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紫花丹參多倍體生長與藥用成份分析

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Academic year: 2021

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(1)國立高雄大學生命科學系碩士班 碩士論文. 紫花丹參多倍體生長與藥用成份分析 Growth and medicinal constituents in polyploids of Salvia miltiorhiza bge.. 研究生:甘芳儒 撰 指導教授:陳彥澄 博士. 中華民國一百零三年七月.

(2) 謝誌 碩士論文終於完成了!我要感謝所有師長及同學的支持與鼓勵才有這篇著作的 完成。除此之外我要特別感謝的是我的家人,感謝爸爸媽媽支持我繼續升學,讓我能 讀完研究所並考上博士班,完成我想要學習和深耕知識領域的夢想,父母一直是我心 靈上最大的支柱,非常謝謝您們,沒有您們也就沒有今天的我。還有要謝謝阿嬤經常 為住宿在外的我憂心健康,總是隨時準備了很多美食及補品等我回家享用。 非常感謝陳彥澄老師這兩年來的指導,讓我的論文可以順利完成,老師在學業及 升學方面也給了我很多的意見,使我很快就能掌握前進的方向。老師!真是謝謝您的 照顧了。當論文初稿完成時,多虧有口試委員張學偉老師及黃斌老師的批閱指正,使 我獲益良多。另外還有實驗室愉快的伙伴們,感謝政杰、孟澤、學妹芷婷、還有學弟 舒凱你們平時的鼓勵,大家珍重再見了。 最後我想獻給我摯愛的貓波波,牠從滿月後就來到了我們家,和身為獨生女的我 一起成長。是我最好的伙伴兼貓弟弟,與你在一起的每天是如此的快樂,即使是有沈 重升學壓力,只要有你陪在身旁,任何悲傷難過的事都能迎刃而解。這十五年來你一 直默默的在支持我,每當我回家探望時,你撲過來時那幸福滿足的神情讓我難忘;但 就在我忙著碩士班畢業論文時,你衰弱的身體終於無法再抵抗病魔而離開了我們。波 波,這些年來謝謝你的陪伴,雖然我們道別了但你永遠活在我心中的某個角落。. 學生 甘芳儒 謹誌 中華民國一百零三年七月. i.

(3) 縮寫表 Abbreviations. IBA. indole-3-butyric acid. TDZ. N-phenyl-N’-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea. MS. Murashige and Skoog medium (1962). ii.

(4) 目錄 頁次 謝誌 ........ ......................................................................................................i 縮寫表 .... .................................................................................................... ii 目錄 ........ ................................................................................................... iii 表目錄 .... ..................................................................................................... v 圖目錄 .... ....................................................................................................vi. 中文摘要 ..................................................................................................... 1 英文摘要 ..................................................................................................... 3. 第一章 前言 ................................................................................................ 5 1.1 丹參之植物學特性 ............................................................................... 5 1.2 植物之多倍體 .. .................................................................................... 6 1.3 丹參之藥用價值 ................................................................................... 7 1.4 研究目的 .......... .................................................................................... 7. 第二章 材料方法 ... .................................................................................... 9 2.1 植物材料 .......... .................................................................................... 9 2.2 生長環境 .......... .................................................................................... 9 2.3 生長評估 .......... .................................................................................... 9 2.4 葉下表皮氣孔觀察 .............................................................................10 iii.

(5) 2.5 丹參馴化 .......... ..................................................................................10 2.6 丹參開花後的差異比較 .....................................................................10 2.7 丹參根部藥用成份萃取流程 ............................................................. 11 2.8 HPLC 分析條件 .................................................................................. 11 2.9 統計分析 .......... ..................................................................................12. 第三章 結果 ........... ..................................................................................14 3.1 瓶苗丹參的生長差異 .........................................................................14 3.2 多倍體之間葉下表皮的差異 .............................................................14 3.3 開花種子成熟後的差異比較 .............................................................15 3.4 丹參的藥用成份分析 .........................................................................15. 第四章 討論 ........... ..................................................................................28. 第五章 參考文獻 ... ..................................................................................38. iv.

(6) 表目錄 頁次 表 3.1 紫花丹參瓶苗在蘭花瓶內生長 75 天後的形態差異..................16 表 3.2 丹參不同倍體之間的葉下表皮氣孔頻率和大小........................17 表 3.3 不同倍體之間的花粉形態差異 ....................................................18 表 3.4 不同倍體之間的種子差異 ............................................................19 表 4.1 丹參成熟葉片的形態比較 .............................................................32. v.

