Department of Nature Resources National Ilan University Master Thesis

全文

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國立宜蘭大學自然資源學系(研究所) 碩士論文

Department of Nature Resources National Ilan University

Master Thesis

台灣紅豆杉優良營養系插穗再生能力之研究

Studies on the Root Regenerate Ability of

Taxus sumatrana (Miq.) de Lab Superior Clones by Cutting

指導教授:林世宗博士

Shu-Tzong Lin Ph. D . 何政坤博士 Cheng-Kuen Ho Ph. D.

學生:莊雅惠

Ya-Hui Chuang

中華民國九十七年一月

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中文摘要

台灣紅豆杉(Taxus sumatrana)其枝 葉含有治癌療效的紫杉醇(Taxol),與 合成紫杉醇的重要前驅物 10-DAB (10-deacetyl baccatin III),但其含量卻因 為種源、單株而有極大差異,目前致力研究的方向,便是由篩選出含 10-DAB 或紫杉醇高的單株,並以無性繁殖方式大量培育優良品系,提供生產利用。

由於台灣紅豆杉天然母樹發根率不高,單株間發根情形差異也很大,

扦插發根期間更長達半年以上,故本研究以來源含高 10-DAB 之營養系枝 條部位、吲哚丁酸(Indole butyric acid, IBA)及季節等處理進行扦插試驗,以 比較各營養系間的發根品質,並探討健化處理對扦插苗發根情形的影響。

結果顯示不同營養系間的插穗發根情形呈顯著差異,以 D7 品系之發根 率 88 %最高;半褐化枝條之發根與新梢生長情形皆優於綠枝, IBA 處理對 促進發根無顯著效果;以冬季扦插之發根與新梢生長情形最好。健化試驗 處理間的平均根長、最長根長呈顯著差異,顯示苗木出栽前減少灌水量並 施肥能促進根部生長。

本研究中並發現台灣紅豆杉插穗的發根率在營養系與插穗部位、季節 皆有交感效應,因此選擇發根能力佳的營養系十分重要。由高發根率之 3 營養系進行 10-DAB 分析,發現其中發根率最高之 D7 的當生年枝葉之 10-DAB 濃度也最高,達 5,350 ppm,說明其不僅是發根能力佳的營養系,

也是擁有高產 10-DAB 性狀之優良營養系。

關鍵詞:台灣紅豆杉、營養系、扦插、枝條部位、IBA、季節、10-DAB

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Abstract

As Taxus sumatrana contains Taxol and 10-deacetyl baccatin III(10-DAB), that is the important precursor for synthesizing Taxol. But the content of Taxol has extremely difference genetically. At present, we are devoted to screen clone with the high taxol concentration, and to improve the vegetative propagation for suppling such anticancer materials efficiently.

However, it is difficult to root the cutting stock from T. sumatrana mature tree. The rooting ability has great different among clones by cutting method and rooting period is needed over half year. Our studies were focus on the effects of clones, position of shoot, IBA treatment and cutting season on rooting quality of cutting.

The result showed that significant difference in rooting ability among the clones, the highest root is clone D7(88%), rooting and shoot sprouting of semi-lignified shoot are superior to green shoot. However, the enhance rooting ability induced by the IBA treatment reveals no significant effect. Rooting ability and new shoot sprouting was best as cutting in winter. We also find were different significantly the mean of root length and the maximum root length that indicate the operation of fertilizing and reducing watering before planting could stimulate the growth of root.

There have interaction among clones, position of shoot and season for rooting ability of cutting. While it is very important to choose the potential rooting clone, clone D7 also have the highest 10-DAB concentration (5,350 ppm) in the current needles. It reveals D7 is a higher rooting ability clone and performed a higher production of 10-DAB as well.

Key words:Taxus sumatrana, clone, cutting, the position of shoot, IBA, season, 10-DAB

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誌謝

論文能順利完成,得感謝恩師 林世宗教授與 何政坤博士的悉心教 導,除了在研究方向的啟發與研究期間的種種協助、建議外,更不間斷的 關心、鼓勵我,並給予論文撰寫上足夠的自由空間,在此謹表學生最誠摯 的感謝與敬意。

再來得感謝口試委員王亞男博士、游漢明博士及陳子英博士,在百忙之 中抽空詳閱學生論文並不吝指導,使學生能再以不同的角度思索與分析,

讓撰寫的內容與立論更加充實,整體論文因此更臻完善。

也感謝林試所陳國峰先生指導並協助採穗相關事項;吳立德先生在統 計方面的教導;黃芷雲小姐協助精密的 10-DAB 分析;林試所福山研究中 心張淵順先生負責管理苗圃溫室並協助調查;學弟妹在扦插調查期間撥冗協 助。當然,林試所在這期間所提供的人員、技術、儀器協助;林試所福山 研究中心提供研究場地,也是這研究能順利進行的主要原因,在此一併致 謝!

另外,謝謝基於私人情誼,於研究期間及參考資料取得時,雪中送炭的江 協堂老師,讓我解決不少難題。當然,最後一定得謝謝我的另一半吳信義,

於就讀期間對我無條件的付出、包容與全力支持,讓我無後顧之憂,專心 完成學業。

再次感謝關心我的家人、師長與朋友們,由於你們,我才能在離開學校 多年後,再度重返校園學習,並於年近不惑時,完成碩士學業,謹將此喜悅 與你們共享。

莊雅惠 謹致

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目錄

中文摘要………..ⅰ 英文摘要………..ⅱ 誌謝………...…ⅲ 目錄………..……ⅳ 圖目錄………...ⅶ 表目錄………... ⅷ

壹、前言………1

貳、前人研究……… 3

一、台灣紅豆杉生態概述………3

二、紫杉醇的生產方式………6

三、台灣紅豆杉的培育技術……….10

(一)天然下種………..10

(二)種子繁殖………...…11

(三)組織培養………..………....11

1、胚培養……….………11

2、微體繁殖……… 12

(四)扦插………..…13

1、穗條部位………13

2、樹齡………14

3、母樹性別……….15

4、插穗繁殖的物理環境………15

(1)儲藏處理………..……….15

(2)插穗葉面積………...…..16

(3)發根介質………...…..17

(6)

(4)環境控制因子………..………..18

5、插穗繁殖的化學環境………...………19

(1)浸泡高錳酸鉀溶液…………..………..19

(2)施用生長激素………..………..………..………..20

6、插穗繁殖的生物環境………22

參、材料與方法………23

一、試驗地概述………23

二、插穗來源………23

三、不同營養系插穗發根之比較……….………24

四、扦插苗健化處理試驗……….28

五、採穗部位與 IBA 濃度對不同營養系插穗發根之影響………...30

六、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響……….………32

肆、結果………34

一、不同營養系插穗發根之比較………....…34

二、扦插苗健化處理試驗……….…38

三、採穗部位與 IBA 濃度對不同營養系插穗發根之影響…………..… 39

四、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響………43

(一)扦插季節對不同營養系插穗發根之影響……….…...…43

(二)扦插季節、採穗部位與 IBA 濃度對不同營養系插穗發根之影 響………...……47

伍、討論………50

一、不同營養系插穗發根之比較……….………50

二、扦插苗健化處理試驗……… 52

三、採穗部位與 IBA 濃度對不同營養系插穗發根之影響…………..… 54

四、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響……….……58

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陸、結論………60

柒、參考文獻………64

捌、附錄………..………..74

一、採穗部位與 IBA 濃度對不同營養系插穗發根之比較………...74

二、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響-冬、春、夏間不同營養系 插穗發根之比較………...79

三、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響-冬、夏間不同營養系插穗 發根之比較...80

四、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響-扦插季節、採穗部位與 IBA 濃度對不同營養系插穗發根之比較...81

