < E <1Gpa. 0.4. 1Gpa< E <10Gpa 0.3 表 4.1 蒲松比與楊氏模數關係表. 39.
(48) 4.2 實驗操作過程 實驗是在國立臺灣大學應用力學研究所李世光老師實驗室進行，使用的是 Bruker 所生產的 MultiMode 8 AFM，包含了操作用電腦(圖 4.5)、控制系統(圖 4.6) 與 AFM 儀器本體(圖 4.7)，並備有光學顯微鏡(圖 4.7 上方)。. 圖 4.5 操作用電腦. 圖 4.6 控制系統. 圖 4.7AFM 儀器本體與光學顯微鏡 實驗上選用的探針是(圖 4.8)，Bruker 公司所提供，長度為 0.6 μm，懸臂的 長度為 70μm，共振頻率 105 kHz，彈性常數為 0.7 N/m，的三角探針，三角探針 有助於減少側向力的影響與穩定探針。. 40.
(49) 圖 4.8 探針外形示意圖 (圖片來源：Bruker) 首先開啟電腦與控制系統電源，並將 AFM 儀器上開關調整為”AFM & LFM” 模式，在打開電腦桌面軟體“Nanoscope 8.15r3”，按順序選取模組 Mechanical Properties 、 Quantitive Nanomechantcal Mapping 與 PeakForce QNM In Fluid， 選取完成後，點選 Load Experiment 等待設定完成，樣探針放置於探針座(圖 4.9)，將其置於控制頭(圖 4.10)，旋轉後方旋鈕(圖 4.10 A 旋鈕)將其固定，調整 控制頭上方旋鈕(圖 4.10 B 與 C 旋鈕)，將雷射光點打在探針上方，始其產生繞射 條紋，由於雷射光路徑(圖 4.11)是打在探針後，反射至可旋轉之反射鏡上，調整 反射鏡讓雷射打入偵測器當中，使儀器下方顯示器(圖 4.12) SUM 值達到最大， 在調整控制頭上側面旋鈕(圖 4.10 D 與 E 旋鈕)，調整雷射中心位置，使得儀器下 方顯示器(圖 4.12) VERT 值與 HORZ 值歸零，此時完成校準雷射。. 圖 4.9 探針座. 圖 4.10 控制頭俯視圖與各控制旋鈕. 41.
(50) 圖 4.11 雷射光路徑示意圖. 圖 4.12 儀器下方顯示器. 接下來則是要進行探針靈敏度與彈性彈數的校準，首先必須選用一個堅硬基 板，令探針下壓，由於基板不會形變，探針的偏折皆來自於探針本身，偏折量對 印的電壓變化量，就是探針的靈敏度。將堅硬基板放置在樣品座上後，利用手動 的方式，將探針逼近樣品表面後，設定 Scan Size 為 0 nm，點擊右方工具列 "Engega"使用自動近針，近針完成後隨即點擊右方工具列"Ramp"進入力曲線模式， 確定參數 Ramp size 為 100nm 至 1.00µm 區間內後，執行"Ramp Single"，獲得一 條力曲線(圖 4.13)，並選取探針偏折區域，使用工具列"Update Sensitivity"，獲得 (圖 4.14)即完成探針靈敏度的更新，並顯示探針偏折量與電壓的對應關係。. 圖 4.13 探針靈敏度力曲線圖. 圖 4.14 探針偏折與電壓對應關係. 接著進行探針彈性常數的校準，先點擊右方工具列"Withdraw"，令探針 遠離基板，執行 Calibrate >Thermal Tune 功能，利用探測探針的共振頻率來計算 探針的彈性常數，照順序點擊圖 4.12 中"Acquire Data"獲得共振頻率曲線後，選 取範圍後，點擊 "Calculate PSD" "Fit Data"，完成曲線擬合後，點擊"Calcula Spring K"，即可獲得該探針的彈性常數(圖 4.15)。. 42.
