49
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
☆
☆
圖一、 (A)小柴胡湯(水萃取)處理 HepG2 細胞株之生長曲線
於96孔盤上每孔接種1104HepG2細胞,經隔夜培養貼附之後,加入 小柴胡湯(水萃取)濃度分別為1、2、10、20及50µg/mL,時間分別 為24、48及72小時,當實驗到達各待測時間點時,於每孔加入5l MTT,並於37℃下反應3小時,次將孔盤內培養液吸出,再加入100l DMSO以完全溶解紫紅色結晶物,利用OD570測量吸光值,並以未加 入細胞只加DMSO的孔當作空白背景值,以藥物處理之細胞存活率作 為vehicle control(100%),於相同施藥時間,不同濃度間之存活率換 算為百分比,平均值為三次獨立實驗的換算結果,error bar為standard errors (*,p<0.05;#,p<0.01;☆,p<0.001分別代表由student t-test 所換算出具統計意義的結果)。50
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100 120
*
☆
☆
☆
☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100 120
*
☆
☆
☆
☆
☆
圖一、(B)小柴胡湯(70%酒精萃取)處理 HepG2 細胞株 之生長曲線
實驗方法同前述。
51
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (% )
0 20 40 60 80 100 120
#
# #
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (% )
0 20 40 60 80 100 120
#
# #
圖一、(C)柴胡加龍骨牡蠣湯處理 HepG2 細胞株之生長曲 線
實驗方法同前述。
52
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100 120
*
☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100 120
*
☆
☆
圖一、(D)核桃承氣湯處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。53
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
#
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
#
圖一、(E)半夏厚朴湯處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。54
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
☆
*
#
* ☆
*
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
☆
*
#
* ☆
*
圖一、(F)香蘇散處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。55
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.5 1.1 5.4 10.1 25.2
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
100 #
*
☆
*
#
☆
*
#
☆
*
#
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.5 1.1 5.4 10.1 25.2
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
100 #
*
☆
*
#
☆
*
#
☆
*
#
圖一、(G)黃連解毒湯處理 HepG2 細胞株之生長曲線
唯濃度分別為 0.5、1.1、5.4、10.1 及 25.2µg/mL,實驗方法同前述。
56
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.3 0.6 2.9 5.7 14.3
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
#
* ☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.3 0.6 2.9 5.7 14.3
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
#
* ☆
圖一、(H)紫蘇葉處理 HepG2 細胞株之生長曲線
唯濃度分別為 0.3、0.6、2.9、5.7 及 14.3µg/mL,實驗方法同前述。
57
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.1 0.3 1.4 2.7 6.8
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
☆
*
☆
☆
☆
☆
☆☆
☆
☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.1 0.3 1.4 2.7 6.8
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
☆
*
☆
☆
☆
☆
☆☆
☆
☆
☆
圖一、(I)黃連處理 HepG2 細胞株之生長曲線
唯濃度分別為 0.1、0.3、1.4、2.7 及 6.8µg/mL,實驗方法同前述。
58
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
☆
*
☆
☆
☆
☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
☆
*
☆
☆
☆
☆
☆
圖一、(J)石上柏處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。59
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
#
#
☆
# ☆ #
☆ ☆ ☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
#
#
☆
# ☆ #
☆ ☆ ☆
圖一、(K)夏枯草處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。60
