以園藝性狀與簡單重複性序列評估臺灣芥藍之遺傳歧異度

國立臺灣大學生物資源暨農學院農藝學系 碩士論文

Department of Agronomy

College of Bioresources and Agriculture

National Taiwan University Master Thesis

以園藝性狀與簡單重複性序列評估臺灣芥藍之 遺傳歧異度

Genetic Diversity among Chinese Kale in Taiwan Assessed by Horticultural Traits and SSR Markers

蔣順惠

Shun-hui Chiang

指導教授：林彥蓉 博士 Advisor：Yann-rong Lin, Ph.D.

中華民國 103 年 7 月

July, 2014

I

I

誌 謝

終於走到寫誌謝這一步了，儘管一切是多年前的自已始料未及的狀態，最後 能拿到學位是靠著太多人的幫忙和鼓勵，自己才有勇氣完成碩士學位的研修。本 試驗承蒙桃園區農業改良場之材料提供及科技計畫支持得以完成，感謝最後四位 口試委員臺大園藝暨景觀學系羅筱鳳老師、桃園區農業改良場廖芳心研究員、本 系胡凱康老師及我的指導老師林彥蓉老師等人熱心討論並給與論文許多指點。

生活上最感謝媽媽，總是耐心待我，包容我的所有的情緒，給予無盡的支持 和鼓勵。其次是我的指導老師林彥蓉老師，謝謝她總是在我要對自己失去信心的 時候，相信我、幫我加油打氣，給我無比的信心，不但是良師、也是益友，教導 我許多不一樣的思維和開放的心胸。也很感謝胡凱康老師，總是耐心地與資質魯 鈍的我討論育種和實驗上的問題。感謝我最好的朋友芳瑜、泰佑、紗紗、小濬、

最棒的學姐雅淨及最重要的朝元，沒有你們常常在旁鼓勵，接受我的任性、給我 正能量，我也無法有驚無險地走到今天。而漫長繁重的實驗過程中，幸好有 Energy 及小草學長及時的討論及建議新的實驗技術、幫忙建置設備，不然我真 的無法完成這個學位，十分感謝他們。學校實驗室一直是充滿回憶和溫暖的地方，

這些日子以來謝謝實驗室的大家，包括 NaNa、昇哥、勝偉、Hannah Pu、拉泡、

孟穎、瀞予、浩涵、東東、歆雅、柔誼、及傑超等等大家的幫忙，我才能在最後 來得及趕完實驗。工作上也感謝在桃改場各位長官對我修研學位的支持和鼓勵，

以及臺北分場各位同仁及技工大哥們在這段時間的幫忙和包容。

花了很多時間和精神走到今天，歷經自己的心情上的困鈍、工作及學業上的 困難，但也學到了很多，藉此經驗也更認識自己。希望完成這樣一個人生的里程 碑，能發揮更多所學和提升自己各方面的能力，我想也不枉經歷這些。再次感謝 大家，謝謝你們!!

蔣順惠 2014.7.30

II

中文摘要

十字花科蕓薹屬甘藍類蔬菜廣為世界各地不同民族栽培利用，而芥藍屬於其 下之變種，分類上較接近於原始型的甘藍類植物，葉片不結球且分皺葉或非皺葉，

花色有黃色和白花色兩種等植株形態多變，但一般以花色為主要區別特徵。主要 栽培於東南亞、臺灣及中國大陸等地。在臺灣以採收小葉菜用之白花芥藍及採收 花薹的黃花芥藍為栽培之主流，而品種以開放授粉之農民自留種或地方種為主，

部分葉菜用品種採用一代雜交之商業品種，因此有利於遺傳變異之保存。一般認 為芥藍與青花菜及花椰菜等等其他主流甘藍類作物相比，具有早生及耐熱之特性，

在極端天氣頻繁發生的現在，芥藍可能為甘藍類作物育種之重要資源。由了解其 種原間遺傳歧異度及遺傳結構，將有助於制定育種策略，提升育種工作之效率。

本試驗採用 25 個芥藍蒐集自臺灣各地之種原，並以 1 個青花菜商業品種作 為芥藍與近緣物種歧異度之參考。分別就外觀性狀及分子標誌多型性兩方面探討 種原間的歧異度。外觀性狀以七個性狀調查資料對 25 個芥藍種原進行主成分分 析，視覺化種原間以性狀資料建構的分類關係。另外利用 20 個簡單重覆序列

（Simple sequence repeat；SSR ）分子標誌對每個種原內 20 個個體進行對偶基 因片段之擴增。總共使用 520 株單株擴增之對偶基因以計算種原內之對偶基因頻 度進行種原間及種原內遺傳歧異度分析。

試驗結果在外觀性狀調查資料顯示芥藍種原之分類大致可按花色分為兩大 類，與過去研究相同。而 SSR 分子標誌部分之結果顯示，一代雜交種及專業種 苗商之商業品種種原間遺傳歧異度明顯低於其他農民自留種種原。而種原間包含 青花菜在內，以modified Roger’s distance 表示之遺傳距離介於 0.31–2.79，而芥 藍種原間之遺傳距離介於 0.31–2.36。而利用遺傳距離之主座標分析及 UPGMA 親緣樹圖則顯示可將種原粗略分為黃花及白花兩群，但其中仍少部分種原未按照 花色分群。結合 UPGMA 親緣樹圖及族群分化指數之結果顯示，整體芥藍種原

III

間大部分呈現高度遺傳分化，且黃花芥藍種原間遺傳距離較白花芥藍種原間大，

可能由於授粉及採種方式不同所致。此外，而黃花芥藍種原內具有兩個次群集，

白花種原內有 1 個，都是次群集內種原相似度極高可能群內種原最初來源相同。

在明確了解芥藍種原內及種原間之遺傳歧異度，能更妥善運用資源進行重要種原 維護及提供更多種原間資訊給育種者以提升育種工作之效率。

中文關鍵字：芥藍、簡單重覆性序列分子標誌、遺傳歧異度、群集分析、主座標 分析、

IV

英文摘要

Many kinds of varieties of Brassica oleracea L. has been popularly grown in the world as vegetables. Chinese kale is one of these vegetables which closely relates to primitive type Brassica oleracea L on taxonomy. The appearance of Chinese kale is various including not heading leaves, leaves curly or not etc., but generally

distinguished by flower color , white or yellow. Southern Asia, Taiwan and China are main production area. There are two main kinds of product types in Taiwan include harvesting young plant as leafy vegetable (white flower type), or cutting flowered stalk to sale (yellow flower type). The cultured varieties in Taiwan mostly come from seed propagated by farmers and commercial F1 hybrid seed for leafy vegetable used.

Therefore, it is benefit to conserve genetic diversity. It has been believe that Chinese kale is grow faster and more heat tolerance than broccoli and cauliflower. Nowadays, extreme weather frequently happened in Taiwan, therefore Chinese kale may be important breeding resource for heating tolerance of Brassica oleracea L. vegetables.

Through revealing the genetic diversity and structure between Chinese kale accessions, that would be benefit for us to decide efficient breeding procedure.

The purpose of this study was to investigate the genetic diversity and genetic structure of Chinese kale accessions in Taiwan. We used 25 Chinese kale accessions and one commercial broccoli variety as a reference of related species. 7 appearance characters of 25 Chinese kale accessions was use to classified them by Principle component analysis. Furthermor, we use 20 SSR markers to amplify total 80 alleles of total 520 individuals, which means 20 individuals per accession, for genetic diversity analysis among and within accessions.