(7) 圖目錄 頁次 圖 2.1 剛從丹參試管苗頂端取下約 2 cm 莖段作為培植體,種植於蘭花 瓶內 ........ ...................................................................................................13 圖 3.1 丹參瓶苗在蘭花瓶內生長 75 天的生長形態...............................20 圖 3.2 丹參瓶苗的根部生長形態 .............................................................21 圖 3.3 紫花丹參葉下表皮氣孔分佈情形 .................................................22 圖 3.4 顯微鏡 1000X 視野下的紫花丹參葉下表皮氣孔........................23 圖 3.5 顯微鏡 1000X 視野下的紫花丹參花粉粒 ....................................24 圖 3.6 解剖顯微鏡 25X 視野下的丹參種子 ............................................25 圖 3.7 不同倍體丹參生長 6 個月的根部丹參酮 IIA 含量 .....................26 圖 3.8 不同倍體丹參生長 6 個月的根部隱丹參酮含量.........................27 圖 4.1 不同倍體的丹參馴化 2 個月的葉片形態差異.............................33 圖 4.2 丹參苗馴化後在 3 吋小盆栽生長 45 天的情形...........................34 圖 4.3 丹參苗馴化後在 5 吋盆栽生長 75 天情形...................................35 圖 4.4 丹參苗馴化後 4 個月成長於 7 吋盆栽.........................................36. vi.

(8) 紫花丹參多倍體生長與藥用成份分析 指導教授:陳彥澄 博士 國立高雄大學生命科學系 學生:甘芳儒 國立高雄大學生命科學系 摘要 紫花丹參(Salvia miltiorhiza bge.)為唇形科多年生草本植物,開紫花,葉似薄荷, 紫花丹參的藥用部位為其紅色的乾燥根,為高經濟價值的中藥材。本論文培育紫花丹參 的多倍體,並比較二倍體及四倍體的生長形態及藥用成份之差異。多倍體主要是指染色 體大於正常染色體數目之植物,其特徵為具有較大的營養器官,較高的二次代謝物含量, 以及對逆境有較高的抗性。因此,培育發展藥用植物的多倍體具有商業價值。本論文所 培育之兩品系四倍體,係經由 1 mg/l 或 2 mg/l 秋水仙素誘導葉培植體並經由流式細胞 技術鑑定而得,分別命名為 4x-1 及 4x-2。將二倍體(簡稱 2x)、4x-1 及 4x-2 的莖段培 育於改良式 1/2MS 培養基,培養容器為蘭花瓶。試驗結果顯示, 75 天後,莖段抽長並 發根成為小瓶苗,其中 4x-1 及 4x-2 小植株之鮮重(分別為 10.31 g 及 9.96 g)均比 2x 高;4x-1 及 4x-2 小植株莖段高度皆顯著較高(分別為 2.63 cm 及 3.15 cm),葉片數亦 最多(18.4 及 18.5) 。雖然 2x 根部最長(8.7 cm) ,但都比較細(0.8 mm) ;4x-1 長度次 之(6.23 cm),根部顯著較粗(1.05 mm);4x-2 根部最短(4.46 cm),大多都是粗狀根 (1.09 mm) 。4x-1 及 4x-2 小植株氣孔的長和寬(分別為 17.1 及 19.9 μm;17.8 及 19.1 μm) 均顯著高於 2x (11.5 和 14.7 μm),而氣孔頻率則是 2x (29.0)較高。植株成熟後, 4x 的葉片較圓,其葉面積亦增大。4x 花粉粒的長及寬(38.9 及 30.0 μm)顯著大於 2x(30.8 及 21.7 μm) 。4x 種子比 2x 較大且較圓(0.487 mm; 0.378 mm) 。藥用成分方面,使用栽 培 6 個月的丹參植株之組織做為樣本進行分析,其結果顯示,四倍體植株根部之丹參酮. 1.

(9) IIA 及隱丹參酮具有比二倍體較高的含量。. 關鍵字:紫花丹參、多倍體、馴化、生長形態差異、藥用成份. 2.

(10) Growth and medicinal constituents in polyploids of Salvia miltiorhiza bge. Advisor: Dr. Jen-Tsung Chen Department of Life Sciences National University of Kaohsiung Student: Elena Gamboa Chen Department of Life Sciences National University of Kaohsiung ABSTRACT Chinese sage, Salvia miltiorhiza bge., is a perennial plant which belongs to Labiatae Family. It has purple flowers and the leaves look like Peppermint’s leaves. The red dried root has been used as Chinese medicine to cure several diseases. Chinese sage is a traditional Chinese medicine with high economical value. This study compared Diploid plants to two lines of tetraploid plants in their morphology growth, development and also medicinal constituents. Polyploid plants contain more sets of chromosomes than diploid ones. Polypoid Plants can grow stronger, have more stress tolerance, and increasing levels of secondary metabolites. As a result, the development of induced polyploid medicinal herbs might have an impact on its commercial value. To obtain the tetraploid plants, leaves were treated with 1 mg/l. and 2 mg/l colchicine, named 4x-1 and 4x-2. Ploidy levels of donor plants were proved using flow cytometry. Diploid (2x), 4x-1 and 4x-2 were cultured on half strength Murashige and Skoog (MS) medium. After 75 days of culture, the in vitro shoots formed roots and converted into plantlets. The results showed that tetraploid 4x-1 and 4x-2 plants have significantly. 3.

