中藥複方應用在緩和去卵巢小鼠更年期綜合症的治療策略

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(1)國立台灣師範大學生命科學系碩士論文. 中藥複方應用在緩和去卵巢小鼠更年期綜合症的治療策略 Therapeutic strategy to attenuate climacteric syndrome by using Chinese herbal formula in ovariectomized mice.. 研究生：許羽岑 Yu-Tsen Hsu 指導教授：吳忠信博士 Chung-Hsin Wu. Ph.D.. 中華民國 106 年 6 月.

(2) 目錄目錄. 1. 圖表目錄. 3. 誌謝. 4. 縮寫表. 5. 中文摘要. 6. ABSTRACT. 7. 第一章緒言. 9. 1. 停經症候群. 10. 2 超氧歧化酶 2. 10. 3. 雌激素接受器與黃體素接受器. 11. 4. B401 中藥配方. 13. 第二章研究目的. 15. 第三章材料方法. 17. 1. 實驗動物準備. 18. 2. 中藥複合物B401. 19. 3. 血流量分析. 19. 4. 血液中活性氧類分析. 19. 1.

(3) 5. 血液生化值分析. 20. 6. 免疫組織化學染色. 20. 7. 西方墨點法. 21. 8. 統計分析. 24. 第四章實驗結果. 25. 1. B401中藥對去卵巢小鼠子宮重量及體重的影響. 26. 2. B401中藥對去卵巢小鼠血流情形的影響. 27. 3. B401中藥對去卵巢小鼠體內氧化自由基的影響. 27. 4. B401中藥對去卵巢小鼠子宮中超氧歧化酶2表現量的影響. 28. 5. B401中藥對去卵巢小鼠子宮中雌激素及黃體素接受器表現. 29 量的影響. 第五章討論. 32. 第六章結論. 37. 參考文獻. 39. 實驗圖表. 46. 2.

(4) 圖表目錄圖 1. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠子宮重量及體重影響之實驗 47 結果圖圖 2. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠血流量的影響之統計圖 49. 圖 3. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠血液中氧化自由基的影響之 51 統計圖圖 4. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠子宮中超氧歧化酶 2 表現量 53 的影響之統計圖圖 5. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠子宮中雌激素及黃體素接受 55 器表現量的影響之統計圖. 3.

(5) 誌謝. 首先是要感謝恩師吳忠信教授兩年來對我的細心指導及給予許多寶貴的建議，使我受益良多，以順利在兩年內學取不少老師的研究經驗，並完成碩士論文，謹此致上最深摯謝忱，提攜勉勵之情，畢生永難忘懷。從一踏入實驗室，就前前後後受了清隆學長、淳任學長、志翔學長、雪娥學姐以及睿芝姐的不少幫忙，從他們身上學了許多他們研究數年的實驗方法、步驟及技術，感謝他們總是很十分耐心的帶領我前進。最後，感謝我的家人及朋友，總是在我感到疲憊或迷惘時，給我支持及鼓勵，讓我有力量及勇氣做完每件事。. 4.

(6) 縮寫表 ER. estrogen receptor. OVT. ovariectomize. DNA. deoxyribonucleic acid. GPR30. G protein-coupled receptor 30. ER-X. estrogen receptor-X. ERK. extracellular signal-regulated kinase. ERE. estrogen response element. AP1. activator protein 1. PR. progesterone receptors. ERK. extracellular signal-regulated kinase. EDTA. ethylenediaminetetraacetic acid. SDS. sodium dodecyl sulfate. PBS. phosphate buffered solution. ANOVA. analysis of variance. ROS. reactive oxygen species. SOD2. Superoxide dismutase 2. SEM. standard error of the mean. 5.

(7) 摘要. 女性族群到達了一定年紀，會經歷因月經逐漸減少甚至停止進而引發的各種併發症，例如：肥胖、子宮萎縮、體內氧化壓力增加、血液循環變差、體內雌激素及黃體素接受器表現量發生改變等等。隨著全球逐漸高齡化的趨勢，再加上女性族群平均壽命又高於男性族群。未來，更年期婦女的相關問題勢必成為相當重要的課題。目前常用於治療更年期症狀的西藥卻有不少副作用，因此我們想嘗試副作用較為緩和的中草藥。中藥複合物 B401 含有六種中藥成分：人參、黃耆、當歸、地黃、旱蓮草及女貞子，本實驗主要是探討中藥複合物 B401 是否能改善停經症候群的症狀。首先將去卵巢 (ovariectomize) 小鼠分成四組：控制組分別餵食 B401 和二次水，以及去卵巢組分別餵食 B401 和二次水。餵食 B401 的組別均每天以餵食針餵食 30 毫克/每公斤體重的 B401，餵食持續十天，之後檢測小鼠的子宮重量、體重、體表血流量、活性氧類 (reactive oxygen species, ROS)、子宮中超氧歧化酶 (superoxide dismutase 2, SOD2)、雌激素接受器 α / β (estrogen receptor, ER α / β) 與黃體素接受器 (progesterone receptor, PR) 的表現量。研究結果顯示，餵食中藥複合物 B401 不僅減緩去卵巢導致的小鼠子宮重量、血流、SOD2、ERβ 以及 PR 的減少，也可顯著降低去卵巢鼠體內的自由基、子宮中 ERα 表現量。結果證實，中藥複合物 B401 可以作為改善更年期婦女之不適症狀的健康補給品。關鍵字：傳統中藥、停經症候群、去卵巢小鼠、植物雌激素. 6.