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圖目錄

圖 1 福山植物園溫室外觀..……….………...62

圖 2 信賢苗圃採穗………..……....………62

圖 3 插穗切口沾以 IBA 粉劑………….….…….………..…62

圖 4 福山植物園溫室台灣紅豆杉扦插試驗……….…….………..…..…62

圖 5 扦插苗室外健化………..…...…………....……....…62

圖 6 由主根(不定根)長出側根…………..……….……62

圖 7 扦插抽芽……....………....…..63

圖 8 插穗切口沾以 IBA 粉劑………..…63

圖 9 扦插 42 週(2005/11/16~2006/9/9)發根率最高之 6 營養系的發根趨勢....36

圖 10 不定根在癒合組織形成………..………..………63

圖 11 實驗式採穗園區………63

圖 12 扦插 34 週(2006/3/4~2006/10/28)之的綠枝、半木質化枝條發根趨勢...40

圖 13 冬、夏兩季發根率最高之 5 營養系的發根趨勢…………...………46

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表目錄

表 1 2005 年 11 月 16 日扦插之營養系數量與穴盤數..………...…….25

表 2 2006 年 7 月 1 日進行健化試驗之營養系數量與穴盤數………. …28

表 3 2006 年 3 月 5 日扦插之營養系編號及數量………... 31

表 42006 年 8 月 15 日夏插之營養系編號及數量………. 33

表 5 營養系間發根率與發根品質及新梢生長之變異分析………..…………34

表 6 各營養系插穗的發根率與發根品質及新梢生長比較………..…………34

表 7 各營養系與不同葉齡間 10-DAB 濃度之變異分析……….……….…….37

表 8 各營養系不同葉齡之 10-DAB 濃(ppm)………..……...…………37

表 9 健化處理間發根率與發根品質及新梢生長形………..38

表 10 插穗部位、IBA 濃度與營養系間發根率與發根品質及新梢生長之變異 分析……….………. 40

表 11 插穗部位、IBA 濃度對營養系插穗的發根率與發根品質及新梢生長比 較………...…41

表 12 不同季節間營養系發根率與發根品質及新梢生長之變異分析………43

表 13 不同扦插季節對營養系插穗的發根率與發根品質及新梢生長比較…44 表 14 冬、夏間營養系發根率與發根品質及新梢生長之變異分析…………45

表 15 冬、夏間營養系插穗的發根率與發根品質及新梢生長比較……..…..46

表 16 插穗部位、IBA 濃度與營養系在春、夏兩季的發根率與發根品質及新 梢生長之變異分析……….………...….47

表 17 插穗部位、IBA 濃度對營養系插穗在春、夏兩季的發根率與發根品質 及新梢生長比較……….48

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壹、前言

1971 年首度由太平洋紫杉(Taxus brevifolia)的樹皮中分離得到的紫杉醇 (Christopher, 1993)經證實對卵巢癌與肺癌等具有相當好的治療效果,但由 於 太 平 洋 紫 杉 數量不多、 生 長 緩 慢 ,且樹皮再生技術尚未被掌握,實難經由 致死性的剝 除 樹 皮方 式 來 生 產 紫 杉 醇 。目前除 太 平 洋 紫 杉 外,大 部 分 的 紅 豆 杉 屬 樹 種如曼地亞紅豆杉(T

.

× media)、英 國 紅 豆 杉 (T. baccata)、日 本 紫 杉(T. cuspidata)、 加 拿 大 紫 杉 (T. canadensis)、 中 國 紅豆杉(T. chinensis)及 台 灣紅豆杉(T. sumatrana),均 已 分 析 出 其 枝 葉紫 杉 醇 含 量,由於紅豆杉全世 界的天然資源有限,因 此 利用不 斷 採 收枝 葉方式生產紫 杉醇或 10-DAB (10-deacetyl baccatin III)成為全世界矚目的焦點,避免因開採過度而危及天 然資源,從而保持資源的可利用性。

目前的紫 杉 醇一半來自天然萃取,而另一半則是以 10-DAB 合成 ( Zhiri, 1995),且 10-DAB 不僅可合 成紫 杉 醇,也可製成紫 杉 德(taxotere),

所以目前10-DAB 的需求量有逐年上升的趨勢(Mccoy, 2004)。10-DAB 目前 主要來源為英國紅豆杉,而台灣紅豆杉有些品系枝葉內的10-DAB 濃度甚 至比英國紅豆杉還高(何政坤,1997),所以相當值得重視。

台灣紅豆杉其枝 葉雖含有紫杉醇與合成紫杉醇的重要前驅物 10-DAB,但其含量卻因為單株、種源的不同而有極大差異,因此篩選 10-DAB 與紫杉醇含量高的紅豆杉單株,配合無性繁殖方式生產及萃取(何 政坤,1997)。而目前紫杉醇主要的來源是由枝葉生產提煉,如能以優良品 系插穗大量扦插,使苗木的遺傳性狀都跟原來的母樹一樣,再以密集栽培 方式,將可提高單位面積之枝葉生產量。

但由於台灣紅豆杉天然母樹發根率不高,單株間發根情形差異也很 大,扦插發根期間更長達半年以上,因此如何增進發根率、縮短發根期與 提高發根品質是培育優良扦插苗的要項。本研究以含有高10-DAB 之營養

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系林木進行不同枝條部位、不同濃度的吲哚丁酸(Indole butyric acid, IBA)、

不同季節等處理之扦插試驗,觀察這些因子對發根率、發根期與發根品質 之影響,發根品質包括了發根數、發根長度與側根生長。其與出栽後之存 活、適應能力息息相關,另外,我們也進行新梢生長之調查,調查項目為 抽芽數與抽芽長度,希望藉此對扦插苗整體發育有更完整的瞭解。

本試驗藉由上述各項實驗來瞭解無論是在供穗之枝條部位、IBA 處理、

及扦插季節的應用等扦插要項對各台灣紅豆杉發根的影響,並比較營養系 間之變化,以祈能更有效的篩選與繁殖台灣紅豆杉苗木,提供生產此等抗 癌物質之優良材料。

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貮、前人研究 一、台灣紅豆杉生態概述

全世界紅豆杉屬植物約有8~10 種(Li and Keng, 1994),分布於北半球北 美、歐洲、亞洲許多國家,是生長非常緩慢的常綠喬木或灌木(Rudolf, 1974),為孑遺樹種。紅豆杉屬植物大多為雌雄異株,如台灣紅豆杉及歐美 紅豆杉屬的樹種都是雌雄異株,常藉由鳥來散播種子(bird-dispersed),但分 布在加拿大東南部和美國東北部一帶的灌木型加拿大紫杉卻是雌雄同株 (Allison, 1991),不過偶爾也發現有雌雄異株的植株。另外在雌雄異株的太 平洋紫杉上也曾發現,雌枝上有雄蕊枝條,或雄株上有雌蕊枝條的情形發 生(DiFazio et al., 1997)。

紅豆杉屬植物數量稀少,在歐美、日本常被人工培育用來當做庭園觀 賞或綠籬(吳榜華等,1996);在蘇俄中部,只在植物園裏才有;美國的太平 洋紫杉只分布在西北部奧勒岡州等少數地區;而台灣僅有一種,即為台灣 紅豆杉。

台灣紅豆杉(Taxus sumatrana (Miq.) de Laub),又稱紅杉、紫杉、華紫 杉、南洋紅豆杉,在中國大陸則稱其為南方紅豆杉,認為係中國紅豆杉的 變種(T. chinensis var. mairei ( Lem et Levl.) Chent et Fu),分布在中國南部(中 國科學院植物志編輯委員會,1978)。

台灣紅豆杉為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉(紫杉)屬 (Taxus)的稀有、瀕危 原生裸子植物之常綠大喬木,最高可達15 m,胸 徑 可達 1 m 以上(Li and Keng, 1994)。其葉片為線狀披針形,長 1.2~2.7 cm,寬 2~2.5 mm,先端 尖銳,葉背具兩條不明顯黃綠色氣孔帶,樹皮灰紅色,有縱向細裂縫,會 有不規則的片狀剝落,留下雲形剝落痕,開花期為每年3~4 月,11 月間種 子成熟,略呈鈴鐺形,成熟的種子外面包裹著一層紅色假種皮的肉質構造,

微甜的種子是鳥類、松鼠的最愛。

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喜馬拉雅山以東至中國東南部、台灣至馬來西亞一帶(Li and Keng, 1994) 都有台灣紅豆杉的分布,在本省則廣泛而零星的散生於插天山、鹿場大山、

大甲溪上游之兩岸高地、八仙山、埔里之翠峰、東北部之太平山、木瓜山、

林田山,西部之巒大山、阿里山至南部之大武山等海拔1,000-3,000 m 地區 之針葉闊樹林中(柳榗,1966;劉業經,1980)。

台灣紅豆杉常生長在山腰、稜線上或崩塌地、石礫地等較惡劣的環境 下,且少有被壓情形,所以除上述由動物播種不易外,林下天然下種小苗 也相當稀少(蔡碧麗,1997),在稜線上枯枝落葉層較薄,且具腐植質土壤或 石礫地附近發現的小苗,因為此處土層淺薄,保水性差,每遇冬季久旱不 雨、下霜,苗株即枯萎甚至死亡;而在紅豆杉母樹樹冠林下的種子,卻因 枯枝落葉層太厚,無法接觸土壤而不能成苗,而即使各項條件合適,種子 還需經過1.5 年以上的休眠(簡慶德等,1994)才能順利發芽,族群繁洐著實 不易。

生長緩慢,年輪密度高,材質緻密富彈性,觸感溫潤細緻,不反翹,

耐水濕,不易蟲蛀,能長久使用是台灣紅豆杉的材質特性,其可供做建築、

高級家具 (王松永,1983;王進發,2004);過去明清兩代文武百官上朝所 執的奏板,與皇帝安寢時用的枕頭,也曾用紅豆杉屬植物精雕細琢而成(洪 良浩,1997);不僅如此,台灣紅豆杉樹如其名,木材呈美麗的天然紅豆色 澤,外層邊材則白裡泛黃,紋路優美,且木材纖維交互扭曲,作為雕刻、

藝品皆十分脫俗精巧。

紅豆杉屬植物從前即是中國、美國、印度、日本等國家的傳統用藥(伊 伬凡人,1968)。美國印地安人利用它來治療許多疾病如腎臟病、壞血病甚 至是結核病 (Christopher, 1993)等,在甘偉松(1977)編印的《藥用植物學》