(11) higher fresh weight of 10.31 g and 9.96 g when compared to 2x plants (5.29 g). Tetraploid plants gave higher plant height. (2.63 cm and 3.15 cm) ,more leaves (18.4 and 18.5) than 2x. plants. Although diploid had longer roots (8.7 cm), but their roots have smaller diameters (0.8 mm). The length of 4x-1 roots was 6.23 cm and the mean diameter was 1.05 mm. 4x-2 roots were shorter (4.46 cm) and thicker (1.09 mm). Tetraploid had larger stomata with higher length and width (17.1 and 19.9 μm; 17.8 and 19.1 μm). However, diploid had higher frequency of stomata (29.0) than 4x plants. Tetraploid leaves changed into a circle like shape, increasing the total leaf area. In addition, pollen of tetraploid have higher length and width (38.9 and 30.0 μm) than 2x plants (30.8 and 21.7 μm). Seed of tetraploid plants were also larger (0.487 mm; 0.378 mm) than 2x plants. Root tissues from six-month-old plants were used to analysed the medicinal constituents using HPLC. It was found that the 4x plants have more tanshinone IIA and salcianolic acids B than 2x plants.. Key word: Salvia miltiorhiza; polypoidy; acclimatization; morphological characteristics; medicinal constituents. 4.

(12) 第一章 前言 1.1 丹參之植物學特性 丹參(Salvia miltiorhiza bge.)為多年生草本植物在分類上屬於唇 形科鼠尾草屬。一般開紫花,具有羽狀複葉,其葉片呈對生生長,狀 似薄荷。丹參之主要藥用部位為乾燥根。其根部細長,呈圓柱形,狀 似人參,因其根皮呈現紅色,故名為丹參(王等,2009)。丹參之乾 燥根主要用於治療心臟疾病,並具有活血袪瘀、調經止痛及涼血消炎 等功效 (Xiao et al. 2002) 。丹參的使用歷史悠久,早於在「神農本 草經」即被列為上品,是具有高經濟價值的中藥材(Ji et al. 2004)。 丹參的基原植物約有 30 多種,為鼠尾草植株,其中包括紫花丹參 (Salvia miltiorhiza bge.)、南丹參(Salvia bowleyana Dunn)及甘西鼠 尾草(Salvia przewalskii maxim.)等。丹參主要分佈於中國及日本地區, 生長於海拔 90 至 1200 公尺的森林、山坡地或溪谷。丹參適合栽培於 排水良好的土壤及日照充足的環境,具耐寒性(Clebsch and Barner, 2003)。因此,最適合栽培丹參的環境為海拔 400~600 公尺的丘陵地, 年均溫介於 26°C 至 28°C 之間,降雨量為 800 mm 左右,溼度維持在 72~82%(林等,2005) 。由於其根系發逹,可深入土壤中約達 35 至 55 公分,適合栽種在深厚疏鬆、土質肥沃及通氣良好的環境,較不適合 種植於黏性土壤 (林等,2005)。丹參具無限花序,其開花季節從初 夏至秋末,大約從 5 月開始開花直到 10 月下旬,之後植株便逐漸枯萎 (宋等,2009),其開花高峰期為 6 至 7 月(劉等,2004) 。丹參的繁 殖可以採用種子或根部扦插等方式,目前以種子來源的實生植株生育 較為快速且整齊(張,2011)。 5.

(13) 1.2 植物之多倍體 多倍體主要是指染色體套數多於正常染色體套數(一般為二倍體, 簡稱 2x)的生物,例如三倍體(3x)、四倍體(4x)、六倍體(6x) 等皆屬於多倍體。多倍體在植物界相當普遍,約有 30 至 70%的開花植 物為多倍體(夏等,2010)。一般常見的多倍體植物有苜蓿、馬鈴薯、 普通小麥、棉花、咖啡、草莓及甘蔗等。多倍體植物的形成可以透過 自然發生,或以人工誘導的方式產生。植物的多倍體育種多採用秋水 仙素(colchicine)進行誘導。然而,秋水仙素的毒性強,因此在處理 過程中需避免長時間的接觸,以免對培植體造成傷害(夏等,2010)。 多倍體植物的表現經常超越其親本,而在演化上具有優勢(夏等, 2010)。其特徵是體型明顯較原本的二倍體大,例如葉片面積、氣孔、 花朵、花粉、種子等,皆有巨大化的現象(Gantait et al. 2011; Abdoli et al. 2013; Majdi et al. 2010)。植物多倍體也有較高的二次代謝物產量, 亦能提高植物對抗逆境與病蟲害之能力(Levin, 1983)。因此,培育多 倍體的藥用植物具有一定的商業價值。 夏等人(2013)使用農桿根群菌(Agrobacterium rhizogenes)感染 丹參葉片,誘導出毛狀根。該論文將毛狀根分別培養於添加 2.5 mM 秋 水仙素的固態、液態培養基中,其誘導出的多倍體毛狀根具有較高的 藥用成份的含量,其中隱丹參酮提高了 11.2 倍,而其丹參酮之總產量 提高為二倍體的 2.6 倍(夏,2013)。 陳等人(2007)使用丹參的組培芽體,培養於添加不同濃度 IBA 的培養基,結果顯示,0.5 mg/l IBA 可提高發根率及根數,並使根系的 發育較粗壯,使丹參苗具有較高的生長量(陳,2007)。 6.