(8) Abstract. Women will go through some complications, such as obesity, uterine shrinking, increase in oxidative stress, decrease in blood flow, change in the expression of estrogen and progesterone receptor, etc, for peri- and postmenopausal women when they come to the certain age. Along with the aging tendency in the world, and female average life expectancy is higher than male, climacteric syndromes is going to be an important issue in the future, but the Modern Medicine which was usually used to treat them got lots of side effects. We, therefore, intend to try more moderate traditional Chinese medicine. To evaluate the estrogenic effect of the Chinese herbal formula B401, we examined uterine weight, body weight, blood flow, ROS (reactive oxygen species), SOD2 (superoxide dismutase 2), estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) activation by B401 treatment in vivo ovariectomized mice. The female mice were randomized into four groups: Sham operated group (Sham), saline treated ovariectomized group (OVT) and B401 treated ovariectomized group (B401+OVT). The B401+OVT mice were oral treated with B401 at a dose of 30 mg/kg bw/day for 10 days. Our results showed that oral treatment with the Chinese herbal formula B401 significantly reversed ovariectomy-induced uterine weight reduction. Moreover, the Chinese herbal formula B401 oral treatment significantly increased blood flow, expression of ERβ and PR in the uterus, and decrease in ovariectomized mice ROS, expression of ERα and SOD2 in the uterus. Taken our data together, we suggested 7.

(9) that B401 oral treatment could be protective and beneficial for the management of menopausal symptoms.. Key words: traditional Chinese medicine, menopause, ovariectomy, ovariectomized mice. 8.

(10) 第一章緒言. 9.

(11) 一、停經症候群 Climacteric syndrome 女性族群隨著年紀的增加，一般到了 40-55 歲左右 (Palacios et al., 2010)，卵巢功能會逐漸衰退導致體內雌激素 (estrogen) 分泌量減少，月經也會逐漸停止，稱為更年期 (menopause)。更年期前期，女性族群的生殖週期常會變得不規律，即經期長短不一或出血量發生變化，並伴隨有：熱潮紅、冒汗、焦慮、憂鬱、疲倦、情緒起伏大、失眠、記憶流失、陰道乾燥及關節疼痛……等症狀，稱為停經症候群 (climacteric syndrome)。另外，根據過去的研究發現更年期亦有更多的影響：胰島素阻抗、肥胖、脂肪組織發炎、肝硬化以及內臟脂肪增多，甚至罹患心血管疾病及乳癌的機率也上升 (Kim et al., 2012; Lee et al., 2016; Roepke et al., 2011)。. 二、超氧歧化酶 Superoxide dismutase 2 超氧歧化酶 2 (Superoxide dismutase 2, SOD2)，是一種錳依賴性的酵素，在體內擔任抗氧化劑的重要角色，會結合電子傳遞鏈中氧化磷酸化作用產生的對身體有害之超氧附產品，將其轉變為較穩定且不易破壞細胞的過氧化氫以及氧分子，這樣的作用可以讓 SOD2 清除粒線體中的 ROS，進而去阻止細胞凋亡的進程。 10.

(12) 三、雌激素接受器與黃體素接受器 Estrogen receptor and Progesterone receptor 雌激素，是一類主要由女性卵巢分泌的女性激素，能調控體內能量恆定、身體核心溫度 (core body temperature)、骨質重塑、保護神經系統，在臨床上則被用來當作口服避孕藥、不孕症治療以及停經後的荷爾蒙治療。細胞核內的雌激素接受器 (Estrogen receptor, ER) 或是細胞膜上的 GPR30 (G protein-coupled receptor 30) 會與 17α-雌二醇 (17α-estradiol) 和 17β-雌二醇 (17β-estradiol) 結合，接著，被活化的細胞膜上接受器 ER-X 會傳遞訊息並作用在標的組織 (Kim et al., 2012; Cui et al., 2013; Yang, 2008)。雌激素接受器主要的兩個種類為 ERα 以及 ERβ，兩者都有很多異構型，分別在特定組織上展現其功效，並且和一些組織的病理生理有關，包括癌症 (例如：乳癌、子宮內膜癌、前列腺癌以及大腸直腸癌)、心血管疾病、代謝性疾病、認知障礙 (例如：阿茲海默氏症) 以及骨質疏鬆症。ERα 主要功能是轉換增殖反應，在肝細胞及大腦中海馬迴的神經細胞表現量高；而 ERβ 則是抑制反應，在前列腺、卵巢及肺的表現量較高；至於在乳腺、骨骼、子宮、中樞神經系統及心血管系統，兩者的表現量則是旗鼓相當，且會互相影響彼此的功能 (Martinkovich et al., 2014; Panno and Giordano, 2014)。雌激 11.

(13) 素可以激活許多蛋白激酶路徑 (protein kinase pathways)，包含 MAPK/ERK (extracellular signal-regulated kinase) 以及 PI3/Akt (protein kinase B) 路徑 (Marco et al., 2015)，進而有多種模式來調控基因轉錄，首先可在雌激素和接受器結合作用後，其複合物會和啟動子 (promoter) 上的雌激素反應元件 (estrogen response element, ERE) 結合去促使轉錄作用；或是與 Activator protein 1 (AP1) site 上的 fos/jun 轉錄因子複合物作用去促使基因表現 (Franck, 2011; Nilsson, 2001)。雌激素接受器共由六個 domains 所組成，而其 N 端可以形成二聚體，且具有 ligand-independent activation function (AF1) domain (A/B domain)。這些訊息傳遞鏈活化後，會使 ERα 的 AF-1 domain 磷酸化 (Kim et al., 2012; Wang et al., 2015)。所以當雌激素需要開始作用時，雌激素接受器會事先表現以作準備 (Cohen I et al., 1997)，即可透過測量雌激素接受器的表現量來得知雌激素的作用情形。黃體素，又稱為助孕素或助孕酮，是一種由卵巢分泌的類固醇激素，同樣也是參與許多生殖功能的調節，包含性行為及子宮內膜厚度的維持等等，並且會與雌激素共同輔佐去影響神經興奮性、學習以及神經膠細胞 (glial cells) 的腫瘤增生 (neoplastic proliferation)，而這些黃體素的作用都需要與核內的黃體素接受器 12.

