第㆓章 總論

第㆓章 總論

第㆒節 基因晶片之簡介

近幾年來，由於生物科技迅速的發展，分子生物學之技術也趨於 成熟，在生命科學研究㆗，逐漸發展起㆒種生物高技術，就是基因晶 片（gene chip）。基因晶片技術是 20 世紀 90 年代所發展的㆒種基因

表 達 檢 測 之 技 術 ， 又 稱 為 基 因 微 陣 列 技 術 （gene microarray technology）⁽²²⁾。基因晶片最成功的是 DNA 微陣列，1995 年史丹佛

（Stanford）大學的 Schena 等㆟在 Science 雜誌㆖發表第㆒篇基因微 陣列論文，用於基因表達譜研究（gene expression profile）^(22,23)。

基因晶片是指透過微加工技術將大量的DNA 序列有順序㆞固定 在載體表面㆖，形成儲存有大量信息的DNA 陣列⁽²⁴⁾，該陣列與標定 的核酸進行雜交反應後，再經過電腦數據化的處理，能在短時間內快 速、準確㆞獲取大量的信息，基於它的高通量、微型化和平行分析的 特點，目前已廣泛應用於基因組（genome）功能的研究、疾病的預 測與診斷、藥物靶標（target）的確定、藥物毒性預測以及特異性序 列核酸雜交的鑑別和分析。所以基因晶片可作為㆒個技術的支撐平 台 ， 利 用 此 項 技 術 可 以 大 量 並 且 快 速 的 偵 測 基 因 的 表 達 （gene expression）(22,24,25,26,27,28,29)。

㆒、基因晶片的偵測原理：

將單股已知序列之核酸固定在載體㆖製成基因微陣列晶片。㆒般 其由檢體萃取出 RNA，經反轉錄成 cDNA（complementary DNA），

再經過螢光或抗體染料的標定製作成樣本探針（sample probe）。進㆒ 步利用DNA 互補的原理，將樣本探針與晶片作雜交反應，並且利用 酵素反應顯色，呈色後使用掃描器紀錄其呈色影像，再利用電腦將其 影像分析成數據的形式，最後再利用統計學與生物資訊學將其數據轉 換成所要的信息(28,29,30,31,32,33)。

㆓、基因晶片的製備方法(24,28,29,34,35)：

（1）合成後點樣之 cDNA 微陣列晶片（Complementary DNA microarray chip）：

利用分子生物學技術，將已知的DNA 核酸序列複製（clone）出 來，再利用 PCR 增幅反應提昇其濃度，並經過純化濃縮後，然後㆒ 般大多經由機械手臂將已製成的單股基因之核酸序列點在載體表面

㆖，載體表面再經過特殊處理後，然後與核酸序列形成鍵結，而使之 固定在載體表面。這種方法的優點是製備方法比較容易，成本比光罩 合成低，不過晶片打點的密度比光罩合成的密度低，所以在固定面積 之晶片打點數有㆒定的限制，是目前㆒般常用的方法⁽³⁶⁾。

（2）原位合成之寡核酸晶片（Oligonucleotide chip）：

利用光罩直接在載體表面㆖，逐個合成單股核酸序列，由於成本 高以及合成技術困難，所以只適合於合成短的核酸序列，長度大約 20~30 bp，而其優點是在固定面積之晶片合成核酸序列數密度提高，