(14) 1.3 丹參之藥用價值 丹參的主要活性成份為丹參酮 I (tanshinone I)、丹參酮 IIA ( tanshinone IIA ) 、 隱 丹 參 酮 ( cryptotanshinone ) 及 丹 參 酚 酸 B (salvianolic acids B)等(Hu et al.2005)。丹參酮 IIA 具有降低血壓及 促進血液循環等功效 (Kim et al. 2007) 。丹參酚酸 B 為抗氧化劑, 能清除自由基及預防腦血管疾病 (Wang et al. 2010; Chen et al. 2007) 。 丹參對於心血管疾病之治療具有良好的效果,因此具有發展成為保健 食品的潛力(張,2011)。. 1.4 研究目的 近年來,台灣積極推動中草藥的種植,但所種植的種類及產量並 不及國內所需。近五年來,每年進口的丹參藥材約為 126 至 170 公噸, 其進口金額約為 400 至 500 萬元之間。台灣的中藥材 90%以上依賴進 口,其中最主要的進口國為中國大陸。然而,這些進口的中藥材出現 了許多的問題,其中包括品質良莠不齊、農藥及重金屬殘留、儲運不 良及價格波動等。近年來,台灣一直在推動本土化的中草藥的種植, 除了提供給農民一個新的農業生產方向,也可吸引高素質年輕農民的 加入。台灣在社會進步之下,生活水準日益提升,國人注重養生保健 之風日盛,對於強調鮮採、養生、滋補等效果的藥膳或保健食品趨之 若鶩,也因此本地種植的優質中草藥變成了相當熱門的研究課題。由 於進口的中藥材在農藥殘留及重金屬等問題上經常無法進行有效的控 管,也因此在台灣建立一個本土性、安全及優良的丹參藥材供應來源 實有其必要性(張,2011)。 7.

(15) 本論文在試管內及試管外培育紫花丹參二倍體及兩品系四倍體, 並比較二倍體與四倍體其植物形態、生長發育表現及藥用成分之差異, 藉此評估多倍體丹參之應用價值。. 8.

(16) 第二章 材料方法 2.1 植物材料 本論文採用丹參之二倍體及兩品系之丹參四倍體進行試驗,這些其 中四倍體植株誘導自葉培植體,並經流式細胞技術鑑定為四倍體。,其 中以 1 mg/l 秋水仙素誘導所得織品系命名為 4x-1,而由 2 mg/l 秋水仙素 誘導所得者命名為 4x-2(蔡,2011)。. 2.2 生長環境 採取上述四倍體之莖段(長度約 2 cm)為培植體,培養於含 100 ml 培養基的蘭花瓶(600 ml)(圖 2.1),置於植物生長箱。植物生長箱之 環境為光照 16 hr (白色螢光燈管,FL30D/29,東亞)、光量子密度 28-32 mol/m2/s、溫度 25±2 ℃。培養 75 天後,進行生長、發育及形態等分析。 培養基成份為 1/2MS(Murashige and Skoog,1962),添加 1 g/l peptone、 30 g/l 蔗糖、4 g/l 水晶洋菜及 0.5 mg/l IBA。滅菌方式為用雙層鋁箔封住 瓶口後經高溫高壓(121℃,1.5 atm)殺菌 20 min。. 2.3 生長評估 在蘭花瓶中生長 75 天的丹參瓶苗,會記錄不同倍體的植株生長狀況, 包括鮮重、莖高、葉片數目、根部生長情形等。由於四倍體丹參有二種 不同的濃度處理來源(4x-1 及 4x-2) ,因此在觀察生長形態時是分別記錄 數據。. 9.

(17) 2.4 葉下表皮氣孔觀察 取丹參瓶苗第三節成熟的葉片進行葉下表皮氣孔的觀察研究。使用 解剖刀和鑷子將葉片的葉下表皮撕下後置於載玻片,直接在顯微鏡底下 觀察。氣孔的長度和寬度是隨機從葉片中挑選氣孔,使用軟體(DP2-BSW APPLICATION SOFTWARE)直接在顯微鏡下測量氣孔長寬。氣孔頻率 也是隨機從 100 倍顯微鏡視野的 1/8 (約 0.05 mm2) 範圍內做計算。. 2.5 丹參馴化 生長良好的健康丹參瓶苗取出蘭花瓶後,先仔細洗去根部殘留的培 養基,再將丹參小植株的根部泡水一個晚上。隔日移至裝有泥碳土的 3 吋盆栽內種植,同時覆蓋透氣的透明塑膠袋以維持高濕度,10 天後取下 塑膠袋,將丹參小苗置於室內使之繼續生長。瓶苗馴化第 45 天,將丹參 植株移至混合土壤(砂土:泥碳土:蛭石,1:1:1)的 5 吋盆栽,使根系 生長茁壯。再經過 1 個月會將馴化適應良好的二倍體和四倍體植株將移 到 7 吋盆栽內同上的混合土壤裡,並將盆栽移到陽光能直射的室外環境, 使丹參有足夠的空間生長。馴化期間固定每週給予液態肥(NH3-N 30 %、 HNO3 1 %、P2O5 10 %、K2O 10%),並且澆水數次以提供植株充足的水 份。. 2.6 丹參開花後的差異比較 丹參馴化 4 個月後,從夏季開始到秋末都會不斷的開花。從花期開 始觀察不同倍體間的表現差異,在 10 月和 11 月之間,取二倍體及四倍. 10.