(14) (progesterone receptors, PR) 產生交互作用才可順利生效 (Tavares et al.,2016)。當黃體素需要開始作用時，黃體素接受器會事先表現以作準備，即可透過測量黃體素接受器的表現量來得知黃體素的作用情形。另外由於黃體素接受器的合成主要受雌激素的調控，檢驗在目標組織中此接受器的表現也代表雌激素的活化程度 (Cohen I et al., 1997)。. 四、 B401 中藥配方中藥複合物 B401 是由「財團法人台灣必安研究所」所研發出之中藥配方，在台灣、美國、德國、中國以及香港均有提出專利申請審核通過。此配方含有六種中藥，包含：人參、黃耆、當歸、地黃、旱蓮草及女貞子，也已經證實可以緩解神經退化性疾病及心血管疾病 (Weil et al, 2000)。有許多生藥及中藥都能緩解停經後症狀，像是青蜂草 (Balm)、黑生麻 (Black Cohosh)、聖潔莓 (Chasteberry)、當歸 (Dong Quai)、月見草油 (Evening Primrose Oil)、銀杏 (Ginkgo)、人參 (Ginseng)、甘草 (Licorice Root)、西番蓮 (Passion Flower)、鼠尾草 (Sage)、金絲桃草 (St. John’s wort)、墨西哥菝葜 (Sarsaparilla) 以及纈草 (Valerian root) 等等含有植物雌激素 (Phytoestrogens) 的藥材。而其 13.

(15) 中，當歸在傳統藥材中被用於改善女性之熱潮紅、乳房脹痛、經痛及經期混亂，但其單獨使用於停經後女性，結果並無顯著改善其血管舒縮症狀 (Vasomotor symptoms)。至於人參則被發現可以降低去卵巢鼠的肥胖、血中胰島素濃度、血糖、血中三酸甘油脂、麩胺酸草醋酸轉胺酶 (glutamate oxaloacetate transaminase, GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺酶 (glutamic-pyruvic transaminase, GPT)、肝中脂肪堆積、脂肪組織重量以及脂肪細胞大小 (Kim et al., 2012; Lee et al., 2016; Roepke et al., 2011)，也可顯著提高子宮重量及 ERα 的磷酸化反應，進而引起乳癌細胞內的細胞外訊息調節激酶 (extracellular signalregulated kinase, ERK) 以及蛋白激酶 B (protein kinase B, Akt) 磷酸化 (Kim et al., 2012)。. 14.

(16) 第二章研究目的. 15.

(17) 中藥複合物 B401 的配方含有六種中藥，包含：人參、黃耆、當歸、地黃、旱蓮草及女貞子。其中，人參具有類雌激素之特性，當歸與地黃則是治療月經不調的四物湯成分，而中藥「二至丸」的成分：旱蓮草及女貞子，也具有降低月經量之功能，黃耆成分中的 β谷甾醇 (β-sitosterol) 則具有降低血中膽固醇之功能。雖然 B401 已經證實可以緩解神經退化性疾病及心血管疾病，但其配方中的中藥成分具有上述與月經週期相關調節的功效，因此餵食中藥複合物 B401 可能有助於改善女性的停經症候群。. 16.

(18) 第三章材料與方法. 17.

(19) 一、實驗動物準備首先，向樂斯科生物科技股份有限公司 (臺灣，台北市) 購買 10 週大且分別進行去卵巢或進行去卵巢假手術的 ICR 品系小鼠，手術均在送達實驗室前一天執行，送達後再給予小鼠普通正常飼料使之自由攝食並置於常溫下 (25 ± 2℃) 飼養一週後即可開始餵藥。選擇飼養一週後再開始實驗是由於小鼠方才接受去卵巢手術，體內與雌性生殖相關機制正要開始衰退，正好符合女性正要準備停經時的身體狀態。接著將小鼠分成四組：假手術+餵二次水 (控制組)、假手術+餵 B401、去卵巢+餵二次水以及去卵巢+餵 B401。B401 以二次水配製，劑量為 30 mg/kg bw/day，而餵二次水的組別則是餵食與 B401 溶液相同體積的二次水，再使用灌胃針分別餵食十天，每天均測量其體重，餵食十天後分別檢驗其自由基、血流及血液生化值分析，再犧牲取子宮做秤重、西方墨點法以及免疫組織化學染色分析。本實驗所使用之動物相關實驗方法均依循國際之實驗動物使用及照顧相關方法，也通過國立台灣師範大學實驗動物使用及照護委員會之審查。. 18.

(20) 二、中藥複合物 B401 中藥複合物 B401 是由「財團法人台灣必安研究所」研究開發，且提出專利申請審核通過：台灣專利號碼：第 I 329491 號；美國專利號碼：US 7,838,048 B2。B401 含有六種成分的中藥，包含：人參、黃耆、當歸、地黃、旱蓮草以及女貞子，以特定比例混合而成，且已開發成產品被用來當作健康食品食用。. 三、血流量分析由於更年期女性族群體內血液循環可能會變差，所以本研究中利用雷射都卜勒血流儀 (moorFLPI full field blood perfusion imaging system; Moor Instruments, USA) 量測各個不同處理組別老鼠體表的血流情形。待測之小鼠可先測完小鼠體表血流量，趁其尚未從麻醉狀態清醒前再抽血測量 ROS 量。. 四、血液中活性氧類 (ROS, Reactive oxygen species) 分析本研究中利用自由基冷光測定儀 (CLA-ID3 Chemiluminescence Analyzer; Tohoku Electronic Indust, Japan) 量測各個不同處理組別老鼠體內的活性氧及過氧化氫的活性。測量前先用 Urethane (0.004 mg / g bw) 進行腹腔注射麻醉小鼠，等待其失去意識後，用膠帶固定老 19.

(21) 鼠四肢，採仰躺姿勢，並進行保溫使其肛溫維持在 37℃，再抽取血液等待測量。本研究中測量 180 秒的瞬間自由基冷光量，先扣除各點前 30 秒之基準值再取其曲線下的面積即為總自由基冷光量。. 五、血液生化值分析麻醉老鼠，準備灌流取組織前，先以針筒抽取尾巴、眼窩及心臟之血液，先行靜置凝血再取血離心 (3000 rpm; 5min)，離心後蒐集血清統一交由中一醫事檢驗所做血液生化值分析，分析項目含有： FSH (follicle-stimulating hormone)、LH (Luteinizing hormone) 以及雌二醇 (Estradiol, E2)，但均未達到可檢出之濃度範圍。. 六、免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry) 餵食中藥複合物 B401 十天後，利用麻醉犧牲小鼠並用生理食鹽水灌流後取其子宮。再用 10%中性福馬林浸泡固定組織，之後將組織做成蠟塊後，用旋轉式精密切片機 (Leica RM 2135) 切成 4~7 μm 的切片，使其附著於載玻片上。脫蠟後加入抗原修復液再以水浴法加熱 20 分鐘，並使用 protein block (Leica, polymer detection system) 以及相對應的抗體進行免疫組織切片染色。配製子宮組織切片免疫染色所需之相關抗體：Estrogen Receptor α ( sc-7207; Santa 20.