(51) 圖 4.15 探針共振頻率擬合圖 完成校準後，更換欲量側之樣品後，滴上一滴 PBS 於樣品上，在將探針近 針，此時因探針接觸液體，使得雷射產生偏折，所以必須要在調整一次反射鏡(圖 4.11)，並且修正雷射光點的偏折。 隨後，調整掃描範圍、掃描速度、蒲松比、探針尖端半徑與探針半錐角，點 擊右方工具列"Engega"使用自動近針，近針完成後，將會自動掃描圖形，同時可 以在各個頻道選擇想獲得的資訊，如樣品形貌、DMT 模數、吸附力、吸附力作 功、壓縮程度、Sneddon 模數。 43.
(52) 4.3 楊氏模數變化. 20 E.coli 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Young’s modulus (Mpa). Count. Count. 實驗上選取未照射紫外光 100 隻大腸桿菌，與照射紫外光強度 17.28 J cm2 的 100 隻大腸桿菌進行統計，依實驗數據可以發現未照射紫外光大腸桿菌楊氏模 數約為 0.484Mpa(圖 4.16)，照射紫外光強度 17.28 J cm2 的大腸桿菌的楊氏模數 約為 0.345Mpa(圖 4.17)。照射後的大腸桿菌楊氏模數明顯下降，這與傳統原子力 顯微鏡的結果相同。將兩天實驗數據做圖來確認實驗的重複性，如圖 4.18 與 4.19。. 圖 4.17 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌楊氏模數分佈圖. 圖 4.16 未照射紫外光大腸桿菌 楊氏模數分佈圖. 12. Day1 Day2. 10. 10. 8. 8. 6. 6. %. %. 12. 20 UV 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Young’s modulus (Mpa). Day1 Day2. 4. 4. 2. 2. 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Young’s modulus (Mpa). 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Young’s modulus (Mpa). 圖 4.19 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌兩日實驗楊氏模數分佈圖. 圖 4.18 未照射紫外光大腸桿菌 兩日實驗楊氏模數分佈圖. 44.
(53) 4.4 吸附力變化 選取未照射紫外光 100 隻大腸桿菌，與照射紫外光強度 17.28 J cm2 的 100 隻大腸桿菌進行統計，可以發現未照射紫外光大腸桿菌吸附力約為 0.788nN(圖 4.20)，照射紫外光強度 17.28 J cm2 的大腸桿菌的吸附力約為 0.522nN(圖 4.21)。 可以看到大腸桿菌表面的吸附力，受到紫外光照射後，吸附力有明顯的下降，這 和傳統原子力顯微鏡的結果也相當。 恆定力輕敲式掃描模式與傳統原子力顯微鏡的差異，傳統原子力顯微鏡是在 大氣環境下量測，在大氣環境當中吸附力主要來自於毛細現象，但是恆定力輕敲 式掃描模式是在液態環境的量測，此時吸附力主要是來自於探針與細菌表面物質 的影響，由於細菌表面的脂多醣層是長鏈結構，會與探針脫離時產生影響，所以 吸附力的下降，更可以直接的看出細菌表面的脂多醣層受到破壞。將兩天實驗數 據做圖來確認實驗的重複性，如圖 4.22 與 4.23。. 15. E.coli. 12. 12. 9. 9 Count. Count. 15. 6. 6. 3. 3. 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Adhesive force (nN). 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Adhesive force (nN). 圖 4.21 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌吸附力分佈圖. 圖 4.20 未照射紫外光大腸桿菌 吸附力分佈圖 12 10. 12. Day1 Day2. 10. 8. 8. 6. 6. %. %. UV. Day1 Day2. 4. 4. 2. 2. 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Adhesive force (nN). 0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Adhesive force (nN). 圖 4.22 未照射紫外光大腸桿菌 兩日實驗吸附力分佈圖. 圖 4.23 照射紫外光強度 17.28 J cm2 大腸桿菌兩日實驗吸附分佈圖. 45.
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