(18) 體成熟花藥的花粉粒,在顯微鏡下觀察並記錄。在開花約一個月後種子 也將成熟,收集不同倍體的丹參種子在解剖顯微鏡下觀察形狀及大小並 記錄。. 2.7 丹參根部藥用成份萃取流程 丹參清洗後經低乾溫變濕乾燥處理樣品,將丹參根部乾燥樣品,於 桌上型磨粉機 6 mm 孔徑磨粉過篩,精秤樣品 0.2000 g 於 50 ml 離心管(A), 加入 20 ml 100%甲醇混合均勻,靜置 30 min,超音波振盪萃取 30 min(功 率 100 W,設定 37℃約達 40℃) ,離心(4000 rpm,5 min) ,將上清液倒 入另一個離心管 50 ml(B),A 離心管殘渣再加入 15 ml 100%甲醇超音 波,靜置 30 min,超音波振盪萃取 30 min,離心 5 min,上清液倒入 B 離心管(上清液體積共 35 ml),A 離心管殘渣再加入 15 ml 甲醇,靜置 30 min,超音波振盪萃取 30 min(功率 100W,設定 37℃約達 40℃) ,將 B 離心管的萃取液倒回 A 離心管(總體積 50 ml)混合(含殘渣),保存 4℃冰箱,靜置隔夜,隔天取出萃取液震盪混合,取 1.8 ml 離心(12000 rpm, 5 min),過 0.45 μm 微孔濾膜,HPLC 分析。. 2.8 HPLC 分析條件 樣品與標準品各 10 μm 在 HPLC 進行分析,流動相的 0.02%硫酸: 乙晴為 75:25(v/v) ,流速 1.0 ml/min。使用管柱為 X-BridgeTMShield RP 18(4.6 × 250 mm,5 μm;Waters) ,管柱溫度 35 ℃。結果在 254 nm 的 波長下進行檢測。主要測量的成份有丹參酮 IIA,隱丹參酮。 (農委會農. 11.

(19) 業試驗所生物技術組,技術提供). 2.9 統計分析 統 計 分 析 是 用 Costat 軟 體 進 行 , 處 理 效 果 差 異 使 用 變 方 分 析 (ANOVA) ,多重比較則使用鄧肯氏多變域分析(Duncan’s multiple range test)進行平均值的差異比較(P< 0.05) 。. 12.

(20) 圖 2.1 剛從丹參試管苗頂端取下約 2 cm 莖段作為培植體,種植於蘭花瓶 內。. 13.

(21) 第三章 結果 3.1 瓶苗丹參的生長差異 丹參芽體在蘭花瓶內生長 75 天後,不同倍體間的生長型態有顯著差 異 (表 3.1) ,秋水仙濃度 1 mg/l 與 2 mg/l 誘導的四倍體在外觀上有巨 大化的現象。將丹參瓶苗從蘭花瓶裡取出,洗淨根部的培養基並去除多 餘的水分後,對丹參瓶苗的鮮重及成長差異做記錄。鮮重的部份,四倍 體丹參鮮重(10.31 g; 9.96 g)均比二倍體(5.29 g)還要重。丹參瓶苗地 上部的生長狀態,4x-1 和 4x-2 在莖的高度(2.63 mm; 3.15 mm)都顯著 較 2x(2.53 mm)的莖高;葉片的部份,四倍體平均葉片數(18.4; 18.5) 也顯著多於二倍體的平均葉片數(15.3)(圖 3.1)。 接下來是丹參瓶苗地下部的生長差異,2x 丹參根部最長(8.7 cm) 但都比較細(0.8 mm);4x-1 的長度次之(6.23 cm) ,根部的粗狀支明顯 較二倍體多(1.05 mm);4x-2 根部最短(4.46 cm),但大多都屬於粗狀 根(1.09 mm)。從圖 3.3 中可明顯看到,2x 的根大多是白色的細根,只 有少數的粗狀根;4x-1 及 4x-2 根部顏色呈現深色,主根及鬚根都有粗壯 化的現象,因此丹參瓶苗在不同倍體時地下部的性狀改變是有顯著差異。 而 4x-1 和 4x-2 的四倍體在根的發育上則有些微的差異;4x-1 的根部發育 較長但 4x-2 的根部較短,支根也較粗。. 3.2 多倍體之間葉下表皮的差異 紫花丹參的葉片在在顯微鏡下,不同倍體之間有明顯差異(表 3.2; 圖 3.3;圖 3.4 ) 。在顯微鏡中,2x 丹參的氣孔分佈頻率較密集(29.0) ,4x-1. 14.