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
*
# #
☆
#
☆ ☆
☆
☆
☆
☆
# #
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
*
# #
☆
#
☆ ☆
☆
☆
☆
☆
# #
圖一、(L)鴨膽子處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。61
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
☆
*
#
☆
*
☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
☆
*
#
☆
*
☆
☆
圖一、(M)山慈菇處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。62
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
#
# ☆
☆
#
* ☆
#
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
#
# ☆
☆
#
* ☆
#
☆
圖一、(N)苦參處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。63
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
☆
#
☆
#
#
☆ ☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
#
☆
#
☆
#
#
☆ ☆
☆
圖一、(O)黃獨處理 HepG2 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。64
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
#
☆ ☆☆
☆ ☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
#
☆ ☆☆
☆ ☆
☆
圖二、(A)香蘇散處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。65
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.5 1.1 5.4 10.1 25.2
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
*
#
*
* *
*
*
*
#
*
#
*
*
*
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.5 1.1 5.4 10.1 25.2
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
*
#
*
* *
*
*
*
#
*
#
*
*
*
圖二、(B)黃連解毒湯處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
唯濃度分別為 0.5、1.1、5.4、10.1 及 25.2µg/mL,實驗方法同前述。
66
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.3 0.6 2.9 5.7 14.3
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
#
*
* #
#
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.3 0.6 2.9 5.7 14.3
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
#
*
* #
#
圖二、(C)紫蘇葉處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
唯濃度分別為 0.3、0.6、2.9、5.7 及 14.3µg/mL,實驗方法同前述。
67
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.1 0.3 1.4 2.7 6.8
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
#
☆
#
☆
☆
#
☆
#
☆ ☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 0.1 0.3 1.4 2.7 6.8
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
#
☆
#
☆
☆
#
☆
#
☆ ☆
圖二、(D)黃連處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
唯濃度分別為 0.1、0.3、1.4、2.7 及 6.8µg/mL,實驗方法同前述。
68
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
*
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
#
*
圖二、(E)石上柏處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。69
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
# #
#
#
#
#
# ☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80 100
☆
*
# #
#
#
#
#
# ☆
圖二、(F)夏枯草處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。70
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
* ☆ *
☆
☆
☆
☆ ☆ ☆
☆
☆ ☆
☆ ☆
☆
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c el l v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
* ☆ *
☆
☆
☆
☆ ☆ ☆
☆
☆ ☆
☆ ☆
☆