中也曾記載紅豆杉枝葉、樹皮有降低血糖、治糖病與腎炎的效果,近來更 因紫杉醇的發現,而使得紅豆杉屬的植物深受矚目。

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紫杉醇(taxol,或譯泰克索,簡稱 TX)是從紅豆杉屬植物中分離純化得 到的針狀結晶物。早在1963 年時,北卡羅來納州(Nortn Carolina)三角研究 所(Research Triangle Institute )的藥物化學家 Monroe Wall 即首次收到由美 國 癌 症 研 究 所 (National Cancer Institute, NIC)所寄來的可對抗老鼠血癌細胞之 第一個太平洋紫杉樣本,但直到1969 年才能分離出太平洋紫杉樹皮中之活 性成分並將它命名為「紫杉醇」(Christopher, 1993),接著由 Wane et al.在 1971 年完成紫杉醇的化學結構分析,鑑定其為複雜的雙萜化合物(diterpenoid)。

美 國 癌 症 研 究 所於 1958~1980 年針對 35,000 種植物進行分析研究,在 110,000 種可能具有抗癌療效的化合物中,紫杉醇經篩選為 1980 年代以來 最具潛力的天然抗腫瘤藥物,更被稱為:「90 年代希望之藥!」(Christopher, 1993)。

1995 年美國藥物食品局(US Food and Drug Administration, FDA)正式批 准紫杉醇用於治療卵巢癌與乳癌,迄今除治療卵巢癌、乳癌外,也已大量 使用在小細胞肺癌、惡性黑色素癌、愛滋病相關的卡波西肉瘤(Karposis sarcoma)與白血病等。

紫 杉 醇是植物內的「二次代謝物」中的萜類。二次代謝物是指植物主要 生化代謝路徑中沒有出現的化合物,如生物鹼、酚、單寧、類固醇等種類 相當多,它們是細胞生命活動或植物生長發育正常運行的非必需小分子化 合物,其生產和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性。

二次代謝物的產生一般認為是植物在長期進化中對生態環境適應的結果,

由於植物無法自由移動,所以身上產生防禦物質以抵抗蟲害、低溫、草食 動物的取食(Christopher, 1993)等外來環境壓力,保護自己。

一株100 年生的太平洋紫杉樹皮只有約 3 kg,其中的紫杉醇含量很低,

只能提煉出300 mg,大約是一次的劑量;如果以治療一個卵巢癌病患需要 2 g 的紫 杉 醇來說,約需 3-12 株太平洋紫杉的樹皮,估算在美國一年約需

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24 kg 來治療卵巢癌病患(Christopher, 1993),且紫杉醇可治療多種癌症,推 測需要量將超過500 kg (Gibson et al., 1993),需砍伐百萬株以上的太平洋紫 杉。由 於 太 平 洋 紫 杉零星分布在美國西北地區(Booth, 1997),例如華盛頓 州和奧勒崗州等,有些更位於斑梟的禁伐區內,數量有限,加 上 其生 長 緩 慢 ,實難 以 經 由 長 期 剝 除 樹 皮 的 方 式 來 生 產 紫 杉 醇 ,因此尋找可再生的 材料成為世界性的目標(Christopher, 1993)。

目前為止,稀有的紅豆杉屬植物仍是紫杉醇的唯一來源(Han et al., 1994) 從 1988 ~1995 年 間 , 大 部 分 的 紅 豆 杉 屬 樹 種 除 太 平 洋 紫 杉外 , 英 國 紅 豆 杉、 日 本 紫 杉或加 拿 大 紫 杉、 中 國 紫 杉等,均 已 分 析 出 其 枝 葉中紫 杉 醇 含 量 ,台灣紅豆杉(何政坤等,1997)亦不例外。紫杉醇的含量會因不同樹種、

單株的遺傳而有差異,亦會因不同組織、甚至環境(採集季節、光照條件) 而異,最高含量約為乾重的0.01-0.045 % (何政坤等,1997;Jaziri, 1996)。

台灣紅豆杉除含有紫杉醇外,還有合成紫杉醇的重要前驅物10-去乙醯 巴卡亭III (10-deacetyl baccatin III, 10-DAB) 與巴卡亭 III (baccatin III, BC) (何政坤等,1997)。與國外紅豆杉相比,臺灣紅豆杉優良單株的紫杉醇最高 含量約相當於國外優良品種的含量(300-882 ppm),BC 含量則偏低,但 10-DAB 含量卻為英國紅豆杉 1,000 ppm(國外目前所知含量最高者)的 3 倍,

顯示台灣紅豆杉並不輸給國外的品種,甚至有其獨特的成分變化(何政坤 等,1997),但其含量不但在不同族群間或同一族群內的變異非常大,而且 不同季節採收或採收後處理過程都會影響其含量 (何政坤等,1997;何政坤 等,1999;何政坤等,2000)。

二、紫杉醇的生產方式

紫杉醇在紅豆杉屬植物的樹皮、針葉、根及植株的其它部分都有發現,

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1974)的限制,所以為維持紫杉醇的產量,除發展更有效的方法來繁殖此樹 種外(Eccher, 1988),目前正努力試圖全部合成、半合成、從可再生的針葉 萃取或用組織培養法(張淑華等,1996;何政坤等,2003)等方式生產紫杉醇。

現今全世界生產紫 杉 醇的方式計有五種:

(一)全合成法

在法 1994 年實驗成功,化學家可在試管內完全合成紫杉醇,步驟 超過 30 個,但產率只有 0.05%,現由於步驟多,且回收率低,因而無 法達到商業化量產的目的,仍屬於研究階段(Nicolaou et al., 1994)。

(二)真菌提煉

從太平洋紫杉上的寄生真菌 Taxomyces andreanae 中也可提煉紫杉 醇。由於真菌生長十分快速,用來生產紫杉醇相當看好,不過目前還 不到商業大量生產的規模(Stierle et al., 1993)

(三)半合成法

目前的紫 杉 醇的來源有一半來自天然萃取,而另一半則是以紫 杉 醇前 驅 物 如 10-DAB 或 BC 為起始物以半合成法製成,生產的步驟較 少,回收率也較高 ( Zhiri, 1995)。其中 10-DAB 不僅可合 成紫 杉 醇,也 可合 成與紫 杉 醇 相 同 功 效但水溶性較佳 的 抗 癌 藥 物紫 杉 德(taxotere),

所以目前10-DAB 的需求量有逐年上升的趨勢,甚至預估在 2008 年其 需求量會是紫 杉 醇的兩倍左右(Mccoy, 2004)。

現今10-DAB 市價約$2.5 萬/kg,主要來源是在英國紅豆杉,其枝 葉的10-DAB 濃度約達 1,000 ppm,而台灣紅豆杉枝葉的 10-DAB 甚至 比英國紅豆杉還高,所以相當值得重視。

(四)枝葉生產

採收枝葉提煉紫杉醇是目前最快速且經濟可行的方法。利用可 再生的枝葉而非樹皮提供原料,萃取紫 杉 醇,可永保紅豆杉資源的供應

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不絕。目前研究的方向,便是篩選出單株針葉內紫杉醇或紫杉醇前驅物 含量高的紅豆杉種源,以促進紫杉醇的生產。

台灣紅豆杉稀疏的分布在山區,有許多胸徑大於100 cm,估計其 年齡超過1,000 年的大樹(何政坤等,1997)。何政坤等(1997)曾實驗這些 選出來之優良品系之紫杉醇與10-DAB 的濃度,發現這些植株之扦插苗 也和母樹同樣含有高濃度的紫杉醇與10-DAB,且扦插苗針葉內紫杉醇 濃度甚至高過原來的母樹,這表示未來以扦插苗來增加紫杉醇的生產是 十分可行(何政坤等,1998)。

台灣紅豆杉生長緩慢,如果以用材為主,需要栽植百年以上,同 時必須使用具有直立枝條的苗木或種子苗,但如果是純粹的利用枝葉來 提煉紫杉醇,由側枝或直立枝條來繁殖並無差異,反而因側枝來源豐 富,更易獲得大量枝葉(何政坤,2005)。

目 前 林試所已 將 這 些 優 良 營 養 系 苗 栽 植 到 林 地 ,利用枝葉剪枝機 採收五年生台灣紅豆杉營養系園,結果修剪容易快速,修剪後六個月的 苗木枝葉即可恢復原來的樹勢,故台灣紅豆杉栽培園可以枝 葉 採 收的 茶園模式經營,使未來種植紅豆杉就像經營茶園一樣有效率(何政坤,

2002)。

1991 年美國必治妥(Bristol-Myers Squibb)與 Weyerheauser 公司結盟 生產太平洋紫杉,其利用集約經營扦插繁殖營養系的生物量是紫杉醇穩 定的供應來源。估計Weyerheauser 公司在 1998 年已繁殖出超過 3000 萬株以上的苗木作為紫杉醇的生產來源 (Patel, 1998)。

(五)細胞培養

細胞培養為生產植物二次代謝物的方法之一,如紅豆杉,就是找到 含高紫杉醇的葉片、莖段,以細胞培養誘導癒合組織,再將癒合組織以 液體培養成懸浮細胞,利用生物反應器大量生產細胞,再由細胞與培養