(22) 及 4x-2 丹參氣孔分佈頻率都比較稀疏(14.3; 13.6),間隔較大,四倍體 的氣孔頻率是二倍體的一半。氣孔大小的部份,四倍體氣孔的長度和寬 度(17.1 μm 和 19.9 μm; 17.8 μm 和 19.1 μm)均顯著高於二倍體(11.5 μm 和 14.7 μm)。. 3.3 開花種子成熟後的差異比較 紫花丹參在馴化 4 個月成熟後會陸續開花。本實驗結果的二倍體及 四倍體丹參均有開花和結種子,但是其中 4x-1 至今尚未觀察到有開花, 因此只記錄其他二組的實驗數據。從已開花的丹參取下花粉並且在顯微 鏡下觀察,4x-2 的花粉粒長寬(38.9 μm;30.0 μm)明顯比 2x 的花粉粒 長寬還要大(30.8 μm;21.7 μm) (表 3.3;圖 3.5) 。在成熟的種子部份, 二倍體呈現典型的橢圓形(0.472 mm;0.286 mm) ,四倍體的種子顯著較 寬大(0.487 mm;0.378 mm)(表 3.4;圖 3.6)。. 3.4 丹參的藥用成份分析 實驗在丹參馴化 6 個月時,取根部的樣品測有效成份丹參酮 IIA 及 隱丹參酮的含量比較。一般市售丹參的採收時間是種殖滿 12 月時採收, 因此本實驗是提早採收樣品。丹參在生長 6 個月時,4x-1 及 4x-2 已經有 較多的丹參酮 IIA 含量(圖 3.7)。隱丹參酮的含量雖然差異不大,不過 四倍體也微多一些(圖 3.8)。. 15.

(23) 表 3.1 紫花丹參瓶苗在蘭花瓶內生長 75 天後的形態差異 處理組. 鮮重(g). 莖高(mm) 葉片數(n) 根長(cm) 根寛(mm). 2X-WT. 5.29±1.24b. 2.53±0.14 b. 15.3±0.8 b. 8.70±1.20a. 0.80±0.03b. 4X-1 mg/l. 10.31±1.4a. 2.63±0.18 a. 18.4±0.6 a. 6.27±0.52ab. 1.05±0.07a. 4X-2 mg/l. 9.96±1.62a. 3.15±0.17 a. 18.5±0.9 a. 4.46±0.87b. 1.09±0.04a. 數值旁的不同字母代表在鄧肯氏多變域分析(Duncan’s multiple range test)P<0.05 時有顯著差異。. 16.

(24) 表 3.2 丹參不同倍體之間的葉下表皮氣孔頻率和大小 處理組. 氣孔頻率. 氣孔大小. 氣孔大小. (約 0.05 mm2) 長(μm). 寬(μm). 2X-WT. 29.0±1.2a. 11.5±0.4b. 14.7±0.4b. 4X-1 mg/l. 14.3±0.9b. 17.1±0.8a. 19.9±0.9a. 4X-2 mg/l. 13.6±0.4b. 17.8±0.5a. 19.1±0.2a. 數值旁的不同字母代表在鄧肯氏多變域分析( Duncan’s multiple range test) P<0.05 時有顯著差異。. 17.

(25) 表 3.3 不同倍體之間的花粉形態差異 處理組. 花粉長度(μm). 花粉寬度(μm). 2X-WT. 30.8±0.7b. 21.7±0.5b. 4X-2 mg/l. 38.9±1.2a. 30.0±0.8a. 數值旁的不同字母代表在鄧肯氏多變域分析( Duncan’s multiple range test) P<0.05 時有顯著差異。. 18.

(26) 表 3.4 不同倍體之間的種子差異 處理組. 種子長度(mm). 種子寬度(mm). 2X-WT. 0.472±0.012a. 0.286±0.009b. 4X-2 mg/l. 0.487±0.016a. 0.378±0.013a. 數值旁的不同字母代表在鄧肯氏多變域分析( Duncan’s multiple range test) P<0.05 時有顯著差異。. 19.

(27) (A). (B). (C). 圖 3.1 丹參瓶苗在蘭花瓶內生長 75 天的生長形態 A.二倍體(WT) 丹參瓶苗 B.四倍體(1 mg/l) 丹參瓶苗 C.四倍體(2 mg/l) 丹參瓶苗 20.

(28) (A). (B). (C). 圖 3.2 丹參瓶苗的根部生長形態。比例尺為 1 cm A. 二倍體(WT) 丹參瓶苗的根部 B. 四倍體(1 mg/l) 丹參瓶苗的根部 C. 四倍體(2 mg/l) 丹參瓶苗的根部. 21.