(22) Cruz Bioteechnology Inc., Dallas, USA)、Estrogen Receptor β ( GTX112927; GeneTex Inc., Hsinchu, Taiwan) 以及 Superoxide dismutase 2 ( #13141; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, USA)。之後，將玻片用磷酸鹽緩衝生理鹽水 (PBS, phosphate buffered solution) 沖洗 10 分鐘，再使用二級抗體作用 30 分鐘，以 PBS 沖洗 10 分鐘後，加入 NoVolink polymer (Leica, polymer detection system) 反應 30 分鐘，以 PBS 沖洗 10 分鐘後再加入 DAB chromogen 作用 5 分鐘，接著以 PBS 沖洗 10 分鐘後加入 Hematoxylin solution (Leica, polymer detection system) 反應 8 分鐘，最後用流水沖洗背面 10 分鐘之後再進行脫水及封片。. 七、西方墨點法 (Western blot assay) 餵食中藥複合物 B401 十天後，犧牲小鼠並取其子宮，在含有 0.05 M 三羥甲基氨基甲烷 (tris (hydroxymethyl) aminomethane, Tris, pH 8.0, Bionovas, Washington DC, USA)、0.15M 氯化鈉 (NaCl, Bionovas, Washington DC, USA)、0.02M 乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA, Bionovas, Washington DC, USA)、1% 去氧膽酸 (deoxycholic acid, Bionovas, Washington DC, USA)、1% 乙基苯基聚乙二醇 P40 (nonidet P40, Bionovas, Washington DC, USA)、0.1%十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl 21.

(23) sulfate, SDS, Bionovas, Washington DC, USA)、1% 蛋白酶抑制劑混合液 (protease inhibitor cocktail for full range, Bionovas, Washington DC, USA)、1% 絲胺酸/羥丁胺酸磷酸酶抑制劑混合液 (serine/threonine phosphatase inhibitor cocktail, Bionovas, Washington DC, USA) 以及 1% 酪胺酸磷酸酶抑制劑混合液 (tyrosine phosphatase inhibitor cocktail, Bionovas, Washington DC, USA) 的混合溶液中用剪刀將子宮剪碎均質化，而溶液的量依照組織重量而定 (組織：溶液= 100 mg：700-1000μl)。均質化之後，均質液平放在冰上用震盪器 (50 rpm) 震盪 3-4 小時，再於 4℃環境下以離心機離心 (13,000 rpm) 10 分鐘後吸取上清液，即為蛋白質原液。而蛋白質原液利用 BCA 蛋白質定量試劑組 (BCA protein assay kit, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) 再用光電比色計 (Microplate Spectrophotometer, uQuant, BioTek Instruments, Inc., Vermont, USA) 於 562 nm 處測定其吸光值定量其蛋白質濃度。接著取 50 微克蛋白質加入 5X dye ，含有 0.25M 三羥甲基氨基甲烷鹽酸 (tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), pH 6.8, Bionovas, Washington DC, USA)、10% 十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate, SDS, Bionovas, Washington DC, USA)、0.5%溴酚藍 (bromophenol blue, Washington DC, USA)、50% 甘油 (glycerol, Bionovas, Washington DC, USA) 以及 5% 2-巰基乙醇 (beta22.

(24) mercaptoethanol, Bionovas, Washington DC, USA)，並在 95℃下加熱五分鐘使蛋白質變性。再於 12.5% 的十二烷基硫酸鈉聚積膠體 (discontinuous sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE) -polyacrylamide gel) 下進行蛋白質電泳分離。接著將分離的蛋白質於 100 伏特、300 毫安培以及 90 分鐘條件下，從膠體轉移到 0.2μm 的聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride, PVDF, GE Healthcare Life Science, Barrington, Illinois, USA) 膜上。接著，以 PBS-T buffer 配製的 5% 脫脂牛奶 (blocking buffer) 於室溫下作用兩小時，即可阻擋其他非目標的蛋白質結合。配製子宮組織相關抗體：Estrogen Receptor α ( sc-7207; Santa Cruz Bioteechnology Inc., Dallas, USA)、Estrogen Receptor β ( GTX112927; GeneTex Inc., Hsinchu, Taiwan)、Progesterone Receptor ( sc-538; Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, USA) 以及 Superoxide dismutase 2 ( #13141; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, USA)。再準備做為相對定量標準化之相關抗體，包含 Tubulin-α ( #MS-581; Thermo Fisher Scientic Inc, Waltham, USA)、β-actin ( #4970; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, USA) 以及 GAPDH ( #5174; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, USA) 於室溫下與聚偏二氟乙烯膜作用兩小時 (或是於 4℃環境下過夜) 後再以 PBS-T buffer 與震盪器震盪洗三次，每次十分鐘。二級抗體則包含 anti-rabbit IgG-HRP 23.

(25) (1:5000 dilution; PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) 與 antimouse IgG-HRP (1:5000 dilution; PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) 於室溫下作用兩小時，同樣以 PBS-T buffer 與震盪器震盪洗三次，每次均十分鐘。接著，以 ECL Western blotting detection reagents (GE Healthcare Life Science, Barrington, Illinois, USA) 使之顯色，再開啟冷光影像分析系統 LAS-4000 (GE Healthcare Life Science, Barrington, Illinois, USA) 使之顯色，再開啟冷光影像分析系統 LAS4000 (GE Healthcare Life Science, Barrington, Illinois, USA) 進行檢測，最後使用 Image J 軟體 (version 1.48t, Wayne Rasnabd, Washington DC, USA) 進行定量分析。. 八、統計分析所有的實驗數值都是用平均値±平均值標準誤差來表示。而統計方法則是以單因子變異數分析 (one-way ANOVA)，再以 Tukey 事後檢定比較做分析。P<0.05 即為顯著誤差。. 24.