圖二、(G)鴨膽子處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。71
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (% )
0 20 40 60 80 100
*
Concentration of herbal extract (g/mL)
0 1 2 10 20 50
R e la ti v e c e ll v ia b il it y (% )
0 20 40 60 80 100
*
圖二、(H)山慈菇處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。72
Concentration of herbal extract ( g/mL)
0 1 2 10 20 50
R el a ti v e ce ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
* #
*
#
# #
#
Concentration of herbal extract ( g/mL)
0 1 2 10 20 50
R el a ti v e ce ll v ia b il it y (%
0 20 40 60 80
☆
*
* #
*
#
# #
#
圖二、(I)苦參處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。73
Concentration of herbal extract ( g/mL)
0 1 2 10 20 50
R el a ti v e ce ll v ia b il it y (% )
0 20 40 60 80 100
☆*
# #
#
*
☆
☆
#
Concentration of herbal extract ( g/mL)
0 1 2 10 20 50
R el a ti v e ce ll v ia b il it y (% )
0 20 40 60 80 100
☆*
# #
#
*
☆
☆
#
圖二、(J)黃獨處理 Huh 7 細胞株之生長曲線
實驗方法同前述。74
藥物(g/mL)
控制組
黃連解毒湯(10.1)
黃連(2.7)
香蘇散(20)
紫蘇葉(5.7)
炙甘草(2.8)
陳皮(1.4)
細 胞 通 透 數 ( 1 0 4 )
0 2 4 6
☆
*
#
*
☆
☆
☆
*
#
*
☆
☆
藥物(g/mL)
控制組
黃連解毒湯(10.1)
黃連(2.7)
香蘇散(20)
紫蘇葉(5.7)
炙甘草(2.8)
陳皮(1.4)
細 胞 通 透 數 ( 1 0 4 )
0 2 4 6
☆
*
#
*
☆
☆
☆
*
#
*
☆
☆
圖三、HepG2 細胞侵犯能力實驗結果
接種 5104HepG2 細胞於100 lMatrigel (Becton-Dickinson) 上隨 後一起置入insert內,於24孔盤隔夜貼附培養,加入黃連解毒湯2.7
g/mL、黃連10.1 g/mL、香蘇散20 g/mL、紫蘇葉5.7 g/mL、炙甘 草2.8g/mL及陳皮1.4g/mL,施以藥物24小時後,收取下層貼附於孔 盤的細胞,與未加藥物之控制組相比可得知細胞侵犯力及活動能力的 情形。平均值為三次獨立實驗的換算結果,error bar為standard errors (*,p<0.05;#,p<0.01;☆,p<0.001分別代表由student t-test所換 算出具統計意義的結果)。統計分析以控制組與不同藥物間相比。
75
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
藥物(g/mL)
控制組
黃連(2.7)
紫蘇葉(5.7)
石上柏(20)
夏 草(20)
鴨膽子(20)
苦參(20)
黃獨(20)
山慈菇(20)
細 胞 通 透 數 ( 1 0
4)
0 2 4 6 8
枯
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
藥物(g/mL)
控制組
黃連(2.7)
紫蘇葉(5.7)
石上柏(20)
夏 草(20)
鴨膽子(20)
苦參(20)
黃獨(20)
山慈菇(20)
細 胞 通 透 數 ( 1 0
4)
0 2 4 6 8
枯
藥物(g/mL)
控制組
黃連(2.7)
紫蘇葉(5.7)
石上柏(20)
夏 草(20)
鴨膽子(20)
苦參(20)
黃獨(20)
山慈菇(20)
細 胞 通 透 數 ( 1 0
4)
0 2 4 6 8
枯
☆
☆
☆
☆
☆
☆
☆
圖四、中藥單方對HepG2 細胞侵犯能力實驗結果
實驗方法、統計如前述,唯石上柏、夏枯草、鴨膽子、苦參、黃獨和 山慈菇萃取液(濃度均為20g/mL)。
76
藥物種類(濃度g/mL)
控制組
黃連解毒湯(10.1)
黃連(2.7)
香蘇散(20)
紫蘇葉(5.7)
石上柏(20)
夏 草(20)
細 胞 通 透 數 ( 1 0 4 )
0 2 4 6 8 10
枯
☆
☆
☆ ☆
☆
☆
藥物種類(濃度g/mL)
控制組
黃連解毒湯(10.1)
黃連(2.7)
香蘇散(20)
紫蘇葉(5.7)
石上柏(20)
夏 草(20)
細 胞 通 透 數 ( 1 0 4 )
0 2 4 6 8 10
枯
藥物種類(濃度g/mL)
控制組
黃連解毒湯(10.1)
黃連(2.7)
香蘇散(20)
紫蘇葉(5.7)
石上柏(20)
夏 草(20)
細 胞 通 透 數 ( 1 0 4 )
0 2 4 6 8 10
枯
☆
☆
☆ ☆
☆
☆
圖五、Huh 7 細胞侵犯能力實驗結果
接種 5104Huh 7 細胞於100lMatrigel (Becton-Dickinson) 上一起 置入insert內,在24孔盤內隔夜貼附培養,加入黃連解毒湯、黃連、
香蘇散、紫蘇葉、石上柏及夏枯草萃取液(濃度同前述)施以藥物24 小時後,收取下層貼附於孔盤的細胞,與未加藥物相比可得知細胞侵 犯力及活動能力的情形。
77
MMP-9
GAPDH VEGF 92→
92→
46→
37→
β-catenin MMP-9
GAPDH VEGF 92→
92→
46→
37→
VEGF 92→
92→
46→
37→
β-catenin
圖六、複方及其有效單方處理HepG2之血管新生相關蛋白表 現
接種 1× 106HepG2細胞於6公分培養盤內。施以香蘇散10μg/mL、紫 蘇葉2.9μg/mL、黃連解毒湯5.4μg/mL及黃連1.4μg/mL後,於24及48小 時萃取蛋白質,經SDS-PAGE轉漬到Nitrocellulose transfer membrane 上,以MMP-9、β-catenin、VEGF及GAPDH抗體雜交,後以