(29) (A). (B). (C). 圖 3.3 紫花丹參葉下表皮氣孔分佈情形。比例尺為 50 μm A. 二倍體 WT 葉下表皮的氣孔分佈 B. 四倍體(1 mg/l)葉下表皮的氣孔分佈 C. 四倍體(2 mg/l)葉下表皮的氣孔分佈. 22.

(30) (A). (B). (C). 圖 3.4 顯微鏡 1000X 視野下的紫花丹參葉下表皮氣孔。比例尺為 10 μm A. 二倍體 WT 葉下表皮氣孔 B. 四倍體(1 mg/l)葉下表皮氣孔 C. 四倍體(2 mg/l)葉下表皮氣孔. 23.

(31) (A). (B). 圖 3.5 顯微鏡 1000X 視野下的紫花丹參花粉粒。比例尺為 10 μm (A)二倍體 WT 花粉粒; (B)四倍體(2 mg/l)花粉粒。. 24.

(32) 圖 3.6 解剖顯微鏡 25X 視野下的丹參種子。比例尺為 0.2 mm 左邊為二倍體(WT) 種子,右邊為四倍體(2 mg/l) 種子。. 25.

(33) tanshinone Ⅱ A( μg/g) 600.00 500.00. 522.91. 400.00 375.00. 300.00. tanshinone Ⅱ A( μg/g). 200.00 100.00. 149.33. 0.00 WT. 1mg/l. 2 mg/l. 圖 3.7 不同倍體丹參生長 6 個月的根部丹參酮 IIA 含量. 26.

(34) salvianolic acid B( μg/g) 4000.00 3500.00. 3735.06. 3000.00 2500.00. 2903.60. 3050.00. 2000.00. salvianolic acid B( μg/g). 1500.00 1000.00 500.00 0.00 WT. 1 mg/l. 2 mg/l. 圖 3.8 不同倍體丹參生長 6 個月的根部隱丹參酮含量. 27.

(35) 第四章 討論 植物在染色體加倍後,通常生長性狀外觀都會有所改變。這種情況 在其他植物上也常會觀察到,例如非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus cv. Sciella.)、紫錐花( Echinacea purpurea ( L.))、小白菊( Tanacetum parthenium Schulz-Bip.)(Gantait et al.2011; Abdoli et al. 2013; Majdi et al. 2010)等。根據前人的文獻,在添加 0.5 mg/l 的 IBA 是誘導丹參生根效 果最好的濃度(陳等,2007) 。實驗一開始先挑選生長及外觀大小差不多 的瓶苗丹參幼芽,取出並移植到含 0.5 mg/l IBA 的丹參培養基中,使芽 體發育生根成新的幼苗,在 75 天後觀察丹參幼苗的生長情況。丹參幼芽 在生長了 75 天後就能長到蘭花瓶內最適中的體積,若超過這個時間就會 變得太大,越來越難從瓶口完整取出。把丹參瓶苗從蘭花瓶內取出後, 再對其生長狀況做基本的測量並記錄下來。 從外觀可以直接觀察到二倍體丹參及四倍體丹參的農藝性狀有明顯 不同。例如在丹參整株鮮重的部份,四倍體將近是二倍體的兩倍重,而 丹參地上部,在莖的高度上也是四倍體長得明顯較高,至於葉片數量也 是四倍體丹參的瓶苗長得明顯較多。綜合以上的觀察結果得知,地上部 的部份是四倍體丹參長得明顯較大。 接下來是根部的比較觀察,因為水晶洋菜是清澈透明的,所以能從 蘭花瓶底直接觀察根部的發育情形,可避免將丹參取出蘭花瓶時受到機 械性傷害損傷而影響結果。丹參幼芽生長 75 天後,二倍體的根部只有少 數幾條根呈現粗大化,其他還是以細長的支根為主。四倍體的部份,4x-1 和 4-2 的丹參瓶苗根部均有明顯增大的現象,除了粗壯的主根以外,支. 28.