(26) 第四章實驗結果. 25.

(27) 一、 B401 中藥對去卵巢小鼠子宮重量及體重的影響子宮是一種女性重要的器官，所以檢測去卵巢小鼠體內子宮的重量及形態，並且觀察 B401 中藥是否能減緩去卵巢導致的子宮萎縮。餵食 B401 或二次水之後，將小鼠犧牲取下子宮，便秤量其重量及以相機照下子宮形態。研究結果為：控制組 (n=3) 之子宮重量平均值為 0.33 ± 0.04 gw，B401 組 (n=3) 為 0.38 ± 0.03 gw，而去卵巢餵二次水組 (n=3) 則為 0.13 ± 0.03 gw，另外去卵巢餵 B401 組 (n=3) 則為 0.27 ± 0.03 gw。從圖 1 A、B 可得知，控制組與 B401 組之間並無顯著差異；而去卵巢餵 B401 組則顯著高於去卵巢餵二次水組。由於去卵巢小鼠較易肥胖，也想利用 B401 中藥來檢測是否能減緩其體重增加的趨勢，所以每天分別餵食正常小鼠及去卵巢小鼠 B401 中藥以及二次水前均先測量小鼠的體重，為期 10 天。預期結果應是，去卵巢小鼠的體重有顯著較多，而餵食 B401 的組別則可以減緩體重較高之趨勢。但研究結果卻顯示四組小鼠第一天體重為：控制組 (n=5) 之子宮重量平均值為 29.68 ± 0.56 gw，B401 組 (n=5) 為 29.84 ± 0.74 gw，而去卵巢餵二次水組 (n=5) 則為 29.12 ± 0.54 gw，另外去卵巢餵 B401 組 (n=5) 則為 29.44 ± 1.03 gw。至於最後一天體重顯示：控制組 (n=5) 之子宮重量平均值為 29.85 ± 0.76 26.

(28) gw，B401 組 (n=5) 為 28.68 ± 0.72 gw，而去卵巢餵二次水組 (n=5) 則為 29.70 ± 0.66 gw，另外去卵巢餵 B401 組 (n=5) 則為 29.93 ± 0.71 gw。四組的體重到最後均無顯著差異如圖 1C 所示。. 二、 B401 中藥對去卵巢小鼠血流情形的影響 B401 中藥中含有人蔘，而人蔘主要成分為人蔘皂苷 (ginsenosides) Rb1 (Hsu, 2016)，此物質已知能夠改善血液循環 (Kang, 2013)，所以以雷射都卜勒血流儀觀測去卵巢小鼠的血流情形如圖 2。檢測結果顯示：控制組 (n=3) 之血流平均值為 376.30 ± 31.29 AU，B401 組 (n=3) 為 421.70 ± 22.60 AU，而去卵巢餵二次水組 (n=3) 則為 350.03 ± 36.93 AU，另外去卵巢餵 B401 組 (n=3) 則為 519.97 ± 4.96 AU。B401 組比起控制組以及去卵巢餵 B401 比起去卵巢餵二次水組的體表血流量均顯著增加，而去卵巢組比起控制組則顯著減少，因此可得知去卵巢會降低小鼠體表血流量，餵食 B401 則可以提升小鼠體表血流量，無論是否去卵巢均如此。. 三、 B401 中藥對去卵巢小鼠體內氧化自由基的影響由於去卵巢會提升大鼠及犬隻體內的 ROS (Zhang, 2017; Mutinati, 2008)，所以以自由基冷光測定儀檢測去卵巢小鼠體內的氧化自由基是否有增加的情形，另外也檢測 B401 中藥是否能改善此 27.

(29) 現象。研究結果顯示如圖 3：控制組 (n=3) 之 ROS 量為 2703.40 ± 299.76 Total ROS count，B401 組 (n=3) 為 1738.80 ± 38.92 Total ROS count，而去卵巢餵二次水組 (n=3) 則為 4085.33 ± 285.18 Total ROS count，另外去卵巢餵 B401 組 (n=3) 則為 1761.00 ± 45.982 Total ROS count。去卵巢+餵二次水組比起控制組的氧化自由基有顯著較高，而去卵巢+餵 B401 組比起去卵巢+餵二次水組則是顯著較低，所以餵 B401 是可以改善去卵巢小鼠體內氧化自由基的增加情形。. 四、 B401 中藥對去卵巢小鼠子宮中超氧歧化酶 2 表現量的影響從上一小節的結果得知，去卵巢可以增加小鼠體內的氧化自由基壓力，餵食 B401 則可以降低，所以也想觀察去卵巢及餵食 B401 小鼠子宮內的超氧歧化酶 2 是否也有相同結果。而研究結果如圖 4 所示：控制組 (n=3) 之 SOD2 表現量為 1.08 ± 0.04，B401 組 (n=3) 為 1.16 ± 0.02，而去卵巢餵二次水組 (n=3) 則為 0.76 ± 0.01，另外去卵巢餵 B401 組 (n=3) 則為 0.95 ± 0.05。去卵巢+餵二次水組比起控制組以及去卵巢+餵 B401 比起 B401 組的 SOD2 顯著較低；去卵巢+餵 B401 組比起去卵巢+餵二次水組則顯著較高，所以餵食 B401 是可以提升去卵巢小鼠子宮中 SOD2 表現量。 28.