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液萃取紫杉醇。

張淑華等(1996)利用台灣紅豆杉的針葉、莖段、根、胚及胚乳等材 料來誘導癒合組織,發現針葉及莖段為誘導癒合組織的最佳材料。而廖 哲正(2004)則發現莖培植體的紫杉醇含量比葉的培植體含量高出二倍 多。而紫杉烷類(taxane, 紫杉醇、10-DAB、BC 為最重要的三種成分) 含量,在不同的細胞系(cell lines)間差異很大,以紫杉醇為例,含量最 高者為439 ppm,最低者則趨近於 0 (張淑華等,1996),且不同細胞株 其生長速度也不同,不過細胞系生長速度與紫杉醇含量無關(張淑華 等,2004)。另一方面,使用成熟母樹的體細胞來組織培養比用幼年母 樹的變異較少(Lee, 1988),可使整個培養期間的變異風險變少。

在紅豆杉屬植物癒合組織增殖的過程中,隨著時間增加,癒合組織 會有些許褐化的現象,那是因為酚類化合物增加的緣故(Dubravina et al., 2005),酚類化合物會阻礙細胞的逆分化和癒合組織的形成,酚類化合 物愈多癒合組織的形成愈慢,並造成癒合組織細胞的老化,且導致細胞 死亡。目前台灣紅豆杉癒合組織增殖過程中,可藉由繼代培養時細胞密 度與新舊培養基比例來減少細胞褐化的問題,並使細胞快速生長 (張淑 華等,2004)。

但經長期培養在高濃度生長激素中的細胞很容易喪失紫杉醇的生 產,為了提供遺傳穩定的材料來源與細胞株,通常需要每1.5 個月繼代 培養一次,這需要高素質的人力與大量的培養基來維持,因此目前已研 發出利用低溫保存法,以12 0C 黑暗下可保存 1.5 年來維持台灣紅豆杉 的種質活力,此條件下莖芽(shoot)可以達到 87 %的存活率(張淑華等,

2005),並且不影響紫杉烷類的濃度。此外,更發展出以農桿菌為媒介 的轉殖法,促進細胞產生腫瘤或不定根的生長激素基因,使細胞可在不 含生長激素的培養基中快速增殖,以避免植物體長期培養於生長激素

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中,容易產生突變的問題,因此提高利用紅豆杉細胞生產紫杉醇的潛力。

利用紅豆杉細胞培養方法生產紫杉醇,其成功的主要關鍵,首在細 胞篩選,最好的細胞系應具備生長快速、不易褐化、紫杉醇含量高(Zhong, 1995;Hirasuna et al., 1996)且長期培養不會降低生產力等特性。另外,

Hirasuna et al.(1996)認為組織培養細胞在紫杉醇的合成過程對環境的變 化很敏感,產量會受各種條件因子影響,如細胞之起始密度、培養基組 成、繼代時間和溫度等都必須嚴格控制,再加上後續的紫杉醇誘導與生 物反應器放大試驗,才能成功的利用細胞培養生產紫杉醇(Zhong, 1995)。

三、台灣紅豆杉的培育技術

台灣紅豆杉目前因木材與紫杉醇的需求及其繁殖上的困難而造成此生 長緩慢樹種的危機(Chang et al., 2001)。其數年才有一個結實豐年,種子產 量少且易遭鳥食,又發芽不易,扦插也屬發根困難樹種,但為保存與維護 紅豆杉族群不致日漸衰退,除母樹天然下種外,人們仍由種子繁殖、扦插、

嫁接與組織培養(胚培養、微體繁殖)等方法中,尋求出合適的人工方式加以 增殖(Jaziri et al., 1996)。

(一)天然下種

天然台灣紅豆杉母樹樹冠下因枯枝落葉層過厚,種子無法接觸土壤 而影響其發芽率,蔡碧麗(1997)實施林下整治試驗時,發現整地過後種 子掉落時可直接接觸土壤,此時若再加上適當的降水,發芽率可明顯提 高。林世宗與簡文村(1997)則指出,紅豆杉苗栽種時光度增加有利其生 物量之累積,屬中性之耐蔭樹種。對現存針闊葉天然林下之台灣紅豆杉 下種苗,為改善其形質與生長,實有必要進行上層樹冠之調整,以利其

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(二)種子繁殖

台灣紅豆杉為異儲型(recalcitrant)種子,不耐乾燥,於冷藏箱進行貯 存或層積處理時,溫度不宜低於5 0C,以水苔當介質並保持濕潤即可,

但不可太過潮濕,否則可能使種子遭受凍害,或因種實胚體腐爛,而喪 失活力(簡文村與林世宗,1994)。

台灣紅豆杉種子採集不易並具有深度休眠,需要9 個月暖低溫的變 溫配合低溫層積誘導種子後熟作用和打破休眠,才能得到約 80 %的發 芽率,因此種子繁殖並不容易(簡文村與林世宗,1994;簡慶德等,

1995)。雖然種子繁殖是大量繁殖最佳的方法,且其根系因有主根,故 有較佳的固持能力 (楊冠政等

,2000),但種子苗的變異大,無法完全保

存母樹的特有基因,如紫杉醇含量高的性狀,就可能無法透過種子繁殖 而保存,所以或許無性繁殖(vegetative propagation)是另外一個選擇(許博 行,1985),但強烈的生長惰性可能會限制了植株的生產應用;在打破 種子的休眠與縮短生育週期方面,胚培養是另一個有效的方式。

(三)組織培養 1、胚培 養

台灣紅豆杉未成熟與成熟胚使用1/2MS 培養基添加 PVP(聚乙 烯四氫吡咯酮,Polyvinyl pyrrolidone)進行培養,可吸附胚內所含有 的抑制物質,並提供了胚發育時所需的養分,使原需經數月的層積 處理才會發芽的種子在二星期內達到95 %的發芽率,且此培養基不 只對台灣紅豆杉的胚培養有效,同時對太平洋紫杉、英國紅豆杉、

加拿大紫杉、曼地亞紅豆杉(母本為日本紅豆杉、父本為英國紅豆杉 之雜交種,在美國、加拿大已有80 多年的歷史)也有相同效果(Chang and Yang, 1996),如此一來即可大量培育種子苗,增加了紅豆杉族 群恢復的機會。

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PVP 是一種抗氧化劑,常用於紅豆杉屬植物的癒合組織(callus) 培養,用以減少褐化發生(張淑華等,1996),但在張淑華等(1998) 的研究中發現PVP 的抗褐效果不及活性碳(activated charcoal),活性 碳不只可以減少褐化,還可幫助芽體生長。Chee(1995)也發現活性 碳有利於太平洋紫杉的芽體抽長,此可能是跟活性碳能吸附有機 物,尤其是一些酚類化合物(phenolic compound)和一些毒素(toxins) 有關(Bon et al., 1988)。

2、微體繁殖(micropropagation)

Chang et al.(2001)使用 1/2MS 培養基添加 20 g/l 蔗

、 2.5 mg/l IBA,3 個月後能促進使 55 %的台灣紅豆杉扦插苗與 35 %天然母樹 的芽體兩者的組培苗發根,顯示以微體繁殖的方式可提高其發根 率;但在隨之而來的繼代培養,兩者都出現了褐化現象,不過在培 養基中加入1 g/l 的活性碳與 100 mg/l 的硝酸銀(silver nitrate)即可改 善80 %以上的褐化現象(Chang et al., 2001)。

利用優良種苗或母樹的莖段、芽體在試管內進行微體繁殖方 法,除可大量增殖芽體外,同時還可克服或減輕側枝培養的傾斜生 長惰性 (plagiotropism)(張淑華等,1998),此法能以側枝培育出直立 生長的苗木(Chang et al., 2001,張淑華等 1998),這是傳統扦插所無 法克服的。

由此可見,微體繁殖在大量繁殖優良品系的種源時,特別是經 過篩選具有高量紫杉醇的單株及使能直立生長的組培苗,是很有效 的方法。

雖然利用組織培養方法,可以使胚、莖段或芽體發根成苗,但需在 無菌操作下進行培養,最後小苗還須經健化處理,才能移到苗圃,技術 層面較高,操作不易(簡慶德等,1994)

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(四)扦插

無性繁殖不僅是對以種子培育困難或雜交無種子的樹種來說非常 重要,在對大量繁殖優良基因上更是個關鍵,如能以優良品系插穗大量 無性繁殖,使苗木的遺傳性狀都跟原來的母樹一樣,經過密集栽培,所 得的收益會比隨意栽植的苗木的收益高上許多。在無性繁殖中,扦插法 是一種比嫁接、微體繁殖更為普遍、直接、經濟有效的方法。

Hartmann and Kester (2002)將 de novo (anew, 再生)型態之不定根形 成時發育解剖上的改變區分為四個階段,第一階段為特殊之細胞逆分化 (dedifferentiation),第二階段為根之發生(initiation),第三階段為分化 (differentiation)成根原體( root primordial)之組織,最後為根原體之伸長 (elongation)與增大突出(emergence)莖表面。

但台灣紅豆杉天然母樹穗條扦插後發根不易,扦插發根期長達半年 以上(許博行,1984;許博行,1985;何政坤等,1998),單株間的發根 率差異也很大,難發根的母樹其發根率低於10 % (何政坤等, 1998;

