細胞PKR磷酸激在D型肝炎病毒蛋白之磷酸化及RNA複製的角色(2/3)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

細胞 PKR 磷酸激 在 D 型肝炎病毒蛋白之磷酸化及 RNA

複製的角色(2/3)

一. HDAC 影響 SHDAg 在細胞內表現的位置

欲了解 SHDAg 被 hyper-deacetylation 後，是否會改變此 SHDAg 蛋白質位於細胞內的位置，因此，我們取目前已知的 HDAC1-8 （histone deacetyl- transferase）蛋白質，分別與會表現 SHDAg 的質體 進行 cotransfection 到 Huh-7 細胞中，並進一步觀察 SHDAg 於細胞內 表現的位置。單獨表現 SHDAg 於細胞株時， SHDAg 表現於核仁的 細胞株有 84%，16%擴散於整個細胞核。分別共同轉染 HDAC1-8 和 SHDAg 的質體，發現許多 SHDAg 會受 HDAC 影響，導致 nucleolus 所積聚的 SHDAg 散佈到細胞核質中，其中當細胞同時表現 SHDAg 和 HDAC2-8，80%以上的細胞所生產的 SHDAg 會擴散於細胞核質 內，少數低於 20% 細胞的 SHDAg 會聚集在細胞核仁中，HDAC1 和 SHDAg 共同表現的細胞株，有 59%的細胞株 SHDAg 表現於細胞核 質中。因此，我們推測，可能 SHDAg 的 nucleolus localization signal 被 HDAC 所破壞掉了，當中發現極少數 HDAC4 和 SHDAg 共同表現 於細胞質中，而且位置相同。

二. SHDAg 突變株在細胞內位置的影響

我們可以取點突變在 nucleolin binding seguence 區域的 SHDAg 蛋 白質，分列如下之 S-HDAgL38R、S-HDAgL39R、S-HDAgL40R、 S-HDAgL42R 、 S-HDAgL43R 、 S-HDAgL72R 、 S-HDAgL38-40R 、

S-HDAgL39,40R、S-HDAgL42,43R、S-HDAgL38,43R 突變蛋白質， 共同轉染 HDAC，然後用免疫染色觀察細胞內 S-HDAg 的表現位置， 發現除了 S-HDAgL72R 外，其他的突變株蛋白質依然表現於細胞核 中，同時細胞型態多處於細胞分裂期。 三. 偵測共同轉染 HDAC4 和 HDV2G 或 HDV2AG 於細胞株中的 SHDAg 表現 分別共同轉染 HDAC4 和 HDV2G 的質體到細胞株，發現 SHDAg 會受 HDAC4 影響，導致表現於細胞核質中，或表現於細胞質中的現 象，同時與在細胞質中的 HDAC4 有 co-localization 的情形，其發生 的比率還需更近一步研究，當共同轉染 HDAC4 和 HDV2AG 的質體 到細胞株內，我們發現同樣的情形。另外我們還需更近一步觀察除了 HDAC4 以外，是否還會有相同的情況發生。 四. 偵測共同轉染 HDAC4 和 HDV2G72R 或 HDV2AG72R 於細胞株 中的 SHDAg 表現 轉 染 的 HDV2G72R 或 HDV2AG72R 會 在 複 製 過 程 中 表 現 SHDAgL72R 的基因體，因此我們用免疫染色法觀察細胞內有 HDAC4 表現時，發現細胞質內所表現的 SHDAgL72R 會與細胞執中 HDAC4 有 co-localization 現象，不過研究正在進行中，需更近一步統計其發 生的比率。 同時須研究其他的 HDAC 對此的影響。

四. HDAC 對細胞內 HDV 複製所造成的影響

我們將 HDAC1-8 的八種型態，分別與會表現 genomic HDV 以及 anti-genomic HDV 的質體 ，共同轉染到 Huh-7 細胞，於兩天和四天 後，抽取細胞內的 RNA 和蛋白質，試圖研究 HDV 在這個複製過程 中，是否受到 HDAC 的影響，初步結果發現每一類 HDAC 對複製中 的 HDV genomic 或 anti-genomic RNA 表現量，影響不顯著，而 SHDAg 在細胞內的表現量和控制組相當。