(30) 五、 B401 中藥對去卵巢小鼠子宮中雌激素及黃體素接受器表現量的影響對於雌性哺乳類來說，與生殖相關且能產生作用的器官除了卵巢以外，即為子宮；參與此作用的主要固醇類激素為雌激素以及黃體素。雌激素的主要標的組織為成人的子宮，不僅可刺激細胞分化，也可提高子宮對於黃體素的敏感度，使身體可順利進行子宮內膜蛻膜化 (decidualization) 以及著床 (implantation)，而這些作用均需依靠雌激素接受器 α 以及 β。有其他研究發現，子宮中 ERβ 的表現量普遍上都較 ERα 低；而在未成熟母鼠的子宮中卻發現，ERα 與 ERβ 的表現量是相當的，至於子宮基質跟上皮大部分的細胞都是表現 ERβ，若在未成熟母鼠子宮中同時 ERβ 喪失也功能，即會導致其細胞分化的指標 Ki-67 表現量上升，並提升雌激素的參與反應，所以 ERβ 就扮演一個預防子宮營養缺乏的角色。在去除 ERα 基因的母鼠體內，雌激素會沒辦法順利的提升子宮重量、子宮營養、子宮中細胞分化、保持吸水性以及血量充足，所以 ERβ 在子宮內只扮演一個次要調節角色，而 ERα 則在雌激素作用於子宮上扮演主要調控角色 (Weihua et al., 2000; Frasor et al., 2003)。由於將母鼠去卵巢會影響其體內雌激素的產生及分泌，而雌激素的作用機制又與雌激素接受器息息相關，所以進而可能會影響雌 29.

(31) 激素接受器的數目。有其它研究顯示，齧齒類動物在去卵巢後 ERβ 的表現量以及大鼠去卵巢後海馬迴內 ERβ 的表現量增加 (Handa, 2012; Chung et al., 2007) ，而在對鹽敏感的去卵巢大鼠腎臟中的 ERα 表現量會下降，ERβ 上升；對鹽不敏感的去卵巢大鼠腎臟中則是 ERα、ERβ 表現量都上升 (Esqueda et al., 2007)，另外去卵巢的美國約克夏豬血小板中的 ERα 以及 ERβ 的表現量也有顯著增加的現象 (Jayachandran & Miller, 2002)，還有 Sutaehwan-Gami 可以提高 MCF7 人類乳癌細胞中 ERα 磷酸化量 (Kim et al., 2012)。所以本實驗主要觀察小鼠子宮內 ERα 以及 β 的表現量是否與正常母鼠有差，以及餵食 B401 中藥後是否能夠改善去卵巢所造成小鼠子宮內雌激素接受器表現量的差異。研究結果顯示如圖 5：控制組 (n=3) 之 ERα 表現量為 1.09 ± 0.13，B401 組 (n=3) 為 1.76 ± 0.04，而去卵巢餵二次水組 (n=3) 則為 7.31 ± 0.44，另外去卵巢餵 B401 組 (n=3) 則為 4.62 ± 0.38。去卵巢組比起控制組以及去卵巢+餵 B401 組比起 B401 組，ERα 的表現量有顯著較高；而去卵巢+餵 B401 組比起去卵巢組的 ERα 表現量則有顯著較低 (圖 5Bb)，所以 B401 可以改善去卵巢導致的 ERα 表現量增加。至於 ERβ 的部分：控制組 (n=3) 之 ERβ 表現量為 1.04 ± 0.06，B401 組 (n=3) 為 1.17 ± 0.01，而去卵巢餵二次水組 (n=3) 則為 0.63 ± 0.06，另外去卵巢餵 B401 組 (n=3) 則為 30.

(32) 1.07 ± 0.04。去卵巢組比起控制組有顯著較低，且去卵巢+餵 B401 組比起去卵巢組有顯著較高，所以去卵巢可以降低小鼠體內 ERβ 表現量，而餵食 B401 則可改善此現象，使 ERβ 表現量回升 (圖 5Db)。而雌激素的作用不僅會影響雌激素接受器也會影響黃體素接受器之表現量，有其他研究顯示，去卵巢並不會使大鼠腦中的內室交叉核 (Medial Preoptic nucleus, MPN) 的 PR 表現量顯著增加，但給予雌二醇治療後卻可以顯著提升去卵巢大鼠體內的 PR 表現量 (Lund et al., 2005)。所以除了雌激素接受器也要檢測去卵巢小鼠子宮中黃體素接受器的表現量是否有差異，並順帶了解 B401 是否會對其有顯著的改善作用。研究結果顯示：控制組 (n=3) 之 PR 表現量為 1.05 ± 0.11，B401 組 (n=3) 為 2.42 ± 0.04，而去卵巢餵二次水組 (n=3) 則為 0.88 ± 0.01，另外去卵巢餵 B401 組 (n=3) 則為 2.05 ± 0.04。餵 B401 組比起控制組以及去卵巢+餵 B401 組比起去卵巢組均有顯著較高的表現量，而去卵巢+餵 B401 組比起餵 B401 組則有顯著較低，所以去卵巢可以降低小鼠體內 PR 表現量，而餵食 B401 則可改善此現象，使 PR 表現量回升 (圖 5Fb)。. 31.

(33) 第五章討論. 32.

(34) 去卵巢手術是一種使實驗動物達到人類女性更年期狀態的標準技術，而卵巢被去除後，除了會導致小鼠體內雌激素濃度迅速減少，而造成有肥胖、肝硬化 (Lee et al., 2016) 、骨質疏鬆 (Ahmed et al., 2010; Jagtap et al., 2011) 之情形，也可能會有失眠的症狀發生。而我們再利用中藥 B401 去改善去卵巢造成的症狀。我們的研究結果顯示，去卵巢手術後餵食 B401 或二次水 10 天之中，各組的體重均未達到顯著差異。由於有其他文獻指出去卵巢手術 14 週後會造成肥胖現象 (Lee et al., 2016)，而我們又假設 B401 能夠改善去卵巢導致的各種併發症，所以我們預期結果應是去卵巢手術的小鼠之體重應要顯著高於未去卵巢者；而餵食 B401 中藥者則要能顯著低於餵二次水的組別。但我們的結果卻不如預期，可能是觀察體重的天數太少，10 天的變化尚很微弱，若拉長觀察時間可能可以觀察到顯著差異。有其他研究指出，去卵巢會使大鼠的子宮萎縮以及子宮重量減少，而餵食某種草藥成分 Sutaehwan-Gami 或給予雌激素治療則可以改善此現象，可以保護子宮並使得子宮重量回升 (Kim et al., 2012; Chen & Kalu, 1998)。控制組與 B401 組之間並無顯著差異；而去卵巢餵 B401 組則顯著高於去卵巢餵二次水組，是符合預期的結果。. 33.