In the result of our study, Chinese kale accessions could classified generally

V

into two groups by colors through the analysis of appearance character. It is the same conclusion of the studies in the past. On DNA level analysis, modified Roger’s

distance among all accessions was 0.31 – 2.79 and was 0.31-2.36 among Chinese kale accessions. 25 Chinese kale accessions separated into two groups when coefficient on UPGMA phylogenic tree was 1.7 and similar result was on 3D plot of principle coordinate analysis. Furthermore, Fst value and genetic distance revealed that most accessions highly differenciated with each other, but several accessions were very close related. Close related accessions formed three sub-clusters respectively, which two were in yellow-flower cluster and one was in white-flower cluster. Furthermore, the diversity of yellow flower Chinese kale accession was larger the white flower accessions especially than commercial variety. We inferred that might be the result of open-pollination propagate habit of yellow Chinese kale accessions. After we realized the genetic similarity and structure among Chinese kale accessions, we could use resources and execute breeding procedure efficiently.

keywords：Brassica oleracea L. var. alboglabra, genetic structure, SSR marker, genetic diversity, clustering analysis, principle coordinate analysis

VI

表目錄

表一、25 個參試芥藍種原及 1 個青花菜種原之來源 ... 12

表二、20 個參試 SSR 分子標誌資料 ... 15

表三、7 個性狀之變方分析表 ... 25

表四、20 個分子標誌之歧異度參數 ... 32

表五、26 個種原內之遺傳歧異度參數 ... 34

表六、26 個種原間之遺傳距離 ... 36

表七、26 個芥藍種原間族群分化指數（Fst） ... 41

VII

圖目錄

圖一、26 個芥藍種原之 7 個性狀資料分布 ... 23

圖二、7 個性狀調查項目間之相關係數及散布圖 ... 24

圖三、25 個芥藍種原之 2D 主成分分析圖... 26

圖四、25 個芥藍種原之 3D 主成分分析圖... 27

圖五、SSR 分子標誌 BnEMS1119，應用於六個種原之 PCR 產物於 2.0%洋菜膠片 之電泳結果 ... 29

圖六、依多型性對偶基因擴增數目統計之 SSR 分子標誌數量分布 ... 31

圖七、以 20 個分子標誌對偶基因分析 26 個種原之主座標分析三維圖 ... 37

圖八、26 個芥藍種原不加權平均重法（UPGMA）演算親緣樹圖 ... 40

1

內容目錄

誌 謝... I 中文摘要... II 英文摘要... IV 表目錄... VI 圖目錄... VII

內容目錄... 1

壹、 前言... 3

一、 芥藍簡介及起源... 3

二、 芥藍分類地位及歧異度之相關研究... 4

(一)、 非以 PCR 產物差異為基礎之分類研究 ... 4

(二)、 以 PCR 產物為基礎之分類研究 ... 5

(三)、 芥藍變種內之遺傳歧異度... 6

三、 臺灣芥藍栽培及品種現況... 7

貳、 材料與方法... 11

一、 試驗材料... 11

二、 芥藍葉片 DNA 萃取 ... 11

三、 植株性狀調查... 13

四、 SSR 基因型分析 ... 14

五、 資料分析... 16

(一)、 性狀之統計分析... 16

(二)、 遺傳歧異度分析... 17

2

參、 結果... 21

一、 芥藍外觀性狀資料分析... 21

二、 遺傳歧異度分析... 28

(一)、 SSR 分子標誌之歧異度 ... 28

(二)、 種原內之遺傳歧異度... 33

(三)、 種原間的遺傳歧異度分析... 35

肆、 討論... 42

芥藍種原內遺傳變異性... 44

芥藍種原間遺傳歧異度分析... 46

伍、 參考文獻... 49

陸、 附錄... 55

3

壹、 前言

一、 芥藍簡介及起源

芥藍又名芥蘭，學名為 Brassica oleracea L. var. alboglabra (L. H. Bailey) Musil，一般英文俗名稱為 Chinese kale。屬於十字花科(Brassicaceae)一至二年生 草本作物(劉與關，1997。)，與其他甘藍類作物同屬 CC genome，具 9 對染色體

（2n = 18）。一般利用方式為採摘全株或側芽食用其嫩葉、嫩莖，亦可採收其幼 嫩花薹食用作蔬菜使用（蕭，2005；Okuda and Fujime, 1996.）。葉片、莖部等所 有營養生長組織呈現無毛光滑的外觀，顏色由淺黃綠至藍綠色，葉片有不同的皺 葉程度。主根具強烈分枝性，營養生長期植株高度可達 40 公分，開花後到生育 末期時，含花序高度可達 1 至 2 公尺，葉片不會如甘藍形成葉球。花序為頂生或 腋生的總狀花序，長度達 30 至 40 公分，低溫需求不高，且容易開花及留種。花 色為白色或黃色，小花梗為 1 至 2 公分長，（蕭與陳，2011；Dixon, 2007, Okuda

et al., 1996.）

十字花科甘藍類植物起源於地中海沿岸、希臘及英國西南方威爾斯（Wales）

等地區(Song et al. 1990；Babula et al. 2007)。但現今的甘藍類作物隨著數千年人 類栽培馴化或常與地理位置鄰近的其他十字花科作物相互雜交，部分作物彼此之 間的分類地位或親源關係仍存在許多疑點( Dixon, 2007)。芥藍目前雖無明確的野 生型祖先型態為何，但芥藍的葉片型態除了顯示野生型之 Brassica oleracea L.為 其先祖外，其抽薹開花快速之特性相似於 Brassica cretica subsp. nivea.，此為一 個栽培於希臘南方及土耳其西南方之作物（Prakash et al., 2011），芥藍也可能與 其有親源關係（Dixon, 2007）。在中國的記載從西元 11 世紀的北宋到 13、14 世 紀的金、元時期皆有記載，如宋代文學家蘇東坡於西元 1094－1098 撰寫之《雨 後行菜園》詩中曾寫下「芥藍如菌蕈，脆美牙頰響」（張，2009）。另外，曾有記 錄於義大利發現芥藍（梁，2007），以及義大利已稀少存在之地方種‘Mugnoli’

(Brassica olearace L.)（Laghetti et al., 2005）之花薹外型與芥藍相似。推測芥藍可

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能因中世紀栽培或貿易等人為活動，經由希臘傳至東地中海地區，進而傳入中國，

或是傳入後經馴化原產於中國南方(張，2009；Dixon, 2007；Zhang and Zhang, 2014)，現已廣泛栽培於中國、日本、臺灣及東南亞(Okuda and Fujime, 1996)。

二、 芥藍分類地位及歧異度之相關研究

芥藍相對於其他甘藍類植物之分類地位一直存在兩種觀點，一種認為芥藍屬 甘藍類植物之一個變種，另一種則認為芥藍為獨立於甘藍類之另一個種，應定名 為 Brassica alboglabra。長久以來許多研究者分別從外觀形態（Bailey, 1922, 劉 海濤 and 關佩聰, 1998）、雜交親和性（周等，2010；劉與關，1998）、染色體結 構（王與羅，1987）、同功異構酶（劉等，1998；Simonsen and Heneen, 1995）及 以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction；PCR）產物為基礎之 DNA 分子標 誌（Izzah et al., 2013；Lazaro and Aguinagalde, 1996；Mei et al., 2010；Song et al., 1990）等各方面之差異，進行芥藍與其他甘藍類植物之親源性及歧異度研究，進 而更深入探討芥藍種內之遺傳歧異度（劉與關，1997；Okuda et al., 1996; Zhang et

al., 2014）

(一)、 非以 PCR（polymerase chain reaction）產物差異為基礎之分類研究 Bailey（1922）最早對芥藍進行分類之研究，其材料為廣東的白花芥藍，以 其外觀上花色為白色，及一年生特性與一般甘藍類作物多屬黃花且二年生之特性 不同，認為芥藍應為一個獨立物種。Snogerup（1980）也曾發表芥藍可能源自於

Brassica cretica ssp. nivea，認為其應為不同於甘藍類之物種

2010；劉等，1998），且雜交組合後代可順利產生 F₂種子，以及 F₂種子可順利 萌芽成長，由此判斷芥藍為甘藍類之變種（周等，2010）。

王與羅（1987）以 C-banding 技術比較芥藍及結球甘藍之染色體組型態，兩 者表現一致而支持芥藍為甘藍變種。而 Simonsen 與 Heneen（1995）以十種同功 異構酶之水平澱粉膠體電泳（starch gel electrophoresis）條帶結果對 48 個不結球

5

白菜種原及 6 甘藍類栽培種其間之遺傳變異進行分析，來自中國之芥藍與其他 5 個瑞典的甘藍類作物，包括結球甘藍（White cabbage）、抱子甘藍（Brussels sprouts）、