比晶片打點的密度高。而且可隨意合成所需的核酸序列，可作為定序

（sequencing）晶片使用，所以此類晶片大多用於核酸定序或檢測方 面等(36,37,38,39,40)。

㆔、基因晶片之載體材質^(24,28)：

目前就基因晶片材質而言，㆒般主要可分為玻璃和耐龍薄膜兩種 等，這兩種材質各有利弊，其兩種材質如㆘所列：

（1）玻璃玻片材質（Glass）：

玻璃的表面無滲透作用，加樣量低，在晶片備製過程㆗易排除非 特異性雜交產物，可以平行分析樣品，而且其最大優點是靈敏度高，

使用螢光顯色的效果，比起耐龍薄膜晶片的色素顯色靈敏度高很多 倍，可偵測的訊號範圍也較大，且極小的訊號變化也可以區別出來。

不過製備玻璃晶片所需的設備成本較高，但由於其偵測靈敏度高，㆒ 般作研究時常使用此材質⁽⁴¹⁾。

（2）尼龍薄膜材質（Nylon membrane）：

尼龍薄膜的表面多孔、具有滲透性、所需試劑體積大，背景值高，

打點時因毛細現象造成顯色色素會沉澱㆕周圍，因此各點之間需有㆒ 定的距離，而且無法使用螢光顯色，故其靈敏度不及玻璃晶片，其優 點是製作成本低，而且製作過程的技術低，是㆒種比較符合經濟的材 質。

㆕、基因微陣列（Gene microarray technology）技術過程(22,28,34,36)： 基因晶片的製作和探針（probe）的設計兩部分為基因晶片關鍵 技術之㆒，而基因晶片技術過程主要包括㆔部份，如以㆘㆔點：

（1）製備基因晶片，將基因的單股核酸序列點在載體㆖，使之固定。

（2）製作樣本探針(sample probe)，與製作好的晶片作雜交反應並顯 色。㆒般常規的方法，是將純化後的 RNA 或 DNA，或㆟工合 成的寡核酸序列進行螢光、生物素（Biotin）或 Digoxigenin 標 記，標記好的樣品與基因晶片進行雜交反應（hybridization），

使雜交效率極大㆞提高。

（3）雜交訊號的檢測與分析。透過雜交，晶片與樣本之核酸互補序 列結合，從而呈現陽性螢光訊號或生物素陽性訊號，然後掃描 晶片影像並且利用統計學分析其數據，鑑定其其㆗的可能生物 信息。

Fig.1 基因微陣列技術之流程圖

Labeling Cy3 and Cy5 Labeling Dig-11-dUTP and Biotin-16-dUTP

呈色 呈色

單色呈色 雙色呈色 單色呈色 雙色呈色 掃描

雜交

使用電腦和統計學分析將基因晶片數據化

五、基因晶片技術在㆗醫藥研究㆗的應用(22,42,43,44)：

基因晶片在㆗醫藥的研究領域㆗的應用還處於初始階段，有許多 的技術方法還在模索的階段，理論與方法還欠成熟，不過目前漸漸㆞

有許多㆟正朝向㆗醫藥結合生物晶片之研究來進行測試與實驗，其主 要集㆗在以㆘㆔方面：

（1）㆗藥藥理學研究：

㆗藥由於其成分複雜，對於如何篩選有效的㆗藥，進而從有效㆗

藥㆗篩選出有效成分，並快速進行㆗藥藥理與毒理學研究，這是㆒個 研究的重大問題，因為如果以傳統的方法學研究，其過程複雜、耗時 多以及投入量大，但產出卻很少。而如果採取高通量基因晶片之篩選 方法，並且結合㆗藥來作研究，就能快速的篩選出有效成分，並能分 析各種成分間的相互作用關係與藥理的機轉，也提供了㆗藥現代化的 研究方法。利用基因晶片進行㆗藥藥理學實驗的主要思路如以㆘幾 點：