(35) 雌激素在女性體內扮演很重要的保護角色，可以協助調控體內血液循環，也能減少女性發生心血管疾病的機率 (Sarrel, 1990)。所以若女性先天卵巢功能發育不全、手術切除卵巢或是到了一定年紀進入更年期時，發生心血管疾病的風險便大幅增加。雌激素也能直接影響血管壁的生理機能，使得血管擴張以及血流增加，進而造成血壓下降。有其他研究證實，在為更年期女性進行雌激素治療後，確實能夠增加體內之血流 (Mercuro et al., 1999)。所以我們的預期結果應為，去卵巢能夠顯著降低小鼠之血流，B401 中藥能夠改善此情形提升小鼠血流情形。而我們實際檢測結果為，B401 組比起控制組以及去卵巢餵 B401 比起去卵巢餵二次水組的體表血流量均顯著增加，而去卵巢組比起控制組則顯著減少，因此可得知去卵巢會降低小鼠體表血流量，餵食 B401 則可以提升小鼠體表血流量，無論是否去卵巢均如此，是符合預期結果。去卵巢已經有其他研究證實會使大鼠以及犬隻體內的 ROS 增加 (Zhang, 2017; Mutinati, 2008)，所以我們的預期結果為去卵巢應顯著增加小鼠體內 ROS，餵食 B401 則要能改善此情形。而我們的研究結果為，去卵巢+餵二次水組比起控制組的氧化自由基有顯著較高，而去卵巢+餵 B401 組比起去卵巢+餵二次水組則是顯著較低，所以餵 B401 是可以改善去卵巢小鼠體內氧化自由基的增加情形，此結 34.

(36) 果的確與預期結果相符。而既然去卵巢小鼠體內的 ROS 有達到預期結果，那麼我們也想測試小鼠子宮中 SOD2 的表現量是否也達到預期，SOD2 表現量的預期結果為，去卵巢組應有顯著較低的 SOD2 表現量，而餵食 B401 則能改善此現象，使 SOD2 的表現量回升。我們的研究結果為，去卵巢+餵二次水組比起控制組以及去卵巢+餵 B401 比起 B401 組的 SOD2 有顯著較低；去卵巢+餵 B401 組比起去卵巢+餵二次水組則有顯著較高，此結果是與預期相符的。我們的研究結果顯示，B401 可以減緩去卵巢導致的 ERα 表現量增加；而 ERβ 表現量的結果則為，去卵巢可以降低小鼠體內 ERβ 表現量，餵食 B401 則可改善此現象，使 ERβ 表現量回升；另外 PR 表現量的部分為，去卵巢可以降低小鼠體內 PR 表現量，而餵食 B401 則可改善此現象，使 PR 表現量回升。ERα 及 ERβ 在去卵巢小鼠中的表現量都應顯著上升，PR 顯著下降，B401 則是需要減緩這些現象，而我們的結果 ERα 以及 PR 均是符合預期，只有 ERβ 是與預期結果相反。ERα 的表現量在去卵巢後會有增加的情形，我們認為是由於去卵巢後小鼠體內的雌激素的濃度下降，而身體為了要盡快恢復正常作用所以代償性的使子宮內的 ERα 增加。ERβ 的表現量在去卵巢後有減少的現象，我們認為是因為 ERβ 本身的功能為抑 35.

(37) 制反應，而在小鼠去卵巢後體內對於雌激素的抑制反應已經過多，所以進而調控使 ERβ 表現量減少以減少過多的抑制反應。另外，PR 在去卵巢後表現量有下降是由於小鼠去卵巢後體內黃體素濃度逐漸減少最終已經幾乎消失殆盡，沒有黃體素去刺激的 PR 即會導致 PR 的衰退。所以在我們研究的結果顯示，去卵巢會導致小鼠血液中子宮重量、血流、子宮中 SOD2、ERβ 以及 PR 的表現量減少，也會增加去卵巢鼠體內的自由基、子宮中 ERα 表現量，而餵食 B401 中藥後都能確實改善去卵巢造成的生理機能上的改變。結果證實，B401 是可以改善更年期婦女之不適症狀。. 36.

(38) 第六章結論. 37.

(39) 在本實驗中，我們使用中藥複方 B401 餵食去卵巢小鼠是想治療其去卵巢導致的停經症狀，包含肥胖、子宮萎縮、體表血流量減少、氧化自由基增加以及女性激素接受器數量的改變。而研究結果可得知，去卵巢手術或是餵食 B401 無法改變小鼠的體重，但去卵巢卻可使小鼠的子宮萎縮、體表血流量降低、體內 ROS 增加、子宮中 SOD2、ERβ、PR 表現量降低已及 ERα 表現量增加，中藥複方 B401 則可以改善這些去卵巢導致的變化，不僅可以減緩去卵巢小鼠的子宮萎縮，也可以使去卵巢小鼠的體表血流量增加、體內 ROS 降低、子宮中 SOD2、ERβ、PR 表現量增加以及降低 ERα 表現量。我們認為，中藥複方 B401 是一種女性潛在的健康補充品，可以緩解停經所導致的不適症狀，使停經後女性之身體狀況更加健康。. 38.

(40) 參考文獻. 39.

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(47) 實驗圖表. 46.

(48) 47.