皺葉甘藍（Savoy cabbage）、花椰菜（Cauliflower）及青花菜（Broccoli）之親源 分析結果顯示，芥藍與甘藍類現代之栽培種親源並不接近。劉和關（1998）針對 芥藍與其他來自中國、荷蘭及日本之甘藍類栽培種之幼苗形態及種子及幼苗的過 氧化物同功異構酶進行聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS Polyacrylamide Gel

Electrophoresis，SDS-PAGE）之結果進行探討。芥藍幼苗形態與其他甘藍類作物 大部份特徵相同，而過氧化物同功酶之條帶除抱子甘藍外，其他皆相同，但芥藍 部份條帶深淺與其他不同，雖顯示具有密切之親源關係，但考慮結球甘藍及花椰 菜傳入中國僅 300 多年歷史，以及花色上芥藍有白色及黃色兩種，其他甘藍類作 物花色僅黃色，認為芥藍更適合定為一獨立種，而非甘藍類之變種。

(二)、 以 PCR 產物為基礎之分類研究

早期較完整之分析為 Song et al.（1988b）以 13 個細胞核基因組探針與 4 種 限制酶共形成 21 種組合，利用 RFLP（restriction fragment length polymorphism；

限制酶片段長度多型性）分子標誌對蕓薹屬內六種主要栽培物種(B. rapa,

B.oleracea, B. nigra, B. napus, B. juncea 及 B. carinata)、其他 3 種蕓薹屬物種（B.

adpressa、B. fruticulosa 及 B. tournefortii）

arrensis）進行分類，其結果為油菜類（B. rapa）及甘藍類作物（B. oleracea）可

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而不同的分子標誌亦有相似之分類結果，芥藍未與其他甘藍類作物緊密群集。

從 6 個條帶再現性佳的 RAPD（random amplified polymorphism DNA；逢機增殖 多型性 DNA）分子標誌對具 9 對染色體之 22 個蕓薹屬植物進行親源分析，其中 包含 1 個來自中國的芥藍商業品種。分析結果將 22 個蕓薹屬植物分成三個群類：

西歐地區群、西西里島群及愛琴海地區群。芥藍非與取自英國及法國之甘藍類植 物群集在一起，而是首先與 B. hilarionis Post.群集，之後便與多個 B. cretica 之亞 種作物同分於愛琴海地區群之中（Lazaro et al., 1996）。但在 Mei et al.（2010）

利用 AFLP（amplified fragment length polymorphism；增殖片段長度多型性）分 子標誌及簡單重複序列（simple sequence repeat, SSR）分子標誌之研究下，芥藍 雖未與 B. hilarionis 分入同群，但相較其他野生蕓薹屬植物而言，與 B. cretica 有 較接近之親源，在Nei’s 遺傳距離僅小於 0.4，其次為 B. hilarionis。這個結果也 呼應其他研究者對芥藍與 B. cretica 可能具親源性之看法（Dixon, 2007）。

再參考近年 SSR 分子標誌應用於分析甘藍類作物之起源、分類及遺傳歧異 度研究結果，芥藍與花椰菜或青花菜有較近之親源關係（Izzah et al. 2013；Song

et al., 1988a）

al., 2013）

標誌之分析結果相似（Lazaro et al., 1996；Song et al., 1990）。由此等證據可知，

芥藍確實與甘藍類作物具有相近的親源關係，又並非如結球甘藍、青花菜及花椰 菜等直接由較早期的栽培種甘藍衍生分化而來。更可能接近於原始的甘藍或芥藍，

且與 B. cretica ssp. nivea 具親源關係，但仍屬於甘藍類植物之範疇下，因此仍屬 甘藍類之變種。

(三)、 芥藍變種內之遺傳歧異度

在芥藍族群內相關之研究，外觀型態方面，Okuda 與 Fujime（1996）將 18 個蒐集自日本、臺灣、中國及泰國之芥藍栽培種，按照花瓣顏色、葉色及葉形分

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類成五群，先由花色分為黃色或白色為兩群，而這也是多數人觀念中的分類方式。

其中白花群葉色皆為深綠，並按是否具蠟質之灰白色分為兩群，第一群葉色具蠟 質灰白且葉形圓形，而第二群葉色無蠟質灰白色且葉形為卵形和橢圓形。第三群 植株型態與第二群相似，唯第三群植株花瓣顏色為白或黃。第四及第五群則皆為 黃花，第四群葉色淡綠且葉形圓形。第五群葉色較深，葉形為卵形(Okuda and Fujime, 1996)。

在花序、花粉及同功酶方面之觀察，黃花及白花皆為總狀花序，花粉外觀同 樣多為長球形且具三條細溝槽，也與其他十字花科花粉特徵相似。兩者比較其幼 苗過氧化物同功酶之結果有相同條帶表現，但有條帶寬窄和顏色深淺之差別。而 黃花與白花芥藍正反交之結果率皆達 100%，且雜交第一代皆呈白花而顯示兩者 在分類上為同種（species）的兩個栽培種（cultivars），白花基因相對於黃花基因 為顯性（周等，2010；劉與關，1997）。

其他研究中，結合 RAPD 與 SRAP （sequence related amplified polymorphism）

分子標誌核酸條帶擴增之結果，也利用Jarccard’s similarity coefficients 配合不加 權平均重法（UPGMA）進行叢集分析，分析 21 個由亞洲蔬菜研究發展中心

（Asian vegetable research and development center, AVRDC）所提供之芥藍種原

（accession），部份種原無法按花色分群（Zhang et al., 2014），而種原間之相似度 在 0.42-0.72。而 Celucia et al.等人（2009）曾利用 SSR 分子標誌對 28 個芥藍種 原（accession）及不結球白菜種原進行遺傳特徵之分析，雖然分子標誌之多型性 達 71.08%，顯示種原間的高遺傳歧異度，但可能受白菜類及與甘藍類同時分析 之影響。，就芥藍種原間的遺傳歧異性與種原來源地區相關連，即被歸為同群者，

多屬相同物種及來自相同的地區。

三、 臺灣芥藍栽培及品種現況

臺灣的芥藍早期是由中國大陸或東南亞傳入，黃花芥藍於明末及清初時期引 自中國大陸，而白花芥藍於光復後才由香港引入（蕭，2005；蕭與陳，2011）。

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在臺灣於 1996 年以前以家庭栽培為主（蕭與陳，2011），之後漸成為專業生產蔬 菜品項之一。全臺栽培面積曾在 2003 年達 1981 公頃。隨就業型態的轉變、農業 人口的減少，栽培面積為下滑減少的趨勢，自至 2013 年全年作面積約為 1066 公頃，（農業部農糧署， 2014）。由於甘藍類為性喜冷涼之植物，仍以秋冬栽培 居多，因此一期作栽培面積較少約 309 公頃、二期作為 360 公頃，裡作則為 397 公頃。其中雲林縣為全年栽培面積最大、其次在裡作及一期作新北市栽培面積位 居第二，只有在二期作高雄市地區才是第二大栽培面積地區（農委會農糧署，

2014）。由於芥藍有多種消售型態，但主要是以作為收獲全株作小葉菜，或多次 採收其花薹販賣為主力商品。而雲林等中南部等地芥藍多以一年四季可栽培之白 花芥藍作葉菜用栽培為主，到秋冬才有薹用芥藍栽培，且仍以白花居多。而北部 地區因氣候及消費習慣，主要為裡作及初春栽培黃花芥藍採作為薹用商品，也有 部份為溫網室葉菜生產者栽培白花芥藍。

歷經長久的栽培，因臺灣不同地區的氣候條件、不同人為選拔、留種的操作，

以及更多的種子來源，如引種、外國商業品種等，使得在臺灣的芥藍品種及地方 種種類及名稱十分多樣。一般芥藍品種之命名多以其型態特徵為主，以花色、薹 形、葉色、葉形、葉面、花期等加上生產栽培區之地名做為品種名稱。由 1994 年的臺灣地區現有作物栽培名錄十字花科篇刊載之品種便可了解，其中包含‘金 鐘黃花白芥’、‘圓葉白花’、‘綠光皺葉白花’、‘二號大心黑芥藍’、‘新豐圓葉黃花’