goat-anti-rabbit二級抗體雜交,再以ImmobilonTMWestern
Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore)呈色並以冷光儀顯相。
kDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h
78
圖七、中藥單方處理HepG2之血管新生相關蛋白表現
接種 1× 106HepG2細胞於6公分培養盤內。施以石上柏、夏枯草、鴨 膽子、山慈菇、苦參及黃獨濃度均為10μg/mL後,於24及48小時萃取 蛋白質,經SDS-PAGE轉漬到Nitrocellulose transfer membrane上,以 MMP-9、β-catenin、VEGF及GAPDH抗體雜交,後以goat-anti-rabbit 二級抗體雜交,再以ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore)呈色並以冷光儀顯相。
KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 2 4 48 h
MMP-9
GAPDH VEGF 92→
92→
46→
37→
β-catenin KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 2 4 48 h
MMP-9
GAPDH VEGF 92→
92→
46→
37→
β-catenin
KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 h
79
圖八、複方及其有效單方處理Huh 7之血管新生相關蛋白表 現
接種 1× 106Huh 7細胞於6公分培養盤內。施以香蘇散10μg/ml、紫蘇 葉2.9μg/mL、黃連解毒湯 5.4μg/mL、黃連1.4μg/mL後,於24、48、
72小時萃取蛋白質,經SDS-PAGE轉漬到Nitrocellulose transfer membrane上,以MMP-9、β-catenin及GAPDH抗體雜交,後以 goat-anti-rabbit二級抗體雜交,再以ImmobilonTMWestern
Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore)呈色並以冷光儀顯相。
MMP-9
GAPDH kDa 0 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 h
92→
92→
37→
β-catenin MMP-9
GAPDH kDa 0 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 h
92→
92→
37→
β-catenin
KDa 0 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 h
80
圖九、中藥單方處理 Huh 7 之血管新生相關蛋白表現
接種 1× 106Huh 7細胞於6公分培養盤內。施以石上柏、夏枯草、鴨 膽子、山慈菇、苦參及黃獨以10μg/mL後,於24及48小時萃取蛋白質,
經SDS-PAGE轉漬到Nitrocellulose transfer membrane上,以MMP-9、
β-catenin及GAPDH抗體雜交,後以goat-anti-rabbit二級抗體雜交,再 以ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore)呈 色並以冷光儀顯相。
MMP-9
GAPDH KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 h
92→
92→
37→
β-catenin MMP-9
GAPDH KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 h
92→
92→
37→
β-catenin
KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 h
81
圖十、MMP-9 PCR偵測中藥複方對於HepG2之RNA表現
接種 2 × 106HepG2細胞於10公分培養盤內。施以黃連解毒湯5.4μg/mL、香蘇散10μg/mL後,培養24、48、72小時後,萃取RNA,
利用MMP-9、GAPDH primers經PCR放大基因表現量,以6%
polyacrylamide電泳分析PCR產物。
0 24 48 72 24 48 72 h + - + - + - + - + - + - + - (RT) 537bp→
256bp→
MMP-9
GAPDH
82
kDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h
MMP-9
MMP-2 92→
72→
kDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h kDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h
MMP-9
MMP-2 92→
72→
圖十一、複方及其有效單方對於 HepG2 之 MMP 活性測試
接種 1× 106HepG2 細胞於 6 公分培養盤內。施以香蘇散 10 μg/ml、 紫蘇葉 2.9μg/mL、黃連解毒湯 5.4μg/mL及黃連 1.4μg/mL,經過 24、48 小時後,收取細胞培養液 經 SDS-PAGE 後以 2.5%Triton X-100 清 洗膠體以除去 SDS ,加入反應緩衝液於 37℃作用 18 小時,再以 Coomassie Brilliant Blue R250,染色並退染,最後利用 Fuji Image Reader LAS-3000 拍照顯影。
KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h
83
kDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h 92→
72→
MMP-9
MMP-2 kDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h
kDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h 92→
72→
MMP-9
MMP-2
圖十二、鴨膽子與苦參對於 HepG2 之 MMP 活性測試
實驗方法同前述,使用藥物為鴨膽子 10 和 20 μg/ml及苦參 10 和 20μg/mL。KDa 0 24 48 24 48 24 48 24 48 h