黑龍江、西北高原、江河平原、東洋區和怒瀾區等五區較合理，並分析了各區特 有魚類或優勢種類的特點。 親緣地理學的研究是是重建物種、族群演化歷史及分析遺傳結構的基礎，而了解 遺傳變異在族群的分布，亦可幫助我們在研究瀕危物種時提供保育訊息，進一步 選擇適用的保育策略。其中遺傳物質變異之研究是重建物種、族群演化歷史及分 析遺傳結構的基礎，而了解遺傳變異在族群的分布，亦可幫助我們在研究瀕危物 種時提供保育訊息，進一步選擇適用的保育策略。近年來新技術的發展，各種不 同的分子標記，包括粒線體DNA、細胞核核醣體DNA、同功酵素基因座對偶基因 以及重複性DNA 分子片段等，皆是測試遺傳變異的有效工具。粒線體DNA對於 魚類類群的分子親緣分析而言是一項有用的工具，藉由追蹤魚類類群的演化，可 以重建其親緣（Meyer et al., 1990）。James et al.（1998）根據粒線體DNA的序列 和型態特徵，確認蜥蜴（Iguanidae）四個亞科在分類上的地位。Michael and Ruth（1995），根據粒線體DNA 序列的資料，發現粉紅鮭和chum 鮭魚具有姐妹 種的關係，
許多分歧族群的年代和地理分佈模式，一一的被確認，同時也暗示特殊的歷史事 件是遺傳結構形成的主要來源（Lamb et al., 1989；Riddle and Honeycutt, 1990）。 在某些事例中，經由許多類群不同的分化模式和同一個歷史事件相互連結後，發 現產生分化的普遍性區域模式（Avise, 1992）。那些發現己經為分歧模式不同層 次的解答（分佈在許多不同地理區域，其層次由族群到群聚），找到有價值的且 具有歷史背景的解釋（Wooding and Ward, 1997）。大尺度空間的親緣地理研究， 至今仍然不太普遍（Wooding and Ward, 1997），尤其在東亞。
本研究的目的在於獲得魚骨屬屬的分子資料，釐清牠們之間的關係。nested clade 分析方式（Templeton, 1998；Excoffier and Smouse, 1994）將近緣的haplotype 彼此連接，進一步形成高階的clades，提供了分子演化及族群親緣研究新的詮釋 工具，藉由這樣haplotype 連接所重建的網狀圖可得到比一般樹狀圖更多的訊 息，其中包括可推論物種遷移的路徑，可能的冰河時期避難所，進一步更可以知 道何種haplotype 是屬較古老的；這些都是傳統樹狀圖所無法探討的部分。 O’Corry-Crowe et al.（2001）以此分析方法追蹤白鯨遷移的路徑及雄鯨往外遷移 的生活史；Jansen et al.（2002）利用粒線體DNA 的控制區域（mitochondrial DNAcontrol region）的haplotype network，重建現代馬多起源的演化歷史。因此本 研究期望能以粒線體DNA 為工具，進一步確認唇魚骨的遺傳變異分佈型式，是 否也按照這樣的方式分群?