等 16 個商業品種。另外，在 2014 年的國家作物種原中心現存材料種類及數量統 計，中期庫芥藍共 218 項，長期庫芥藍共有 119 項，其命名亦有此趨勢。

族群的定義可以從既有的常識或概念建構，如地理區隔、文化、語言及外在 特徵定義，但我們無法確定在這樣的分類下，是否一個族群內的個體在遺傳組成 層面也符合一致的特徵。梁（2007）進一步對 44 個來自臺灣、大陸、日本、泰 國、印度等地的芥藍種原外觀增加多項描述，包含種子百粒重、葉長寬比、葉長 與葉柄比值、平均節間長度、莖粗等項，並將大部份芥藍種原分為黑格藍、白格

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林及黃花芥藍群。黑格藍群葉色深綠及中段莖徑較粗，白格林群則明顯葉綠素讀 值最低，葉色較為黃綠，而黃花芥藍群植株較高大、葉柄長、節間長及抽薹性晚。

更深入以 29 個 RAPD 分子標誌及 33 個 ISSR（inter-simple sequence repeat）分子 標誌分別針對這 44 個芥藍種原（accession）進行歧異度分析。每個種原以 12 株 個體 DNA 混合為一個樣品進行擴增並分析其產生之條帶，並利用。RAPD 分子 標誌之 Jaccard 相似係數介於 0.51-0.96，平均為 0.74，而 ISSR 分子標誌之 Jaccard 相似係數介於 0.57-0.96，平均為 0.72，兩種分子標誌結果類似。觀察親源樹圖，

兩種分子標誌分析之分群結果大致與型態分群及栽培地區之差異相符合。另外，

黃花芥藍群群內之差異較白格林群及黑格林群為大，推測因黃花芥藍栽培具地域 性且未大量生產商業化種子，而保留較多之遺傳變異。

芥藍在全球雖不是主流蔬菜生產類別，但就臺灣、東南亞一帶及擁有眾多人 口之中國大陸而言，已是蔬菜生產或一般飲食中不可獲缺的作物種類之一。且過 往的研究也曾提出芥藍較一般甘藍類之結球甘藍、青花菜及花椰菜而言，可能具 有較為早生、耐熱、耐候之特性（Dixon, 2007, Okuda et al., 1996），甘藍類作物 在世界蔬菜生產佔極重要之地位，全世界生產量也逐年持續增加(FAO, 2011 )，

而國外也有應用芥藍進行其他十字花科品種改良之策略（Rahman et al., 2011）。

在氣候變化劇烈、極端天氣出現頻繁的今天，對於甘藍類作物之育種改良上，其 基因體之資源能發揮什麼樣的角色及作用，更值得深入研究。

對栽培生產者而言，栽培品種生育之一致性，有利於生產規劃及管理。目前 市面上除了專業種子、種苗業者生產之商業品種外，也有流通於各栽培生產地區 週邊，為農民自留之固定品種。然而其中大多非一代雜交品種，偶有品種特性難 以穩定維持之問題發生。少部份一代雜交品種來自日本和國內專業種苗業者之商 業品種，如‘翠寶芥藍’和‘翠津’等，栽培時相對有較穩定之表現。

目前商業品種及地方種間之親緣關係未明，且地方種內可能蘊涵，可協助未 來耐候及抗病蟲害育種之未知遺傳育種資源（Christensen et al., 2011）。對育種者

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而言，不論是為了改善其他蕓苔屬作物或是培育更優良穩定之芥藍品種，解構其 種原之遺傳變異及遺傳結構，為最基本的第一步。然而了解的方式多半僅從實際 栽培觀查著手，相對需要許多人力和時間的投入。芥藍變種內之歧異度目前雖已 有諸多方面之探討，但多半為外觀觀察資料及利用分子標誌之條帶分析後所得之 親源樹狀圖或主成分分析圖加以人工判讀其分群情形，而且只能看到種原分類，

而無法看初種原內的變異情形，無法估算族群結構相關之資料以呼應分群結果實 為可惜。

因此本研究之目的為針對 26 個蒐集自台灣各地之芥藍種原，進行園藝性狀 之調查及 SSR 分子標誌對偶基因之擴增，探討種原間之遺傳歧異度、親緣關係，

以及種原間分化之程度，以利了解種原間及種原內之變異情形。可協助有限資源 投入種原維護之分配，以及提高未來育種工作之前期效率。種原間之親緣關係在 未來亦可進一步作為雜交育種材料選擇之參考，有助於獲得選拔所需之遺傳變異，

提高篩選得到優良品種之可能性。

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貳、 材料與方法

一、 試驗材料

本試驗材料由桃園區農業改良場提供蒐集自新北市樹林區、新莊區、蘆州區、

板橋區、三重區，以及臺中市大甲區，臺南市，宜蘭縣、高雄市、日本、泰國等 地之芥藍種子共 25 份，另以農友種苗股份有限公司之青花菜品種‘清華’作為歧 異度分析時之外群(表一)。其中芥藍種原部分包含農友種苗股份有限公司、豐田 種子行、明豐種子行等種子種苗業者之商業品種共 18 份，以及農民自留種 7 份。

參試材料於桃園區農業改良場臺北分場進行育苗及栽培，25 份芥藍種原及外群 青花菜‘清華’分別逢機選取 20 株進行 DNA 萃取及後續遺傳歧異度之分析。

種子經浸種 4 小時後，種子以清水潤洗一次，分別置於 ADVANTEC^® 定性 濾紙 NO.1（90 mm）上放入培養皿中，加入 2 至 3 mL 蒸餾水後蓋上培養皿蓋。

將培養皿置於設定 23℃且黑暗之生長箱中進行催芽，待約 36 小時後胚根吐露時 進行於民國 103 年 4 月 30 日播種。播種時採用 BVB Substrate^® 7A 介質填裝於 128 格穴盤中，人工播種後每穴格再覆蓋介質，厚度約 3 到 5 mm。完成播種後 澆水至穴格內介質充分吸水，並於簡易溫室下進行育苗。播種後約 5 天植株子葉 完全展開，至播種後第 7 天使用 Peters^®花多多肥（20－20－20）稀釋 1000 倍作 為液肥施用，之後每四天澆施一次液肥。幼苗於播種後 21 天具本葉 3 至 4 片，

達可定植的狀態。

二、 芥藍葉片 DNA 萃取

DNA 萃取方法以 Li et al.（1995）之方法加以修改使用。芥藍幼苗達本葉 2 至 3 片時，每一單株分別剪取葉片面積約 1.5 cm²，剪細置入 1.5 mL 之微量離心 管內及放入 1 粒鋼珠，再加入 700 μL DNA 萃取液（100 mM Tris-HCl, pH 8.0；

50 mM EDTA, pH 8.0；500 mM NaCl；1.25% SDS），以 TissueLyser^TM （Qiagen, German）設定為單次震盪頻率每秒 30 次、震盪 1 分鐘，快速打碎葉片組織，共

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表一、25 個參試芥藍種原及 1 個青花菜種原之來源

a花色為黃色之種原其名稱皆以黃花為開頭及一個英文大寫字母為結尾代表，其它則分

別為白花芥藍種原及青花菜種原。

b族群結構：OP 為開放授粉混合採種族群、F1為一代雜交品種、 - 為未知族群結構。

accession

No. accession name ^a sources location of sources population structure ^b

1 黃花芥藍 A 農友種苗股份有限公司 高雄市 OP

2 珍巧黑格林 豐田種子行 高雄市 F1

3 黃花芥藍 B 農民自留種 臺中市大甲區 OP

4 黃花芥藍 C 農民自留種 新北市樹林區 OP

5 黃花芥藍 D 桃改場臺北分場 新北市樹林區 OP

6 黃花芥藍 E 農民自留種 新北市樹林區 OP

7 黃花芥藍 F 農民自留種 新北市樹林區 OP

8 黃花芥藍 G 瑞蓋種子農藥行 宜蘭縣 OP

9 白花大心芥藍 新農友種子行 宜蘭縣 OP

10 黃花芥藍 H 新農友種子行 宜蘭縣 OP

11 黃花芥藍 I 榮華種子行 新北市新莊區 OP

12 青格藍 農民自留種 新北市新莊區 OP

13 黃花芥藍 J 富國種子行 新北市蘆州區 OP

14 白花大心格藍 榮和種子農藥行 新北市板橋區 OP

15 黃花芥藍 K 榮和種子農藥行 新北市板橋區 OP

16 黃花芥藍 L 萬成種子農藥行 新北市新莊區 OP

17 黃花芥藍 M 興農種苗股份有限公司 新北市三重區 OP

18 吃心芥藍 興農種苗股份有限公司 新北市三重區 -

19 明豐 2 號黑芥藍 明豐種子行 臺中市豐原區 OP

20 黃花白芥藍 N 自留種 臺南市 OP

21 ‘翠津’ 農友種苗股份有限公司 高雄市 F₁

22 黃花芥藍 O 今日種子農藥行 雲林縣西螺鎮 OP

23 ‘蕙津’ 農友種苗股份有限公司 高雄市 OP

24 ‘翁山’（Oros）

Lion Seeds Co., Ltd.