陳國峰等,2003)。發根困難可能是因為插穗內關於生根之輔因子 (cofactor)不足,或插穗內存有阻害生根物質(諶克終譯,1976)。影響扦 插後發根成活過程之因子很多,包括品種間差異性(陳國峰, 2000)、採 穗母株生育環境、穗條在母樹冠層時的位置與營養狀況、插穗採集後的 處理及插穗繁殖時的化學(生長調節物質、養分)與物理(光度、濕度)環 境等(張致盛與黃勝忠,1995)。

茲將與插穗扦插發根的影響因子簡述如下:

1、 穗條部位

Eccher (1988)在紅豆杉屬植物的研究中指出,頂枝發根率最 高,枝梢並帶有木質化的莖最低;在印度楝樹(Azadirachta indica) 的研究中也發現,取自同一枝條上皆為25 cm 長的插穗,發根率由

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枝條頂梢向基部遞減,頂梢比基部發根率佳或許是因其生長激素的 濃度較高,因在植物體內生長激素的含量是隨著與頂端距離愈遠而 愈低的(Palanisamy and Kumar, 1997)。

然而在 Cordia alliodora 其發根率則是由基部向頂遞減(Mesen et al., 1997),顯示其發根率是和插穗的生物量(長度、直徑)有關,

這說明了發根能力和插穗採集前和採集後的培育期間之碳水化合 物的累積有關;在陳正豐(1989)對台灣杉(Taiwania cryptomerioides) 扦插的研究中,也呈現插穗莖段之下段較上段為高的趨勢。許博行 (1985) 在台灣紅豆杉扦插實驗中曾提到,台灣紅豆杉生長緩慢,如 以當年生之枝條為插穗,其長度甚短,養分之貯藏恐不足夠發根所 需,因此扦插時要選用帶稍硬化之半木質化(頂芽且木質化部分留 3 cm)插穗的材料為主。另外,穗條在樹冠層中的位置也關係到其在 母樹時所受的光度,而光會影響荷爾蒙的濃度與移位及同化物的累 積量,以致於影響不定根的形成。

不僅如此,發根率和單株、節間位置、插穗長度、插穗直徑都 有相關(Mesen et al., 1997),如印度楝樹其直徑 0.5 cm,長度 25 cm 的的插穗發根率為100 %,直徑相同長度愈短其發根率愈低,甚至 無論其位置為何,在 5 cm 長的插穗則完全沒有發根,原因為枝條 太短者其生長激素、碳水化合物的或其它促進發根的物質含量都太 少,以致無法發根 (Palanisamy and Kumar, 1997 )。

2、樹齡

台灣紅豆杉低樹齡單株的插穗比老樹插穗發根較早且發根率 較高 (張淑華等,1998),在 Mitchell(1997)在紅豆杉屬植物的研究 中發現,低樹齡最高有70.8 %的發根率,而老樹最高只能有 48.6 % 的發根率,兩者間有顯著差異;對某些樹種,如筆柏(Juniperus

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procera),母樹的年齡甚至是影響插穗發根的最主要原因 (Berhe and Negash, 1998)。老樹插穗不易發根,其原因可能是生長激素隨著年 齡增長而降低;木質化組織增加,形態變化的速度變慢;發根抑制 成分隨著年齡增長而增加;生理老化等原因(Hartmann and Kester, 2002)。

所以,台灣紅豆杉採自高樹齡樹冠下層的插穗,因具較幼年特 徵,其發根率都高於採自樹冠上層具有成熟葉特徵的插穗(張淑華 等,1998),即使是採自同一株母樹內其半木質化插穗也能比木質化 插穗具有較高之發根率,因半木質化插穗較年輕,含較少已分化之 細胞,亦即具較多的細胞可轉變為分生組織而有助於分化為不定根 (許博行,1985)。另一方面,於枝條頂端所產生之內生根促進物質 (endogenous root-promoting substances)在年輕的半木質化插穗中含 量較多,亦有助於不定根的發生(Hartmann and Kester, 2002)。

3、母樹性別

某些紅豆杉屬植物中其雌雄比例並不相同,如加拿大紫杉其雄 株比例就多於雌株(Allison, 1991),因此也限制了種子的產量。有些 雌雄異株的樹種,其雌株與雄株在生理和形態上的性狀都有所差 異,那發根能力是否會是這些差異之一?在英國紅豆杉(Schneck, 1996)與太平洋紫杉(Mitchell, 1997)的研究中發現,雌株與雄株母樹 間扦插的發根率並沒有顯著差異,但在中國東北紅豆杉中,雌株母 樹的扦插苗發根率則優於雄株(Mitchell, 1997),由此可知紅豆杉屬 植物間性別對於扦插苗發根的影響並不相同。

4、插穗繁殖的物理環境 (1)儲藏處理

對於菊花插穗,如在扦插前能給予適當溫度、日數的儲

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藏處理,將可促進根形成,縮短發根過程,可縮短插穗在苗 床育苗時間,在大量繁殖時,並可提高苗床使用率,增加單 位時間內育苗數量(張致盛與黃勝忠,1995)。但由於插穗在 儲藏期其碳水化合物含量與儲藏溫度與時期長短呈現負相 關,隨儲藏溫度之提高與期間增長會降低其含量,因此如何 調整適當儲藏溫度及期間是相當重要的。

菊花插穗自莖頂取下時,以石蠟切片觀察,莖組織內並 無根原體存在,但經儲藏處理後,維管束周邊薄壁細胞束間 形 成 層(interfascular cambium) 部 位 即 已 開 始 根 原 體 之 分 化,而根原體在扦插後繼續發育,凸出莖表皮發育成不定 根。黃秀芳品種經儲藏4 天及 7 天後根數較多根長較長,但 經儲藏10 天後發根數減少,不同處理溫度間對其發根並無 差異;黃精進品種在儲藏4 天及 7 天與 12 及 15 0C 之處理 根數較多,儲藏10 天及 18 0C 之處理減少發根數,但根長 度較長(張致盛與黃勝忠,1995);由於菊花幼苗須具備相當 的根數(6~8 條)及適當根長(3 cm)才能定植,因此插穗發根 情形良好與否是影響扦插後育苗期長短及苗床育苗效率之 關鍵。

(2)插穗葉面積(leaf area)

葉為生長激素與碳水化合物的來源,葉面積關係到植物 本身製造生長激素與碳水化合物的能力,當然也影響到蒸散 率。各樹種製造生長激素、碳水化合物的能力與蒸散率各不 相同,其最適葉面積也不相同,如在 Milicia excelsa 中,發 根率與葉面積(0, 10, 20, 40, 60 cm2)大小成正相關,但與葉面 積20, 40, 60 cm2之間並無顯著差異,不過在發根數上,60

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cm2則比 40 cm2稍低,所以40 cm2是其最適葉面積(Ofore et al., 1996)。另一方面,葉面積愈小者,其抽新芽的比例愈高,

則發根率愈低,葉面積大小也和死亡率成負相關。

無葉的插穗的發根率非常低,有些樹種甚至幾乎無法發 根,而能發根的無葉插穗的可能原因是其在剪下之前已儲存 了足夠的養分。

(3)發根介質

合適的介質除了能固定插條外,還能供給植物理想的水 分並有良好的通氣性,提供足夠的氧氣量以利根部呼吸所 需。但每個樹種對水分、空氣的條件都不同,對介質的要求 也就不同,適當與否通常視該樹種是屬耐濕種(hydromorphic) 還是耐旱種(xeromorphic),如 Milicia excelsa 在保水性較高 的木屑能得到最佳的發根率(Ofore et al., 1996),但 Cordia alliodora 卻是在礫石中的發根率最高(Mesen et al., 1997)。

一般而言通常介質若有較高的保水性(如木屑)則能提 供 插 穗 較 多 的 水 分 , 進 而 增 加 其 氣 孔 傳 導 度(stomatal conductances, gs)與光合作用速率以提高發根率;葉部含水 量低,其發根率、地下部生物量都較低,這又強調了介質保 水力重要性(Ofore et al., 1996),尤其是對無法耐旱的樹種而 言,介質可提供足夠的水分是十分重要的,其也可使該樹種 在枝葉被剪取下來時,所面臨的突發嚴重水分喪失狀況得到 迅速的補充。

事實上介質不僅僅關係發根率,在發根品質上也有影 響,如Eccher (1988)在紅豆杉屬以沙與泥炭土之混合介質及 珍珠石兩種培養介質的試驗中發現,雖然發根率並沒有顯著

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差異,但在混合介質中所發育的不定根較為纖細、強韌且有 較多的側根。

(4)環境因子控制

光 合 作 用 在 插 穗 是 透 過 葉 片 來 影 響 不 定 根 的 形 成 (Mesen et al., 1997),通常來說,生物量的增加會關係到發 根的能力,這或許也和插穗被剪下之前所累積的生物量也有 關。而光度對插穗發根的影響在每個樹種間並不相同,如白 楊、柳樹就喜歡高光度,而光度對歐洲赤松(Pinus sylvestris) 的發根則不太有影響。