本研究的目的在於：
（1）由親緣種（phylogenetic species, Cracraft, 1989; de Queiroz and
Donoghue,1990）、認知種（recognition species, Paterson, 1985）以及聚合種的觀念 （cohesion species, Templeton, 1989）等觀念(concepts)，釐清分佈於中國大陸和台 灣唇魚骨之間的關係。
定遺傳標識上？
（3）初級性的唇魚骨是否因水系的阻隔，造成族群間基因交流的阻隔，因而產 生較高的遺傳分化？
（4）釐清魚骨屬之種間的親緣關係與本島地質歷史的相關，同時釐清中國和台 灣唇魚骨在演化上的關係。探討魚骨屬之種間物種演化（親緣）、族群遺傳（或 稱微演化，microevolution）及種化之間（Moritz and Bermingham, 1998）與地質歷 史（如冰河、vicariance 事件等）之間的相關。 （二） 研究方法、進行步驟及執行進度。請分年列述：1.本計畫採用之研究方 法與原因。2.預計可能遭遇之困難及解決途徑。3.重要儀器之配合使用情形。4. 如為整合型研究計畫，請就以上各點分別說明與其他子計畫之相關性。5.如為須 赴國外或大陸地區研究，請詳述其必要性以及預期成果等。 （一） 研究步驟 第一年探討分佈於中國大陸和台灣唇魚骨之間的關係。 （二） 採樣方法 魚骨屬在大陸的分佈極廣，北從黑龍江，南至海南島各水系和河口及台灣的東 北部、東部和西部各水系均有分佈。因此為了要評估唇魚骨的親緣模式，以河系 為單位，以同一河系的同一物種視為同一族群之方式，採集分佈於大陸各主要水 系的魚骨屬，及台灣北部淡水河的唇魚骨個體20 隻以上。台灣的唇魚骨僅局限 分佈於淡水河流域， 這樣的結果和中央研究院動物所所做的調查互相一致 （http://fishdb.sinica.edu.tw/2001new/main1.asp 標本號ASIZP0060305、0057280、 0059357）。在大陸採樣的河系及獨立水系分別為：黑龍江水系(烏蘇里江、伊通 河、渾河)、遼河水系、黃河水系(黃河、汶水、澮河)、淮河(穎河、窯河)、長江 水系(富春江，)、靈江、歐江、錢塘江、閩江、木蘭溪、大漳河、九龍江、韓江、 赤石河、螺河、黃岡河、珠江水系(北江、西江、東江)和海南島水系(南渡江、萬 泉河、昌江)，己進行。 （三）DNA 萃取 採到的樣本則保存於100%的酒精中，將魚的肝臟取出約20mg，置於1.5ml 的 離心管中，以1ml STE buffer （10 mM Tris-Cl, 10mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0）沖 洗三次，再加入200μl extraction buffer（50mM pH8.0 Tris-Cl, 180mM EDTA, 1% sodium dodecyl sulphate, 200Mm NaCl），於液態氮中研磨至粉末狀，加入350μl genomic buffer (0.5M EDTA. 0.5 Sarkosyl pH8.0)混合均勻，再加入15μl
一次，取出 上清液離心，再加入500μl 100 的酒精將DNA 析出，以70 酒精 將鹽類洗淨， 在空氣中將酒精揮發蒸乾，溶於TE buffer（10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH8.0），存於-20°C 冰箱中保存待用。
（四）、粒線體DNA 控制區（control region）的分子序列 1、引子的設計
將參考Wang et al.（1998）所設計的引子（Loop1 及Loop2）以用於DNA 增幅反
應，參與反應之引子及分子序列，列於表二。
2、聚合酵素連鎖反應（mitochondrial DNA polymerase chain reaction，PCR） 利用合成引子（primers）Loop1 及Loop2 複製出D-loop 基因片段。在 總體積 100 l 的反應液中加入0.8 l 聚合酵素（ Taq polymerase），10 l 10X 緩衝液， 10 l 的dNTP，濃度2 pmole 的Loop1 及Loop2 各10 l，15 l 的氯化鎂
（MgCl2），最後加入35 l DNA。以無菌水補足100 l。聚合酵素反應在溫度循 環機（ Thermal cycler）進行，共進行31 個循環，每個循環流程為：92 C，45 秒， 將DNA 的雙股變性打開（denaturation）﹔53 C，1 分15 秒，使DNA 與引子結 合（annealing）﹔72 C，1 分30 秒，進行DNA 延伸反應（extension），最後在 72 C 作用10 分鐘。PCR 結束後，取5 l 的PCR 產物加上1 l 6 倍的染色溶 液，在1%瓊酯凝膠（agarose gel）中以100 伏特電壓跑電泳約30 分鐘，經過溴化 乙啶螢光染劑（EtBr）處理後，配合所選用的DNA ladder 當標幟，在紫外線燈下 拍照。 3. 純化（elution） DNA 聚合酵素反應（PCR）的產物有時所含的片段並不只有一段，而且有許多 離子、dNTP、引子存在，因此必須經過純化。PCR 產物於1%瓊酯凝膠，以1X TAE 的緩衝液，以70 伏特電壓電泳，經溴化乙啶螢光染劑染色後，在紫外光燈下將 所欲DNA 片段的膠切下，以Agarose Gel DNA ExtractionKit 純化。