25 ‘翠寶’ 日本武藏野種苗園 日本 F1

26 ‘清華’(青花菜) 農友種苗股份有限公司 高雄市 F₁

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執行兩次。組織破碎後將微量離心管置於 65℃水浴 30 分鐘，每 10 分鐘將微量 離心管內之萃取液搖晃均勻。水浴後再將 270 μL 5M 醋酸鉀（potassium acetate, KOAc）加入離心管內，並輕輕混合均勻後置於冰上 20 分鐘之後再以 4℃、15000 rpm 離心 15 分鐘；取出上清液至滅菌完成之新的 1.5 mL 微量離心管中，加入 700 μL 異丙醇（isopropanol），將離心管上下輕翻轉至均勻混合。再次以 15000 rpm 離心 10 分鐘以沉澱 DNA 後，去除含異丙醇之上清液，加入 1 mL 已冰鎮之 70%

酒精洗鹽。最後以 12000 rpm 離心 10 分鐘，去除含酒精之上清液並將樣品進行 風乾，待完全去除酒精後，加入 100 μL TE 緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH8.0；1 mM EDTA, pH8.0）回溶 DNA，儲放於-20℃冰箱備用。

三、 植株性狀調查

育苗達 21 天後，於民國 103 年 5 月 21 日將 25 個芥藍種原幼苗定植於桃園 區農業改良場臺北分場田區（約 121 m²），種植前 7 天（5 月 14 日）田區施用基 肥包含福壽牌大自然生技基肥（2.5-2.5-1.5）150 公斤、福壽牌特級有夠肥 7 號

（5-3-2）10 公斤及臺肥複合肥 5 號（16-8-12）2 公斤。田間試驗採完全逢機設 計，每種原進行三重複、每重複三株的調查。定植後共追肥三次，第一次追肥於 5 月 26 日施用臺肥複合肥 5 號 2.8 公斤及氯化鉀（0-0-60）0.35 公斤。第二次追 肥於 6 月 3 日施用臺肥複合肥 1 號（20-5-5）1 公斤及氯化鉀 0.35 公斤。第三次 追肥於 6 月 16 日，僅施用尿素（46-0-0）0.6 公斤。

試驗性狀調查統一於定植後 57 天進行，調查項目為葉綠素讀值( Chlorophyll Meter SPAD-502, Minolta, Japan )、株高、展幅、莖徑、葉長、葉柄長及葉寬等 7 項，另外記錄自過去陸續觀查之 3 項性狀資料，包括種子百粒重、幼苗下胚軸花 青素顏色深淺及花色等。

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四、 SSR 基因型分析

首先挑選黃花芥藍 A、珍巧黑格林、黃花芥藍 B、黃花芥藍 C、明豐 2 號黑 芥藍和黃花白芥藍 N 等 6 個外觀類型及來源較為分散的種原，每個種原逢機挑 選 4 個個體，共 24 個個體之 DNA 進行分子標誌之篩選。採用 PCR 反應總體積 10 μL，反應溶液包含 40 ng 之 DNA、0.2 μM 之引子、5 μL 之 Taq DNA Polymerase Master Mix RED（Ampliqon, Denmark）及 1.4 μL 之二次蒸餾水(ddH2O)。使用核 酸增殖儀（Sensoquest, German）進行反應，PCR 程式設定 94℃為 3 分鐘，一個 循環；94℃為 30 秒，55℃為 30 秒，72℃為 40 秒，共進行 35 個循環；72℃為 3 分鐘，一個循環，反應最後溫度降至 20℃並終止。完成 DNA 片段增殖之產物以 2.0%洋菜膠片（Agarose gel）電壓 220 伏特、進行 17 分鐘水平式電泳。挑選 29 個可順利擴增 DNA 片段且具多型性之 SSR 分子標誌。但部分分子標誌在後續 Multiplex-Ready PCR （Hayden et al., 2008）的結果不易判斷基因型者而不採用，

最後本試驗使用 20 個 SSR 分子標誌參與遺傳歧異度之分析。其中 14 個分子標 誌為前人研究所開發，如表一，其餘 6 個（CHT 開頭）為本研究室自行探勘之 分子標誌（余等人，2013。）

入選之 SSR 分子標誌則應用於遺傳歧異度分析，SSR 分子標誌基因型分析 採用修改自 Hayden et al.（2008）Multiplex-Ready PCR 之設定，先後進行兩階段 之 PCR 循環，第一階段 PCR 反應之目的為先使具樣品序列專一性之引子（locus specific primer）黏合於樣品 DNA 並增殖產物，之後執行第二階段 PCR 反應，再 讓螢光標記之通用性引子（dye-labelled taqF＋taqR）黏合於第一階段已增殖之產 物進行擴增，並使其帶有螢光，有助於提升之後基因型鑑定之效率。而本試驗採 用之螢光標記為藍、綠、黃及紅共四種顏色。總 Multiplex-ready PCR 反應總體 積為 10 μL，反應溶液包含 40 ng 之 DNA、1 μL 10X ImmoBuffer（Bioline, UK）

（16 mM (NH4)2SO2, 0.01% Tween-20, 100 mM Tris-HCl, pH8.3）、0.2 mM dNTP、

2 mM MgCl2、0.04 μM 之具樣品序列專一引子、0.08 μM 螢光標記之通用性引子、

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表二、20 個參試 SSR 分子標誌資料

aCheng et al., 2009.

b Fan et al., 2010.

c Iniguez-Luy et al.2008.

dLowe et al., 2004.

e余等人，2013。

f 未確定該分子標誌染色體位置。

Marker Chromo -some

Motif of tandem repeats

Forward primer Reverse primer Reference size BnGMS160 4 (GAAA)7 TTTCCGAAACTTGTCGTTAT CGCTGTAAGCATTGTTGTAA 386^a BnGMS543 7 (AG)9 TCGAAATCTACGGTTTGACT ATTATGCTTGTCGTCGACTT 263 ^a BoGMS486 2 (ATT)16 AAGGAGGAACCAAATGCC TGATAATGCCACTGATAGGAC 197^b fito316 5 (TGATG)3 ACGGATAAAGGAGGAGAAGA CTGGTTAGTTAGCGTTGAGAA 216 ^c BnGMS539 5 (AT)9 CATCACTCAATCCAAGACCT AGAACCTGAAACAAACGATG 177 ^a BnEMS1119 2 (TGA)6 ACTGGAGTTTCAATTGGATG CATCATCTTCAGCACTAGCA 209 ^b

BnGMS634 5 (AG)9 CAATTTGGGACTGAAGAAAT CGCATTCTTCAAACAAACTC 317^a

BnGMS98 9 (AT)8 CCACTAGTTTACATCCTGGC ATGACCTAAGCATGTGGTCT 193 ^a

BoGMS1166 8 (GAA)9 TAATGGAAACGCACCAAG AAACAATCTTAGCAGAGGAGG 199^b

BoGMS561 1 (CAT)14 CAAAGACTAAACCAGACCAAG ATAGGCAAGGTGAGAAGAAAG 153 ^b Ol13-E08 -^f di GA/CT TTCGCAACTCCTCCTAGAATC AAGGTCTCACCACCGGAGTC 171 ^d

BoGMS1382 9 (AAG)9 CTTCCTGCGTCACTTTACC AGGCTGTCTCCTCACCCA 133^b

BnEMS954 3 (GAA)6 CCTGATCGTGCTCTACTACC AAGGACAAGAGACCAAACAA 233 ^b fito472 7 (AAAAT)2 CGTCTTTGACCTTTCTATCTG TGCCCTTGTTTCTTTCTTT 362^c CHT_11 - (ATT)n TGTAAACACTTTCTCTTTGCC TTAGGAGAAGTGTGTGACCC 241^e