Palanisamy and Kumar(1997)研究印度楝樹中發現,其實 驗光度為戶外(1932 μmol m-2s-1)>溫室(135 μmol m-2s-1)

>蔭棚(120 μmol m-2s-1),其它的水分、濕度、溫度都相似,

最後發根率則是溫室(77 %)>蔭棚(66 %)>戶外(12 %),雖 然印度楝樹是適合低光度的,但在本實驗中溫室的光度雖稍 高於蔭棚,但發根率卻略高於蔭棚,原因可能是溫室內濕度 較高(蔭棚濕度最高 66 %,最低 11 %;溫室濕度最高 70 %,

最低65 %),由此可見濕度對插穗發根的影響性。

在非噴霧式繁殖系統(Non-mist propagator system)內,

光合作用有效輻射(photosynthetically active radiation, PAR) 昇高時,葉-空氣蒸氣壓差(leaf-air vapour pressure deficit, VPD)與葉部缺水(water deficits)的狀況也隨之增加(Mesen et al., 1997),即 VPD 和 PAR 呈正相關,在光度增強時高,蒸 散率也提高,使水逆差變大,而 PAR 和光合作用速率 (photosynthetic rates, Pn)也呈正相關,所以環境的光度、濕 度間的平衡很重要,如能使用蔭棚以保持低VPD 的同時,

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又允許足夠的光度使苗木累積生物量(Mesen et al., 1997)則 為最理想的狀態。

中國東北紅豆杉(日本紫杉)適合扦插發根的溫度是 18oC~27 oC (柏廣新等,2002);Eccher (1988)以 20oC、23oC 及26oC 的苗床溫度進行英國紅豆杉、中國東北紅豆杉與曼 地亞紅豆杉等16 個栽培品種之扦插試驗,結果顯示除了 T.

cuspidata cv. Thayerae, T. baccata cvs Barroni, Fastigiata 及 Fastigiata robusta 外,其它都是在 20oC 時較快發根。

5、插穗繁殖的化學環境

(1)浸泡高錳酸鉀(potassium permanganate)溶液

台灣紅豆杉插穗扦插前經高錳酸鉀溶液浸泡後可促進 發根(許博行,1984),可能是因為插穗內具有抑制發根之物 質(如激勃素,gibberellins, GAs)被高錳酸鉀去除或減低濃 度,或是因為插穗內之酚類化合物與高錳酸鉀作用,形成另 一種生成物後,而不具有抑制作用。因為,某些酚類化合物 在插穗發根的過程中具促進效果,某些則反具抑制現象,即 使是同一種類亦因濃度之不同而改變其抑制效應,所以推論 酚類化合物之濃度或種類的改變乃是促進台灣紅豆杉插穗 發根的原因。

高錳酸鉀溶液也可提高插穗癒合組織的形成(許博行,

1984),癒合組織為一保護組織,在插穗未發根前,一方面 可保護插穗之切面免遭細菌感染而腐爛,另一方面可透過癒 合組織的細胞吸收介質之水分供插穗使用,以保持插穗未發 根前之成活(Hartmann and Kester, 2002)。因此癒合組織之形 成對插穗之發根有間接效益。一般而言,癒合組織良好者,

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插穗之發根率亦較高,尤是發根困難之樹種,癒合組織之形 成扮演一重要角色(許博行,1984)。

(2)施用生長激素(auxin)

生長激素在各樹種的效用變異很大,從完全無效到有極 大的效用的情形都有(Ofore et al., 1996),許多研究中都發現 施用生長激素能加速插穗的發根速率,增加發根數與最終的 發根率,甚至將生長激素直接注射白梧桐( Triplochiton scleroxylon)母樹的木質部後,都能提高從該樹採下插穗的 發根率(Leakey, 1993)。

生長激素是最早發現之植物生長調節劑,1926 年由 Want 證明此成分的存在及其作用。在自然界中,生長激素 的作用包括促進植物細胞生長,誘導細胞分裂及分化、促進 發根、抑制葉、花、果實脫落、控制開花與結果等(李學勇,

1985)。IAA (吲哚乙酸,indole-3-acetic acid)為植物體內第一 個內分離出來的生長激素,較易受光氧化分解或受高溫影響 而減低或喪失其作用(林志謀,1996),通常在細胞分裂旺盛 的生長點部位最濃度最高,其餘部分只有少量存在。

生長激素在木本插穗的發根過程中扮演著舉足輕重的角色 (

Ofore

et al., 1996),早期使用 IAA 來促進發根,後換以效果 更高的人工合成生長激素,目前已有多種之生長激素被使 用,如IBA(吲哚丁酸,Indole butyric acid)、NAA(α-萘乙 酸,α-naphthalene acetic acid)、2,4-D(2,4-雙氯酚醋酸,

2,4-dichlorophenoxy acetic acid)等,其中因 IBA 性質較穩 定、不易被植物酵素分解、停留在處理部位的時間長、在一 寬廣之濃度對植物之毒害亦較低、且適用於多種植物,為最

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佳的發根促進劑 (郭幸榮與林季櫻,1986;Hartmann and Kester, 2002)。

IBA 可刺激形成層的活動和根原細胞的分化與伸長,而 提高發根率。Mitchell (1997)在太平洋紫杉與英國紅豆杉的 研究中也證實,IBA 可以增加其發根率;在其它許多研究中 也發現在添加不同種類的生長激素中,皆以IBA 的效果最 佳(溫英杰,2003;Tchoundjeu et al., 2004)。

但施用IBA 的最適劑量依不同的樹種有很大差異,如 Eccher (1988)將紅豆杉屬植物以 0、1,000 與 2,000 ppm 來試 驗時,發現2,000 ppm 為其最適濃度,不僅可提高其發根率,

也能增加其發根的速度;白梧桐為4,000 ppm,這都和 Cordia alliodora 的最適濃度 16,000 ppm 差別很大(Mesen et al., 1997)。但要注意的是 IBA 濃度太高反而會抑制發根 (Aminah et al., 1995;Mesen et al., 1997),甚至在植物組織 內長期保持過高的生長激素會造成細胞死亡(Ofore et al., 1996)。IBA 對不同樹種的致死濃度有很大的不同(Hartmann and Kester, 2002),一般過高的 IBA 劑量造成的死亡率高達 10-17 %,但深紅柳桉(Shorea macrophylla)在即使在高達 10,800 ppm 的 IBA 時,死亡率也只有 11 %,所以對不同的 樹種,其合適濃度差別很大,施用對該樹種適當濃度的生長 激素是非常重要的(王子定,1978)。

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6、插穗繁殖的生物環境

農桿根群菌(Agrobacterium rhizogenes)是一種土壤中的細菌,

會誘使許多草本植物如紅蘿蔔、地瓜、大豆及人蔘產生數量龐大 的毛狀根群,阻礙莖部及球莖的發展,而被視為病原菌,但對於 多年生木本來說,農桿根群菌並不被視為病原菌,反而有促進根 莖生長的效果(Strobel and Nachmias, 1985)。

農桿根群菌的感染有助於許多難發根的樹種發根(Bassil et al., 1 991),主要是因為農桿根群菌除了可促進插穗提早發根、提高發 根率外,其所誘導出的根,其型態和正常根相似,且因其可提高發 根數目,促進根系的生長,能使台灣紅豆杉有80 % 以上的發根率 (陳國峰等,2003)。

然不同扦插季節也會影響接種農桿根群菌促進發根的效果,

如陳國峰等(2003)台灣紅豆杉插穗實驗中,第一次發根試驗正當冬 季氣溫較低時,不利農桿根菌的生長,加上插穗正處休眠的生理階 段,使轉殖效率較差,因此接種插穗發根率表現較差;第二次試驗 扦插氣溫約在20-25 0C 間,插穗尚未進入休眠階段,正適農桿根群 菌的轉殖,故接種菌種插穗的促進效果較佳,何政坤等(2000)利用 農桿根菌接種台灣紅豆杉插穗,也顯示秋季接種比夏季接種更能提 高發根率及發根數,推測夏季溫度較高,不利農桿根菌生長與基因 之轉殖。

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參、材料與方法 一、試驗地概述

本研究四個扦插試驗皆於林業試驗所之福山植物園溫室(圖 1)內進行,

所培育之苗木則出栽至宜蘭大學大礁溪實驗林場,以建立實驗式採穗園區。

(一)林業試驗所福山植物園溫室

試驗福山試驗林位於北緯24o 46’,東經 121o 34’,介於台北縣烏來 鄉與宜蘭縣員山鄉的交界處,全區面積1,097.9 ha,海拔高度範圍為 400

~ 1,400 m,但以 600 ~ 800 m 為主。根據福山苗圃氣象觀測站的資料,

2006 年的年平均溫為 18.78 oC,最冷月均溫為 1 月的 13.88 oC,最暖月 均溫為7 月的 26.58 oC,平均年雨量為 3723 mm,年相對濕度達 91.77 %。