(49) 圖 1. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠子宮重量及體重影響之實驗結果圖。(A) 為小鼠餵食完 B401 或二次水並犧牲取出子宮，再以相機照出的影像。四個子宮由左到右依序是：(a) Sham 為做假手術+餵二次水；B401 為做假手術+餵 B401 中藥；(b) OVT 代表去卵巢+餵二次水；而 OVT+B401 則代表去卵巢+餵 B401 中藥。 (B) 為小鼠餵食完 B401 或二次水並犧牲取出子宮，再分別測量其重量。縱軸為小鼠之子宮重量，單位為公克重；橫軸為四個實驗組別：(a) Sham、B401、(b) OVT 以及 OVT+B401。各組檢測出來的數值均由平均值±平均值標準誤差（standard error of the mean, SEM）來表示，且用二因子變異數分析 (two-way analysis of variance, ANOVA) 以及 S-N-K 多重差距檢定 (Student-Newman-Keuls multiple range test ) 來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。(C) 餵食 B401 期間每天測量各組之體重變化。縱軸為小鼠之體重，單位為公克重；橫軸為餵食 B401 的天數。四條以不同圖案組成的線分別是四組實驗小鼠：Sham (圓形)、 B401 (菱形)、OVT (方型) 以及 OVT+B401 (三角型)。以上各點為每組當天的平均值。. 48.

(50) 49.

(51) 圖 2. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠血流量的影響之統計圖。(A) 為雷射都卜勒血流儀顯示出來的血流影像，分別為：Sham、B401、OVT 以及 OVT+B401。顯色越紅代表該處血流量越多，反之越藍則代表血流量越低，將影像分色量化後則為下方小圖，而小圖下方之數值則為儀器本身計算出的血流數值，另外各組檢測並統計出來的平均值±平均值標準誤差（SEM）均表示在 (B) 圖，是用二因子變異數分析 (two-way ANOVA) 以及 S50. N-K 多重差距檢定 (Student-Newman-Keuls multiple range test ) 來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用 **p<0.01 以及*p<0.05 表示。.

(52) 51.

(53) 圖 3. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠血液中氧化自由基的影響之統計圖。(A) 為自由基冷光測定儀檢測出來 180 秒期間每 10 秒的瞬間氧化自由基變化時間軸，分別為：OVT (方形)、Sham (菱形)、OVT+B401 (三角形) 以及 B401 (圓形)。縱軸為瞬間自由基冷光量；橫軸則為時間軸。將第 60 秒開始曲線扣掉各點前 30 秒之面積，累積後之數據則為 (B) 圖所示，縱軸為自由基冷光量；橫軸則分別為實驗的四個組別：Sham、B401、OVT. 52. 以及 OVT+B401。各組檢測出來的數值均由平均值±平均值標準誤差（SEM）來表示，且用二因子變異數分析 (two-way ANOVA) 以及 S-N-K 多重差距檢定 (Student-Newman-Keuls multiple range test ) 來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。.

(54) 53.

(55) 圖 4. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠子宮中超氧歧化酶 2 表現量的影響之統計圖。組別均分為四組：Sham、B401、 OVT 以及 OVT+B401。(A) 為利用西方墨點法分析小鼠子宮中的超氧歧化酶表現量所製出的圖，SOD2 標示為超氧歧化酶表現情形，分子量位於 22 kDa；至於 β-actin 則是被用來當作此次分析的基準值，位於 42 kDa。每條圖下的四個數值則為四個組別各自的表現量平均值。將此圖量化後則為 (B) 圖所呈現。(B) 為將超氧歧化酶相對表現量除以 β-actin 的表現量而呈現出來的柱狀圖。各組檢測出來的數值均由平均值±平均值 54. 標準誤差（SEM）來表示，且用二因子變異數分析 (two-way ANOVA) 以及 S-N-K 多重差距檢定 (StudentNewman-Keuls multiple range test ) 來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及*p<0.05 表示。.

(56) 55.

(57) 56.

(58) 57.

(59) 圖 5. 餵食 B401 對於去卵巢小鼠子宮中雌激素及黃體素接受器表現量的影響之統計圖。組別均分為四組：Sham、 B401、OVT 以及 OVT+B401。(A) 為利用免疫組織化學染色分析小鼠子宮中雌激素接受器 α 接受器 (棕色部分) 的分佈情形所製出的圖。(B) 則為利用西方墨點法分析小鼠子宮中的雌激素接受器 α 接受器表現量所製出的圖，(a) ERα 標示雌激素接受器 α 的表現情形，其分子量位於 66 kDa；至於 β-actin 則是被用來當作此次 58. 分析的基準值，位於 42 kDa。每條圖下的四個數值則為四個組別各自的表現量平均值。將此圖量化後則為 (b) 圖所呈現。(b) 為將雌激素接受器 α 相對表現量除以 β-actin 的表現量而呈現出來的柱狀圖。(C) 為利用免疫組織化學染色分析小鼠子宮中雌激素接受器 β 接受器 (棕色部分) 的分佈情形所製出的圖。(B) 則為利用西方墨點法分析小鼠子宮中的雌激素接受器 β 接受器表現量所製出的圖，分析雌激素接受器 β 的表現量則為 (a) 圖所示， ERβ 標示雌激素接受器 β 的表現情形，其分子量位於 59 kDa；至於 β-actin 則是被用來當作此次分析的基準值，位於 42 kDa。每條圖下的四個數值則為四個組別各自的表現量平均值。將此圖量化後則.

(60) 為 (b) 圖所呈現，(b) 為將雌激素接受器 β 相對表現量除以 β-actin 的表現量而呈現出來的柱狀圖。(E) 為利用免疫組織化學染色分析小鼠子宮中黃體素接受器 (棕色部分) 的分佈情形所製出的圖。(F) 則為利用西方墨點法分析小鼠子宮中的黃體素接受器表現量所製出的圖，至於分析黃體素接受器的表現量則為 (a) 圖所示， PR 標示黃體素接受器的表現情形，其分子量位於 116 kDa；至於 β-actin 則是被用來當作此次分析的基準值，位於 42 kDa。每條圖下的四個數值則為四個組別各自的表現量平均值。將此圖量化後則為 (b) 圖所 59. 呈現。(b) 為將黃體素接受器相對表現量除以 β-actin 的表現量而呈現出來的柱狀圖。各組檢測出來的數值均由平均值±平均值標準誤差（SEM）來表示，且用二因子變異數分析 (two-way ANOVA) 以及 S-N-K 多重差距檢定 (Student-Newman-Keuls multiple range test ) 來分析是否有顯著誤差，若有顯著誤差則用**p<0.01 以及 *p<0.05 表示。.

(61)