CHT_20 3 (CTC)n ACAAATCTTGGTTTTGAAGC CAAGACATGAGAAACACGC 186^e

CHT_22 - (CTT)n CTGTCTCAAATAAACTCCGC AGATGTGGTTTTCAGTGAGG 219^e

CHT_46 - (TTC)n ACTTATTTACTATCCGCGCC TCTTCTTCACCATGAACTCG 257^e

CHT_50 - (GA)n GTTGTTGGTAGCGTAAAACC AAGCTCTCATTGAATCATGG 190^e

CHT_28 - (TC)n ACATCCACTGTTTTCTTTGC TTCGATTTGTTTAATCAGGG 169^e

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0.025 U 之 IMMOLASE^TM DNA Polymerase（Bioline, UK）及 2 μL 之二次蒸餾水 (ddH2O)。使用核酸增殖儀（Dual Flat Block GeneAmp® PCR System 9700, USA）

進行反應，PCR 程式設定 95℃為 10 分鐘，一個循環，第一階段 92℃為 30 秒，

63℃為 90 秒，72℃為 60 秒，共進行 20 個循環；第二階段 92℃為 15 秒，54℃

為 30 秒，72℃為 60 秒，共進行 40 個循環；最後 72℃為 30 分鐘，一個循環後 溫度降至 18℃並終止。

由於毛細管電泳之解析力可達 1-2 bp，可更正確評估對偶基因型（Wang et al., 2009），因此入選之 29 個 SSR 分子標誌採用毛細管電泳系統進行分析。在 Multiplex-ready PCR 後，擴增之產物可按使用的通用性引子螢光之不同，以固定 比例混合產物。本試驗以通用性引子不同之產物按藍：綠：黃：紅為 3：3：4：

6 之比例混合。完成後樣品則委託昕穎公司（臺灣）以 ABI3730 DNA analyzer 毛細管電泳系統，搭配 ABI GeneScanTM -600 LIZTM Size Standard（Applied Biosystems^®, USA）讀取產物螢光訊號。由昕穎公司送回之資料自行以軟體 GeneMapper^®分析，主要利用一組已知 DNA 片段大小之螢光標準品（GeneScan™

600 LIZ^® dye Size Standard ; 20 – 600 bp）與樣品同時進行毛細管電泳，以標準品 之不同螢光片段訊號出現之時間資料建構樣品 DNA 片段基因型判讀標準，將樣 品 DNA 片段與其比對後，以此鑑定樣品 DNA 之基因型。

五、 資料分析

(一)、 性狀之統計分析

25 個芥藍種原之 7 項性狀調查資料以每種原三重複各別之均值，利用統計 套裝軟體[R] ver 3.1.1（R Development Core Team, 2008）進行變方分析（ANOVA）， 確認種原間存在顯著差異後（p＜0.05），再進行Fisher’s least significant difference test（LSD test）。另外，在套裝軟體[R]中，將 7 項田間性狀間兩兩繪製散佈圖，

以及計算其相互之皮爾森相關係數(Pearson's correlation coefficient)與顯著性檢定，

17

並利用共變方矩陣進行主成分分析（principle component analysis, PCA）。主成分 分析之原則為利用資料點原實際偵測到的多個變數，將其變方或共變方關係綜合 轉變為少數線性組合，在盡量不失真的狀況下，將資料點以少數維度呈現，並在 二維或三維空間將資料點繪製散布圖。其中可解釋樣品間最大變異的兩個軸為第 一及第二軸，解釋變異量第三大者為第三軸。

(二)、 遺傳歧異度分析

在遺傳變異的討論中有兩個分析方向，即豐富度（richness）與均勻度

（evenness）的描述。所謂豐富度指族群內具差異的個體或基因型種類之多寡。

而均勻度與豐富度有關係，但指的是這些差異類型（例如不同對偶基因）的頻度 是否類似，或者說差異的頻度間變異的大小，若頻度間變異低則均勻度較高

（Brown, 2008）。

針對這兩個方向有許多遺傳參數因應而生，本試驗利用 PowerMarker ver.

3.25 軟體（Liu, 2005）將各種原 SSR 分子標誌之基因型資料進行分析，分子標 誌歧異度之分析參數包括平均對偶基因數目（mean allele per locus）、主要對偶基 因頻度（major allele frequency）、多型性訊息含量（polymorphic information content, PIC）。另藉由各種原擴增之對偶基因類別總數、基因歧異度及種原間族群分化指 數 Fst 進行各種原豐富度及均勻度之探討，而各種原基因型頻度資料可應用於種 原間遺傳距離之估算，先以軟體 PowerMarker ver. 3.25 計算歐氏距離（d_E

= ），再轉換為 modfied Roger’s distance, d_W =

）(Wrights, 1978)後，得到遺傳距離。並利用 modfied Roger’s distance 在統計套裝軟體[R] ver 3.1.1（R Development Core Team, 2008）

進行主座標分析（ principle coordinate analysis, PCoA），將圖像化呈現種原間之 歧異度。公式內代號所指為 m 個基因座中，第 i 個基因座具有 ni個對偶基因，其 中第 j 個對偶基因在兩樣品之頻度分別為 及 。

18

多型性訊息含量（polymorphic information content, PIC ）

以分子標誌所偵測到的對偶基因數目及對偶基因頻度為基礎，用於評估分子 標誌多型性程度。當所偵測之對偶基因數越多及對偶基因頻度越平均時，多型性 訊息含量值越高。PIC＞0.5 時，分子標誌具有高度多型性；0.5＞PIC＞0.25 為中 度多型性分子標誌；PIC＜0.25 為低度多型性分子標誌（Botstein et al., 1980）。

其公式為：

其中 n 為第 n 對對偶基因，pi為第 i 種對偶基因頻度，pj為第 j 種對偶基因頻度。

基因歧異度（genetic diversity）

以實驗測得對偶基因之頻度估算族群內異結合之比例（expected

heterozygosity），即隨機從族群中抽取兩個對偶基因，兩者非同源之機率，可直 接描述族群豐富度和均勻度。由於芥藍為異交作物，且種原多為開放授粉之雜交 族群，因此直接以 D= （Weir, 1996）計算，其中 n 為單一基因座之 對偶基因數， p_i為該基因座上第 i 種對偶基因頻率。

主座標分析 （principle coordinate analysis, PCoA）

主要概念為在維持兩兩樣品間相對距離關係的前提下，在低維度的空間中盡 可能不失真地呈現樣品的關係。數個樣品可在多個空間座標軸下被描述，但主座 標分析只取其中最重要的少數維度來呈現樣品間的關係。一般以二維或三維圖展 現，並以可解釋樣品間最大變異的兩個軸為第一及第二軸，解釋變異量第三大者 為第三軸（Gower, 1966）。由於兩樣本在多維度空間裡距離之建構概念以歐氏幾 何為基礎，本試驗採用 Modified Roger’s distance 以進行主座標分析運算並以統 計套裝軟體[R] ver. 3.1.1（R Development Core Team, 2008）繪製各種原三維空間 之散布情形。

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群集分析（clustering analysis）

以 Modified Roger’s distance, dW =

(Wrights, 1978)估算種原間遺傳距離並匯入 NTSYS 2.0 套裝軟體（Rohlf,1998）後，選取 Clustering/SHAN 選項，進行不加權平均重法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, UPGMA）（Sneath and Sokal, 1973）演算及繪製親緣樹圖。不加 權平均重法(UPGMA) 基本為視每一樣品與 root 之距離相同之概念下，利用樣品 間相似度矩陣或遺傳距離矩陣，將矩陣中關係最近的兩樣品成對組合後，重新計 算組合與其他樣品間之關係遠近形成新矩陣，再一次將矩陣中關係最近的兩者組 合，反覆操作將所有樣品完全群集，並繪製成有根親緣樹圖（rooted tree）。