(二)宜蘭大學大礁溪實驗林場

實驗林場則位於宜蘭縣礁溪鄉二結村山區,年降雨量可達2700 mm 以上,年降雨日在 200 日以上。此實驗式採穗園區原為林木稀疏之 灌草叢林地,於2005 年 11 月清理灌草叢並疏開林分,依地形整治為水 平橫坡小平台階段,平台寬約1.5-2 m,面積約 0.5 ha,地面舖覆遮草布。

二、插穗來源

試驗材料來自林業試驗所位於台北縣烏來鄉信賢苗圃內之8 年生台灣 紅豆杉營養系園,園內苗木源於1994 年由林業試驗所簡慶德博士採自不同 種源之天然母樹,隔年種子發芽成苗後,選拔生長表現最佳的前10 株苗木 復於1997 年時進行扦插,1998 年在台北溫室培育 2 年後,於 2000 年時在 信賢苗圃建立營養系試驗區,園區內另有引自中國大陸之中國紅豆杉種 源,其培育方式、時期與選拔法同台灣紅豆杉。

(33)

三、不同營養系插穗發根之比較

本試驗以信賢苗圃營養系園數種來源之營養系枝條進行扦插,以比較 各營養系間的發根率、發根品質與新梢生長。

(一)插穗來源

本試驗於2005 年 11 月中旬採集林試所信賢苗圃內營養系(圖 2)包 括4 種源(台灣紅豆杉 3 種源分別以 D 代表中橫,W 為畢祿溪,Z 代表 瑞岩及CH 代表中國紅豆杉)14 個營養系各 1-7 株來源之枝條,剪取健 壯長度10-15cm 之枝穗供試驗之用。

(二)插穗處理

在林業試驗所福山植物園的溫室內進行扦插,將插穗切口沾以 3,000 ppm IBA 粉劑(圖 3),IBA 粉劑配法為將 3 g 之 IBA 充分溶於 95 % 酒精500cc,再加入 1 kg 的滑石粉,以攪拌機攪拌均勻後,乾燥磨碎而 成。

插穗扦插於以蛭石#2:蛭石#3:泥炭土=0.5:0.5:1(v/v/v) 的混合 培養介質之84 孔穴盤(7×12)內,孔穴口徑×深度 3.5 cm×8 cm,扦插深度 以枝穗下端埋入介質內2~3 cm 為準,扦插完成後即開定時始噴霧(圖 4 ),噴霧時間為間隔 30 分鐘各噴 30 秒,於 12 月中旬改為間隔 30 分鐘 各噴8 秒,但實際供水情形仍需視氣候狀況彈性調整噴霧時間與間隔時 間,以噴霧後苗木充分濕潤但無殘留水滴,並於手略施壓於介質時可感 潮濕,且無多餘水分溢出為調整參考。

扦插苗在發根調查完成後,於2006 年 9 月 18 日進行換盆,移植於 以蛭石#2:泥炭土=1:2(v/v) 的混合培養介質之 3.5 吋的黑色軟盆內,

移植完成後即開始噴霧,噴霧時間為間隔30 分鐘各噴 15 秒,並漸漸減 少供水量至間隔2 小時各噴 15 秒,每株苗木並施以緩效性肥料好康多 1 號(N:P:K=14:12:14,效用 100 天) 15 顆,置於溫室內 2 週後即

(34)

移放於室外(圖 5)。

同年11 月 22 日並將扦插發根率最高之 3 營養系(D1, D5, D7)苗木 各405 株,出栽礁溪實驗林場林道 0.8 k 處,海拔約 300 m 之地勢向陽 坡面進行採穗園的栽植,營養系以單株逢機栽植,行距1 m,株距 0.5 m,

出栽8 個月後再隨機採集 3 營養系(D1, D5, D7)之當年生、一年生的枝 葉各2 g,重複四次,進行 10-DAB 的分析。

(三)試驗設計

溫室內發根比較之試驗設置依完全逢機區集試驗設計(Complete Randomized Block Design;CRD),共用插穗:14 個營養系×84 孔穴盤

=23,847 支(表 1)。

表1 2005 年 11 月 16 日扦插之營養系數量與穴盤數

Table 1 The clone number and amount of T. sumatrana cuttings and plug trays on November 16, 2005.

Species Clone no. Amount of cutting Amount of plug tray

T. sumatrana D1 640 8

D2 1,448 18

D4 1,115 14

D5 3,889 47

D6 2,771 33

D7 2,328 28

D8 1,884 23

D9 302 4

W8 1,080 13

Z3 481 6

Z4 307 4

Z8 741 9

T. chinensis CH1 1,882 23

CH2 4,979 60

Total 23,847 290

註:D:中橫;W:畢祿溪;Z:瑞岩;CH:中國

(35)

(四)調查方法

於2005 年 11 月 16 日於溫室進行扦插後 17 週起,每隔 5 週分別觀 察記錄其發根率、發根數、發根長度、側根率與新梢生長,發根數與發 根長度以每週插穗的新發根數與發根長度個別計數,發根數指插穗根長 2 mm 以上之數目,側根率為由不定根長出之側根比率(圖 6);新梢情形 調查包括抽芽數、平均芽長(圖 7)。調查進行至 42 週為止。

調查之進行,採逢機取樣法於每營養系內選取4~5 個穴盤,各穴盤 再依系統取樣法自右往左對角線選取小苗10 株,扦插苗取出後用清水 洗淨根系,計算根數與發根長度(主根)、側根率及抽芽數、平均芽長,

再將插穗植回原穴盤內。

(五) 10-DAB 成分的萃取

將發根率最高之 3 營養系扦插苗出栽至林場 8 個月後,於 2007 年 7 月隨機採集 3 營養系之當年生、一年生枝葉各 2 g,重複四次,進行 10-DAB 的分析。

本試驗之10-DAB 分析乃引用何政坤等(2000)之方法,其步驟為:

1、將不同營養系不同葉齡的葉片放入研缽內,加入液態氮研磨成 粉末後再放入稱好重量的15 ml 離心管,以冷凍乾燥機乾燥一 天。

2、將兩倍體積量的甲醇(methanol, MeOH)加入已完全乾燥的樣品 內,以震盪器震盪1 min 後再放入超音波震盪器中萃取 1 hr,再 用離心機4,500 rpm 離心 5 min 後,取上清液於濃縮瓶中,剩餘 粉末再用兩倍體積的MeOH 萃取一次,兩次萃取液合在一起。

剩餘的粉末放入60 oC 烘箱中乾燥兩天以求得乾重,再以此乾 重做為濃度計算基準。

3、以真空減壓濃縮機(vacuum evaporator)在 40 oC 中將萃取液濃縮

(36)

乾燥後,再取1mL 的 MeOH 將濃縮物溶解,以高效能液相層析 儀(Waters 2695 Separations Model;HPLC)與光電二極體偵測器 (Waters 2996 Photodiode Array Detector)偵測 10-DAB 的濃度。

4、分析方法是以自動取樣機(Autosampler, IS200, Perlin Elmer)取 20 μL 針葉萃取液,經 HPLC 與分析管柱 Lichrospher RP-18 ( particle size: 5 μm, end capped, Merck Co.),經光電二極體偵測器在 230 nm 的波長下偵測 10-DAB 的濃度(定量的標準品購自 Sigma Co.)。沖提溶液為 20:38:42 MeOH: ACN(acetonitrile):H2O,流速 為1 mL/min。

5、濃度算法為 ng (HPLC 測定之濃度) ÷ 20 μL ×1 mL (樣品萃取液)

÷ 萃取物乾重 g = ppm (六)統計分析

每處理的發根率、側根率經反正弦角度(Arcsin)轉換為常態分配後 (Eccher, 1988)進行統計分析。統計分析採用 SAS (Satistical Analysis System)套裝軟體的 GLM (general linear models)程式進行變異數分析 (ANOVA),如呈顯著,以最小顯著差異法(LSD, least significant difference) 來檢定各營養系間台灣紅豆杉發根率、發根數、發根長度及側根率與抽 芽數、平均芽長以及各營養系間不同葉齡之10-DAB 濃度的差異性(SAS Institute Inc. 2002),顯著水準為 5 %。

(37)

二、扦插苗健化處理試驗

本研究以限水與施肥的健化手段,藉以了解健化對苗木發根率、發根 品質與新梢生長的影響。

(一)扦插苗選取

於2006 年 7 月 1 日將試驗(一)中發根率超過 50 % 之 5 個營養系 D4、D5、D6、D7 及 Z8,除原本進行調查的 5 個穴盤留置原地作為對 照組外,將其餘苗木全數移至溫室內之健化區內進行試驗。

(二)健化處理

溫室健化區內的定時噴水系統減半為每1 小時各噴 8 秒,同時每苗 木施以緩性肥料2 顆(好康多 2 號,N:P:K=16:5:10,效用 180 天)。

同一溫室內不同苗床之對照區的噴水系統則為每30 分鐘各噴 8 秒,且 未施肥。

(三)試驗設計

試驗設置依完全逢機區集試驗設計,共用插穗:5 個營養系×84 孔 穴盤=8,744 支(表 2)

表2 2006 年 7 月 1 日進行健化試驗之營養系數量與穴盤數

Table 2 The clone number and amount of T. sumatrana cuttings and the amount of plug trays for hardening test on July 1, 2006.