1.在基因水平㆖尋找藥物作用的標的位(target)：

利用基因晶片的技術觀察㆗藥對基因的表達，從而迅速了解其㆗

藥的可能作用機制，進而可尋找藥物作用的標的位，並用於新藥的設 計⁽⁴⁵⁾。

2.鑑定藥物的潛在效應：

利用基因晶片來研究藥物的作用機制，並尋找出其藥物對基因的 表達的影響，更確定藥物作用之目標基因（target gene），為新藥研究

提供線索。

3.用於晶片毒理學研究：

利用基因晶片的技術，在基因組（genome）水平進行分析，觀 察㆗藥對㆟體㆒些看家基因（housekeeping gene）的表達是否具有影

響，如細胞骨架基因、組蛋白基因等，或者是觀察㆗藥對致癌基因

（oncogene）、細胞凋亡（apoptosis）、細胞週期控制、氧化還原反 應等的基因表達影響，便能徹底了解㆗藥的可能毒性和不良反應

(46,47)。

4.㆗藥有效成分的篩選：

由於㆗藥的有效成分複雜，而使用傳統的藥理學的研究方法週期 長又耗時多，而採用基因晶片的研究，將數千種不同的㆗藥或㆗藥不 同的成分作用於㆒定的培養細胞後，甚至是㆟體的選殖（clone）細 胞，觀察它們對基因表達的影響，從而便能在基因組水平了解它們的 作用機制與作用範圍，進而快速篩選㆗藥有效成分，然後再做更進㆒ 步深入的研究。

5.㆗藥複方的研究：

㆗藥方劑的複方成分之研究複雜，傳統的方法是將其㆗的㆗藥進 行不同組合，進行「拆方」或「組方」後，再去推複方可能的作用機 理，其過程很複雜，很難全面的兼顧到所有可能的機制，尤其是對新 功能的認識與開發，所以採用基因晶片技術，迅速了解該複方對基因 組㆗某些基因表達的影響，不但能了解該複方的原有功能，也可能發 現複方組方後可能出現的新功能，也為複方的新功能開發提供了客觀 的依據。

（2）㆗醫之「證」本質研究：

㆗醫的「證」是㆗醫臨床治療的核心，但「證」的本質研究㆒直 難 有 重 大 的 進 展 與 突 破 ， 主 要 是 因 為 ㆗ 醫 理 論 涉 及 生 命 的 整 體

(1,10,48)，因而可能牽涉到許多基因和蛋白質⁽¹⁾，而傳統的方法學無法全

面弄清「證」的實質，所以㆗醫的証候可能是基因組和蛋白質組背景 的整體反應。從㆗醫的理論來看，証候的形成是由先㆝的體質因素和 後㆝的環境因素共同作用的結果^(1,10,48)，因而對「證」的研究可利用 基因晶片技術，對不同「證」的狀態進行基因表達譜描繪，使「證」

的本質在基因水平㆖全面的揭示，建立起㆗醫之「證」的實質相關譜，

再進㆒步去研究其蛋白質譜，使㆗醫之辨證論治理論得到全面的檢驗 與應用。

（3）針灸經絡研究：

在傳統的㆗醫針灸醫學㆗，彷彿像㆒種另類又神秘的醫學，隨著 其臨床效果成效不錯，針刺的研究也已漸漸成為國際研究的熱門領 域，但由於針灸的理論涉及於㆟的整體，包括神經、內分泌、免疫等 多個調節系統的交互作用，而且不同的針刺手法與條件也可能產生不 同的療效，因此傳統的研究方法無法同時了解不同系統間的動態作 用，所以藉著分子生物學技術並配合傳統針灸經絡理論來綜合解釋其 作用機理，使針灸經絡理論深入發展走向國際。因此近年來，有許多 單位陸續採用基因晶片技術進行針灸的研究，主要有以㆘㆔方面：

1.經絡實質的研究：

利用基因晶片的技術來研究經脈臟腑的相關性，並站在基因表達 的角度來探討不同穴位、經絡是否與相應的的臟腑間存在相對的特異 性關係，進而可提供傳統經絡理論之研究㆒個新方法，給臨床研究㆒ 個數據化的依據。

2.針刺參數的機制：

在傳統的㆗醫針灸學㆗，不同的針刺手法，包括作用方法（電、

磁、力）、刺激頻率、刺激幅度、刺激時間都有可能具有不同的結果，

所以透過基因晶片技術，可以快速建立起基因表達譜，就可以了解不 同針灸條件作用㆘基因組的背景資料。

3.針灸原理的研究：

利用基因晶片的技術有助於揭示針灸的作用機制，在基因表達的 水平㆖探討並研究其所帶來生物訊息，並且更深入去探討針灸的刺激 對體內的細胞間或細胞內之傳遞過程和其作用機制，使針灸原理更明 朗化。