族群分化指數（Fst）

主要反應不同族群之間對偶基因頻率差異，為量化族群遺傳分化之指標。以 族群整體中有 n 個次族群，p_i及 q_i分別為第 i 個次族群中同一基因座之非同源對 偶基因之頻度。而該基因座平均各次族群之非同源對偶基因異結合頻度為 Hl， 在假設次族群內符合哈溫平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）下，各次族群一對 非同源對偶基因異結合頻度期望值之平均為 Hs、而族群整體之一對非同源對偶 基因異結合之頻度期望值為 H_T，其公式分別為（Hamilton, 2009）：

； ；

其中 為第 i 個族群中實際觀測之異結合率（observed heterozygosity），而 及 分 別為該基因座上，整體族群中各次族群之非同源對偶基因頻度之平均。可衍生之 遺傳參數為：

為次族群非同源對偶基因異結合率期望值之平均（ ）與實際觀測 值（ ）之差異程度，可表示族群內平均自交係數，主要分析次族 群內近交或自交情形。

20

為次族群非同源對偶基因異結合率期望值之平均（ ）與族群整體 之非同源對偶基因異結合之頻度期望值（H_T）之差異程度，可表示 因族群分化而導致異結合率減少之比例，可作為次族群間的平均自 交係數，分析族群差異。

為任一次族群中任意個體帶有之一對對偶基因為同源之機率，可視 為整個族群內之平均自交係數。

21

參、 結果

一、 芥藍外觀性狀資料分析

在田間試驗中，各種原對葉綠素讀值、株高、展幅、莖徑、葉長、葉寬及葉 柄長等七項之性狀調查結果平均值如附表一所示。各調查資料之分布情形如圖一 所示。葉綠素讀值最大值為 70.63，最小值為 24.00，平均為 51.26。株高之最大 值及最小值分別為 49.50 cm 及 24.5 cm，平均值為 35.32 cm。展幅以 79.33 cm 為 最大值，33.50 cm 為最小值，平均為 56.82。莖徑 13.647 mm 為最大值，38.043 為最小值，平均為 22.560 mm。7 個性狀在展幅之標準差最大為 11.32，其次為 SPAD 值，顯示資料分布較為離散。另外，在展幅及莖徑之分布分別略向右及向 左偏歪。不同性狀調查項目間進行兩兩相關係數之計算如圖二所示。兩兩性狀間 之相關性方面，除了 SPAD 分別與株高及莖徑兩項之相關性未達顯著大於 0 之外，

其他兩兩性狀關係間之相關性皆顯著大於 0。而相關係數之絕對值表現，展幅與 葉長間最大為 0.88，其次為葉長與葉寬間為 0.80，皆為高度相關，而葉綠素讀值 與株高之相關係數絕對值 0.075 最小為低度相關。另外，葉綠素讀值與展幅、葉 長及葉寬呈中度負相關。

7 個性狀資料經變方分析 （表三)，在 25 個芥藍種原間皆達極顯著差異（p

＜0.001），其中各種原在 7 項不同調查項目平均值之最小顯著性測驗（least significant difference test, LSD test）之結果於附表二。大部分黃花芥藍種原在株 高及展幅之均值較白花芥藍種原大，而葉長、葉寬及葉柄長也較白花芥藍種原長，

而白花種原則是在 SPAD 之均值較黃花種原大。而以往所記錄之其他性狀調查(附 表一)，種子百粒重的部分以蕙津最重，平均達 0.674g ，青格藍次之，種子百粒 重平均為 0.658 g。而黃花芥藍 E 為最輕，僅 0.274g。而幼苗下胚軸花青素累積 的深淺表現上，顏色極淺在幼苗中達 65%以上者為種原 4.黃花芥藍 C、種原 7.

黃花芥藍 F、種原 10.黃花芥藍 H、種原 11.黃花芥藍 I、種原 15.黃花芥藍 K、種 原 16.黃花芥藍 L 及種原 22.黃花食心芥藍 O 等 7 個種原且花色表現皆相同。而

22

顏色深紫之現象在幼苗中達 60%以上者為種原 12.青格藍、種原 14.白花大心芥藍、

種原 18.吃心芥藍、種原 19.明豐 2 號黑芥藍、種原 23.蕙津及種原 25.翠寶等 6 個皆為白花之種原。

最後利用七個量的性狀在個種原之資料，以試驗小區之平均值為單位，每個 種原都有三個資料點以進行主成分析，二維繪圖結果如圖三所示。第一主成分

（PC1）對整體變異之解釋力達 54.95%，第二主成分（PC2）對整體變異解釋力 達 16.63%，累積之解釋力為 71.58%。而三維主成分分析圖 （圖四） 之第三軸

（PC3）變異之解釋力達 13.60%，累積之解釋力為 85.18%。第一主成分與展幅、

葉長及葉柄長等三個性狀之相關係數分別高達 0.92、0.90 及 0.88。第二主成分與 SPAD 之相關係數達 0.75 為該軸最高，而與第三主成分相關係數最高之性狀為葉 寬，兩者相關程度為 0.63。在二維主成分分析中，同花色之芥藍種原分布較為接 近，在第一主成分之方向，吃心芥藍與翠寶較明顯與其他種原分布不同，而第二 主成分之方向白花芥藍種原分布較黃花種原集中，另外，種原 20 黃花白芥藍 N 可明顯與其他種原區分。在三維主成分分析中，種原在第三主成分之分布除了種 原 23‘蕙津’與其他種原有較明顯差異，其他種原間並無較獨特之分布情形。

23

plant hight (cm)

20 25 30 35 40 45 50

Frequency

0 5 10 15 20 25

mean=35.32, SD=6.18

plant width (cm)

30 40 50 60 70 80

Frequency

0 5 10 15 20 25 30

mean=56.82, SD=11.32

stem thickness (mm)

10 15 20 25 30 35 40

Frequency

0 5 10 15 20 25 30 35

mean=38.043, SD=4.841

圖一、26 個芥藍種原之 7 個性狀資料分布

（A）SPAD、（B）株高、（C）展幅、（D）莖徑、（E）

葉長、（F）葉寬、（G）葉柄長。其中 Frequency 為 75 個小區各別平均值位於特定數值範圍之次數。

Leaf length (cm)

10 15 20 25 30 35 40

Frequency

0 5 10 15 20 25 30

mean=25.57, SD=5.84

Leaf width (cm)

10 15 20 25 30 35

Frequency

0 5 10 15 20 25

30 mean=21.47, SD=4.38

Leaf petiole (cm)

2 4 6 8 10 12 14

Frequency

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

28 mean=8.18, SD=2.10

(A) (B)

(C)

(D)

(E) (C)

SPAD

25 35 45 55 65 75

Frequency

0 5 10 15 20 25

mean=51.26, SD=10.78

(G) (A)

(D)

(F)

24

圖二、7 個性狀調查項目間之相關係數及散布圖

其中對角線位置為對應之性狀，SPAD 為葉綠素讀值，P. height 為株高，P. width 為展幅，S.thickness 為莖徑，

L. length 為葉長，L. width 為葉寬以及 Pet. length 為葉柄長。圖中右上為不同性狀間調查資料相關係數顯著性 檢定結果（p < 0.05 表示兩變數間相關係數不為 0）及相關係數值，右下為性狀間資料點之散布情形。相關係 數 0：無相關；相關係數 0.01－0.35：低度相關；相關係數 0.36－0.67：中度相關；相關係數 0.68－0.99：高度 相關；相關係數 1：完全相關（Taylor, 1990）。

SPAD

25 35 45

-0.075

p= 0.52

-0.44

p= <0.01

15 25 35

0.084

p= 0.47

-0.51

p= <0.01

15 25

-0.56

p= <0.01

305070

-0.29

p= 0.013

253545

P.height

0.50

p= <0.01

0.38

p= <0.01

0.36

p= <0.01

0.32

p= <0.01

0.44

p= <0.01

P.width

0.42

p= <0.01

0.88

p= <0.01

0.74

p= <0.01

406080

0.47

p= <0.01

152535

S.thickness

0.42

p= <0.01

0.33

p= <0.01

0.27

p= 0.019

L.length

0.80

p= <0.01

152535

0.32

p= <0.01

1525

L.width

0.42

p= <0.01

30 50 70 40 60 80 15 25 35 4 8 12

4812

Pet.length

25

表三、7 個性狀之變方分析表 source of

variation

degree of

freedom SPAD

plant height

(cm)

plant width (cm)

stem thickness

(mm)

leaf length (cm)

leaf width (cm)

petiole length (cm) accession 24 329.90*** 69.42*** 324.24*** 53.640*** 89.41*** 45.765*** 10.06***

residual 50 13.86 23.21 33.99 8.935 7.57 6.46 1.69

***F test 在種原間達極顯著差異，p<0.001。

26

圖三、25 個芥藍種原之 2D 主成分分析圖

以 7 個性狀資料進行主成分分析，每個種原以小區為單位，點左方之數字為種原代號，詳如表一。第一軸（X 軸）對整體變異之解釋力達 54.95%，第二軸（Y 軸）對整體變異解釋力達 16.63%。黃色及藍色標示為黃花芥 藍種原，按編號對照為 1：黃花芥藍 A，3：黃花芥藍 B，4：黃花芥藍 C，5：黃花芥藍 D，6：黃花芥藍 E，7：