Clone no. Amount of control

Plug tray of control

Aoumnt of hardening

Plug tray of hardening

D4 420 5 695 9

D5 420 5 3,469 42 D6 420 5 2,351 28 D7 420 5 1,908 23

Z8 420 5 321 4

Total 2,100 25 8,744 106

註:D:中橫; Z:瑞岩

(38)

(四)調查方法

實驗進行前先分別觀察記錄其發根率(根長達到 2 mm 以上始算發 根)、發根數、發根長度、與新梢生長情形(調查方法同試驗一),之後每 隔5 週調查一次,調查進行至第 10 週為止。

(五)統計分析

每處理的發根率、側根率經反正弦角度轉換後進行統計分析。統計 分析採用SAS 套裝軟體的 GLM 程式進行變異數分析,如呈顯著,以最 小顯著差異法(LSD)來檢定各營養系間台灣紅豆杉健化與非健化苗木發 根率、發根數、發根長度及側根率與抽芽數、平均芽長的差異性,顯著 水準為5 %。

(39)

三、採穗部位與 IBA 濃度對不同營養系插穗發根之影響

本試驗以信賢苗圃營養系園數種來源之營養系的綠枝(Green shoot)與 半木質化(Semi- lignified shoot)枝條,利用不同濃度的 IBA 處理以促其發 根,來比較各營養系間不同採穗部位與IBA 濃度對發根率、發根品質與新 梢生長的影響。

(一)插穗來源

於2006 年 3 月 3 日自林試所信賢苗圃之採穗園內採集 4 種源(中橫 D、南庄 N、畢祿溪 W、瑞岩 Z)18 個營養系各有 2-6 株來源之枝條,先 在福山植物園溫室噴霧系統設備下保存至隔日。

(二)插穗處理

隔日修取長度為10-15 cm 之健壯綠枝與半木質化插穗,去除基部 3 cm 長度範圍的葉片,施以二種 IBA 濃度粉劑 1,000 ppm、3,000 ppm 及 未處理插穗為控制組;綠枝為枝條上段含有頂梢之當年生插穗,枝條下 段即為半木質化插穗(圖 8)。

插穗處理完後,即在福山植物園溫室內進行扦插,扦插於泥炭土:

蛭石:珍珠石=1:1:1.5(v/v/v)之混合培養介質的 84 孔穴盤內,枝穗 扦插深度與噴霧管理同試驗(一)之方法。

(三)試驗設計

試驗設計採裂區試驗設計(split plot design),以營養系為主試因子,

副試因子為綠枝與半木質化插穗2 種。此二種副試區再分別為施以含一 對照組及二種IBA 濃度的 3 種處理,每處理 10-20 枝插穗,重複 3-5 個 區集,共用插穗7,200 支(表 3)。

(四)調查方法

於2006 年 3 月 5 日於溫室進行扦插後 14 週起每隔 5 週分別觀察記 錄發根情形至34 週為止。調查之進行依系統取樣法自處理小區從右方

(40)

起,隔3 取 4 (依樣本數或隔 2 取 3;或隔 1 取 2)的方式自前往後選取小 苗5 株,其它調查方法同試驗(一)。

表3 2006 年 3 月 5 日扦插之營養系編號及數量

Table3 The clone number and amount of T. sumatrana cuttings in March 5, 2006.

Clone no. Replicates Amount of per replicate Total amount

D1 3 15 270

D4 3 15 270

D9 5 20 600

D10 4 20 480

N2 3 10 180

N4 3 15 270

W1 3 15 270

W2 3 20 360

W3 3 20 360

W5 5 20 600

W7 4 20 480

W9 3 15 270

Z1 5 20 600

Z3 3 15 270

Z4 3 20 360

Z5 3 20 360

Z6 5 20 600

Z7 5 20 600

Total 7,200

註:D:中橫;N:南庄;W:畢祿溪;Z:瑞岩

(五)統計分析

每處理的發根率、側根率經反正弦角度轉換後進行統計分析。統計 分析採用SAS 套裝軟體的 GLM 程式進行變異數分析,如呈顯著,以最 小顯著差異法(LSD)來檢定不同營養系間台灣紅豆杉不同採穗部位、

IBA 處理之發根率、發根數、發根長度及側根率與抽芽數、平均芽長的 差異性,顯著水準為5 %。

(41)

四、扦插季節對不同營養系插穗發根之影響

本試驗以信賢苗圃營養系園數種來源之營養系枝條於不同季節進行扦 插,以比較不同扦插時期之各營養系間的發根率、發根品質與新梢生長。

(一)插穗來源

除試驗一(2005 年 11 月 16 日扦插,冬季)、試驗二(2006 年 3 月 5 日扦插,春季),另於 2006 年 8 月 14 日(夏季)再取自林試所信賢苗圃內 採集2 種源(中橫 D、瑞岩 Z) 9 個營養系各有 1-6 株來源之枝條,枝穗 先在福山植物園溫室噴霧系統設備下保存至隔日。

(二)插穗處理

隔日修取健壯長度為10-15 cm 之綠枝(Green shoot)與半木質化插穗 (Semi- lignified shoot),拔除基部 3 cm 長度範圍的葉片,施以 1,000 ppm、3,000 ppm IBA 粉劑及未施 IBA 之插穗為對照組。

將插穗扦插於以泥炭土:蛭石:珍珠石=1:1:1.5(v/v/v)之混合培 養介質的84 孔穴盤內,枝穗扦插深度與噴霧管理同試驗(一)之方法。

(三)試驗設計

試驗設計採裂區試驗設計,以營養系為主試因子,副試因子為綠枝 與半木質化插穗2 種。此二種副試區再分別為三種 IBA 處理,每處理 5 支插穗,重複5 個區集,共計 1,350 支(表 4 )。

(四)調查方法

於2006 年 8 月 15 日於溫室進行扦插 14 週起每隔 5 週分別觀察記 錄每株苗木發根情形至34 週為止,其它調查方法同試驗(一)。

(42)

表4 2006 年 8 月 15 日夏插之營養系編號及數量

Table 4 The clone number and amount of T. sumatrana cuttings in August 15, 2006.

Cutting season

Winter* Spring** Summer Clone no.

Amount of cutting Amount of cutting Amount of cutting

D1 640 270 150 D4 1,115 270 150

D5 3,889 - 150

D6 2,771 - 150

D7 2,328 - 150

D9 302 600 150 Z3 481 270 150 Z4 307 360 150

Z8 741 - 150

Total 12,574 1,770 1,350

註:D:中橫;Z:瑞岩

* 2005 年 11 月 16 日冬插之營養系編及數量

**2006 年 3 月 5 日春插之營養系編號及數量

*The cutting amount of T. sumatrana clones in November 16, 2005.

**The cutting number and amount of T. sumatrana clones in March 5, 2006.

(五)統計分析

每處理的發根率、側根率經反正弦角度轉換進行統計分析。統計分 析採用SAS 套裝軟體的 GLM 程式進行變異數分析,如呈顯著,則以最 小顯著差異法(LSD)來檢定不同扦插季節間各營養系台灣紅豆杉不同採 穗部位、IBA 處理之發根率、發根數、發根長度及側根率與抽芽數、平 均芽長的差異性,顯著水準為5 %。

(43)

肆、結果 一、不同營養系插穗發根之比較

扦插 17 週後,每隔 5 週分別觀察記錄 14 個營養系其發根率(根長達 到2 mm 以上始算發根)、發根數、發根長度及側根率與新梢生長情形,42 週之統計值從表5 的變異數分析上可以得知營養系間的發根率、總根數、

側根率則皆呈極顯著差異,即使是在同一種源內,營養系間的生長表現也 不相同。

表5 營養系間發根率與發根品質及新梢生長之變異分析

Table 5 Analysis of variance on the rooting and sprouting ability of T. sumatrana cuttings among clones.

P

Source

Rooting

%

No of roots

Maximum root length

Mean root length

% of lateral roots

No of sproutes

Mean sprout length

Clone **** ****

n.s. n.s.

**** **** **

*p<0.05;** p<0.01;*** p<0.001;**** p<0.0001;

n.s

:not significant

表6 之發根率、總根數、側根率最者皆為 D7 (88 %, 11.9 支,82 %),最 低者皆為D8 (12 %, 2.1 支, 8 %);除此之外,抽芽數、平均芽長在營養系間 也呈顯著差異,抽芽數、平均芽長最高者都是D1 (4.0 支, 26.2 mm),最低 者都是W8 (0.69 支, 9.2 mm),很明顯的,營養系間根系與新梢生長情形並 不相同;不過總根數、最長根長在營養系間則沒有顯著差異。

同一種源內其營養系的發根結果也不相同,如D7 是本試驗中發根率最 高者(88%),而 D8 卻是最低者(12%),包括中國種源亦是如此,CH1 發根率 為14%,CH2 卻高達 70%。

除此之外,營養系間其發根行為也有所不同,從圖9 可以看到實驗結 束時(第 42 週)發根率最高之 6 個營養系的發根趨勢。從第 17 週首次調查 時,即發現營養系間的發根率有明顯差異,如D1 均未發根時 D7 卻已高達

數據

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參考文獻

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