4. 基因cloning
（1）DNA 分子的合接（ligation）
將純化後之PCR 產物20 l 中加入2.6 l ligation buffer，1.5 l ATP，1 lligase， 1 l T4 載體（vector），在14℃水浴中反應過夜，使PCR 產物接合至載體上。 （2）轉形作用（transformation）
將大腸桿菌以氯化鈣活化後，將與PCR 產物連接好之載體加入活化之菌液，放 入42℃水浴1 分30 秒，迅速投入冰水中，使載體轉形入大腸桿菌中。
(3) 萃取質體DNA（plasmid DNA）
將轉形作用完成的大腸桿菌大量培養後，以lysis buffer 將細菌打破，加入RNAase 分解RNA，再以phenol 及chlorofrom / isoamgl（24:1）將質體DNA 萃取出。最後 以isopropanal 沈降，酒精洗去鹽類，晾乾，加入TE 溶解，以進行DNA 定序。 5. DNA 定序
每個循環流程為：95 C，30 秒，將DNA 的雙股變性打開（denaturation）﹔57 C， 30 秒，使模板DNA 與引子結合（annealing）﹔70 C，1 分，進行DNA 延伸反
應（extension）。反應後的產物在6%的polyacrylamide-7M urea gel 上進行電泳分析，
將膠轉附在3mm 濾紙上，再將膠片烘乾，用X-ray film 感光48-72 小時後，沖片， 判讀DNA 序列。
6. DNA 序列分析（sequence analysis）與親緣分析（phylogenetic analysis）DNA 分
子序列的資料以Clustal V（Higgins et al., 1992）程式完成比對及排列（alignment）。
先比較彼此間鹼基對替換（transition ; 兩個嘌呤或嘧啶間的突變，A/G 或T/C 突 變）及鹼基對顛換（transversion ; 嘌呤與嘧啶間的突變，T.C/A.G 突變）的發生 頻率及比值，分別計算序列變化。再以Kimura雙參數模式（two-parameter model）
的方法（Kimura ,1980）計算鹼基替代率及遺傳距離，以MEGA（Kumar et al., 1993）
根據此遺傳距離，重建這兩個種之親緣。另外以鯉魚為外群，以PAUP 3.1.1 （Swofford , 1993）軟體進行最大簡約法（maximum parsimony analysis，序列間特 質變化步驟最少的分析法）分析，重建其親緣，並以重複一千次bootstrap 分析計 算每一個group 可信度。同時亦以PHYLIP 軟體中的最大相似度計算法（maximum likelihood algorithm），重建其親緣圖（Felsenstein, 1991）。然後以minimum spanning
network 來分析各族群之親緣關係（Excoffier et al., 1992; Excoffier, 1993）。
7. 族群遺傳分析（population genetic analysis）
以DnaSP（Version 2.0, Rozas and Rozas, 1997）計算族群內、族群間及地理區間的 genetic diversity。以haplotype diversity（H）（Nei and Tajima, 1983）來顯示族群內 的遺傳歧異度，同時以nucleotide divergence (dij) （ Jukces and Cantor, 1969）來顯 示族群內、族群間及地理區間的genetic diversity。並預測族群間及地理區間的基 因交流（Nm）情形，根據FST=1/(1+2Nm)的公式，估計遺傳分化程度，其中N 中 是表示族群中雌個體的有效族群量（因mtDNA為母系遺傳，m 表示雌個體的遷 徙能力），因此FST 值愈高，顯示遺傳分化程度愈大。以AMOVA vs 1.55 （Excoffier et al., 1992; Excoffier, 1993）測試族群間及地理區間的遺傳分化程度， CT 為地 理區間的分化程度， ST 為族群間的分化程度， SC 為地理區內族群間的分化 程度。同時，測試Nm 值與地理距離間的相關，用以測驗Isolation by distance，並
以SAS統計程式中之F test測試其可信度。最後以D* statistic 測試分子序列是否受 天擇影響（Fu and Li,1993）。
表貳粒線體DNA control region 增幅反應之引子及分子序列 Primer 5 position sequence 3 position
Loop1(F) 10 AGG AGG TGT TCT TGC ACT AC 29 Loop2(R) 1823 AGC TAC TTT CGT GTA TTG GG 1844 註：Ｆ為輕鏈起始之引子
Ｒ為重鏈起始之引子