黃花芥藍 F，8：黃花芥藍 G，10：黃花芥藍 H，11：黃花芥藍 I，13：黃花芥藍 J，15：黃花芥藍 K，16：黃 花芥藍 L，17：黃花芥藍 M，20：黃花白芥藍 N，22：黃花芥藍 O。黑色標示為白花芥藍種原，按編號對照為 2：‘珍巧黑格林’，9：白花大心芥藍，12：青格藍，14：白花大心格藍，18：‘吃心芥藍’，19：明豐 2 號黑芥藍，21：‘翠津’，23：‘蕙津’，24：‘翁山’，25：‘翠寶’。

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

-1.0-0.50.00.51.0

PC1

PC2

1 1

1

2 22

3

3

3 4

4 4

5 5

5

6 6

6 77 7

8 8 8

9 9

9

10 10

10

11 11 11

1212 12

13 13

13

14

14 14

15

15 15

16

16

16 17

17

17 18 18

18 19

19

19

20

20 20

2121 21

22 22 22

23 23

23

24 24 24

25 25

25

27

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

-1.0-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

PC1

PC3 PC2

1 1

1

2 2 2

3

3 3

4

4 4

5 5

5 6

6 6

7 7 7

8 8 8

9

9 9

10 10

11 11 10 11

12 12 12

13 13

13 14

14 14

15 15 15

16

16 16

17 17

17

18 1818

19 19

19

20 20

20 21

2121

22 22 22

23 23 23

24 24 24

25 25 25

圖四、25 個芥藍種原之 3D 主成分分析圖

以 7 個性狀資料進行主成分分析，每個種原以小區為單位。點左方之數字為種原代號，詳如表一。第一軸（PC1）對整體變異之解釋力達 54.95%，第二軸（PC2）

對整體變異解釋力達 16.63%，第三軸（PC3）變異之解釋力達 13.60%。黃色及藍色標示為黃花芥藍種原，按編號對照為 1：黃花芥藍 A，3：黃花芥藍 B，4：黃 花芥藍 C，5：黃花芥藍 D，6：黃花芥藍 E，7：黃花芥藍 F，8：黃花芥藍 G，10：黃花芥藍 H，11：黃花芥藍 I，13：黃花芥藍 J，15：黃花芥藍 K，16：黃花 芥藍 L，17：黃花芥藍 M，20：黃花白芥藍 N，22：黃花芥藍 O。黑色標示為白花芥藍種原，按編號對照為 2：‘珍巧黑格林’，9：白花大心芥藍，12：青格藍，

14：白花大心格藍，18：‘吃心芥藍’，19：明豐 2 號黑芥藍，21：‘翠津’，23：‘蕙津’，24：‘翁山’，25：‘翠寶’。

28

二、 遺傳歧異度分析

(一)、 SSR 分子標誌之歧異度

首先以 6 個芥藍種原各逢機挑選 4 個個體進行 PCR 擴增及洋菜膠片水平電 泳，篩選具多型性之分子標誌。如圖五，分子標誌 BnEMS1119 可粗估於 24 個 個體中約有 3 個不同的對偶基因，即此分子標誌於種原間具有多型性。再觀察黃 花芥藍 A 之 4 個個體（樣品 1-4 ），其中至少擴增 2 個不同對偶基因，樣品 1 與樣品 2 為異結合（heterozygote），樣品 3 及樣品 4 為同型結合（homozygote），

表示此分子標誌在黃花芥藍 A 種原內亦具有多型性。由於分子標誌 BnEMS1119 可有效偵測種原間及種原內異結合個體，故為適合應用於遺傳歧異度分析之分子 標誌。以此原則進行快速的多型性分子標誌之篩選，64 個分子標誌經篩選後入 選 29 個具多型性之分子標誌。為求精確鑑定對偶基因片段大小，以 Multiplex -ready PCR 對 29 個多型性分子標誌進行擴增，經毛細管電泳辨識對偶基因片段 大小後，選用 20 個基因型擴增穩定之多型性分子標誌（表二），應用於在 26 個 種原，共 520 個個體之遺傳歧異度分析。

29

圖五、SSR 分子標誌 BnEMS1119，應用於六個種原之 PCR 產物於 2.0%洋菜膠 片之電泳結果

編號 1-4： 黃花芥藍 A。編號 5-8：珍巧黑格林。編號 9-12：黃花芥藍 B。編號 13-16：

黃花芥藍 C。編號 17-20：明豐 2 號黑芥藍。編號 21-24：黃花白芥藍 N。圖中最左及最 右為 20 bp DNA Ladder (20-500 bp) 。

20bp ladder

20bp ladder

100bp

500bp

30

20 個分子標誌對參試個體擴增之完成率最低為 95.6％、最高為 100％，平均 為 99.0％。 20 個分子標誌共擴增 80 個對偶基因。圖六及表四中，單一分子標 誌偵測出不同對偶基因數介於 2－11 個，多數分子標誌偵測出的對偶基因數為 2 至 4 個，而偵側對偶基因數目 3 個者最多，為 fito316 等六個分子標誌。偵測最 多對偶基因數目為 CHT_11，可偵測 11 個，平均每個分子標誌偵測之對偶基因 數為 4 個 （圖六及表四)。各分子標誌主要對偶基因出現之頻度介於 0.37－0.89，

其中 15 個分子標誌超過 0.5。基因歧異度（expected heterozyosity）介於 0.19－

0.72 之間，多型性訊息含量（PIC）則介於 0.18－0.68，PIC 值小於 0.25：只具 有少量資訊；PIC 值介於 0.25 到 0.5 之間，具有中等資訊量；PIC 值大於 0.5，

具有高度資訊量（Bostein, 1980）。其中 PIC＜0.25，具有少量資訊之分子標誌為 4 個，佔 20 個分子標誌之 20%，PIC 在 0.25－0.5，具有中等資訊量者有 10 個分 子標誌，佔 50%，PIC＞0.5，具有高度資訊量有 6 個分子標誌，佔 30%（表四）。

31

Number of alleles per marker

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Nu m ber of mark ers

0 1 2 3 4 5 6 7

圖六、依多型性對偶基因擴增數目統計之 SSR 分子標誌數量分布

32

表四、20 個分子標誌之歧異度參數

Marker No. of Alleles Major Allele

Frquency Gene Diversity PIC

BnGMS160 2 0.77 0.36 0.29

BnGMS543 4 0.76 0.39 0.36

BoGMS486 5 0.62 0.48 0.38

fito316 3 0.84 0.27 0.25

BnGMS539 2 0.86 0.25 0.22

BnEMS1119 4 0.51 0.60 0.53

BnGMS634 4 0.73 0.41 0.35

BnGMS98 3 0.37 0.66 0.59

BoGMS1166 4 0.58 0.56 0.49

BoGMS561 3 0.59 0.54 0.45

Ol13-E08 6 0.42 0.72 0.68

BoGMS1382 2 0.88 0.21 0.18

BnEMS954 3 0.87 0.24 0.22

fito472 2 0.50 0.50 0.37

CHT_11 11 0.63 0.57 0.54

CHT_20 5 0.59 0.49 0.38

CHT_22 7 0.55 0.65 0.62

CHT_46 3 0.46 0.64 0.57

CHT_50 3 0.47 0.56 0.46

CHT_28 4 0.89 0.19 0.18

mean 4 0.64 0.46 0.41