(36) 根也有粗化的現象,根部的顏色也比較深。根系增大且顏色較深的結果 與夏等(2013)的結果類似。從丹參瓶苗在蘭花瓶內 75 天的生長情況整 體做比較,四倍體丹參苗在各方面,例如鮮重、根、莖等都有明顯增大 的趨勢,那是因為器官及細胞大小會和細胞核的 DNA 含量呈正相關 (Leitch and Bennett, 2003) ,所以四倍體丹參的外觀形態才比原本二倍體 來得巨大。 除了巨大化的現象之外,丹參的葉片形狀也發生形態改變。丹參葉 片在二倍體時是像薄荷葉,橢圓形,邊緣有鋸齒的複葉。將丹參染色體 加倍後葉片明顯與原本二倍體時的特徵不同,所有小葉近似圓形(圖 4.1), 其面積也有增大的現象(表 4.1)。葉片是馴化生長 4 個月時,從丹參莖 頂往下取第三節至第六節之間的成熟葉片做比較。氣孔形態在多倍體化 後也會發生改變,這在許多文獻中都有報導過(Gantait et al.2011, Abdoli et al. 2013; Majdi et al. 2010)。在本實驗中,四倍體丹參的葉下表皮顯微 觀察結果,確實有和二倍體丹參產生差異。首先是葉下表皮的分部頻率, 二倍體丹參的葉下表皮氣孔,在相同面積之下有最多的氣孔個數,1 mg/l 和 2 mg/l 分別誘導的四倍體丹參則明顯較少。進而將氣孔放大測量大小, 結果是四倍體的氣孔長寬顯著較大。因為染色體倍體增加而使表皮細胞 及氣孔增大,所以降低了氣孔密度,這個結果和其他文獻報導現象是一 致(Gantait et al.2011, Abdoli et al. 2013; Majdi et al. 2010)。 丹參從蘭花瓶中移出來馴化前,必需先仔細將根部的培養基清洗乾 淨,否則很容易在殘留的培養基中滋生菌類,使丹參瓶苗死亡。在 3 吋 小盆栽生長 45 天後,基本上已經適應了外界的環境(圖 4.2) ,此時已經. 29.

(37) 可以移到 5 吋小盆栽中讓丹參曲繼續生長。丹參在一個月後能生長得更 旺盛(圖 4.3),根部也已經長滿了 5 吋盆栽,因此將丹參移到更大的 7 吋盆栽,並且移到能直接日照的室外空間。 換成 7 吋盆栽後大約經過 2 個月的時間(圖 4.4),也就是從馴化丹 參瓶苗開始大約 4 個月左右,丹參就會陸陸續續開花直到秋季末。雖然 這段期間的丹參植株持續開花,但是四倍體丹參 4x-1 的組別一直沒觀察 到開花的情形。推測其未開花的原因,有可能 1 mg/l 誘導四倍體的丹參 是不開花的品系,先前的文獻報導中有提到多倍體植株可能具有或不具 有繁殖能力,其中不具有繁殖能力的原因可能是因相似的基因組內染色 體不平衡所造成(夏等,2010) 。所以本實驗往下的不同倍體間的觀察比 較,將直接使用 2 mg/l 誘導的 4x-2 四倍體作為多倍體的實驗組別。 從已開花的丹參植株取成熟的花粉細胞在顯微鏡下觀察,可以明顯 看到四倍體的花粉粒比二倍體來得大。花開一個月後可以收成種子,在 解剖顯微鏡下觀察作比較可看到,種子在二倍體時是卵圓形,而染色體 加倍後則呈現更飽滿的形狀。以前的文獻有報導說,基因體的含量多寡 會與花粉、種子、葉片大小呈正相關(Chung et al. 1998) 。花粉與種子因 倍體數改變而產生變化的情形,在(Abdoli et al. 2013; Majdi et al. 2010) 文獻中也有提到。 一般丹參在種植後生長期約 10 個月以上收穫為最佳(張,2011), 而最適的採收季節則是在秋冬或早春,因為這時地上部大多已經枯萎, 養份蓄積在粗大的根部,此時所採收的根部活性成份最多(林等,2005)。 本試驗採取 6 個月大的植株根部作為樣品,進行初步的藥用成份分析。. 30.

(38) 結果顯示,四倍體植株的丹參酮 IIA 及隱丹參酮的含量較二倍體高,建 議未來可進一步將植株栽培至田間,以獲取大量成熟植株之根部樣品進 行分析。. 31.

(39) 表 4.1 丹參成熟葉片的形態比較 處理組. 小葉長(cm). 小葉寬(cm). 小葉面積(cm2) 複葉面積(cm2). 2X-WT. 3.75±0.11 a. 2.43±0.07 b. 5.20±0.27b. 37.32±1.81b. 4X-1 mg/l. 3.70±0.17 a. 3.23±0.08 a. 7.19±0.35a. 48.79±3.01a. 4X-2 mg/l. 3.64±0.12 b. 3.01±0.11 a. 5.91±0.31a. 40.67±3.71a. 數值旁的不同字母代表在鄧肯氏多變域分析( Duncan’s multiple range test) P<0.05 時有顯著差異。. 32.

(40) (A). (B). (C). 圖 4.1 不同倍體的丹參馴化 2 個月的葉片形態差異 A. 二倍體(WT) 丹參葉片 B. 四倍體(1 mg/l) 丹參葉片 C. 四倍體(2 mg/l) 丹參葉片. 33.

(41) (A). (B). (C). 圖 4.2 丹參苗馴化後在 3 吋小盆栽生長 45 天的情形 A. 二倍體(WT) 丹參苗 B. 四倍體(1 mg/l) 丹參苗 C. 四倍體(2 mg/l) 丹參苗. 34.

(42) (A). (B). (C). 圖 4.3 丹參苗馴化後在 5 吋盆栽生長 75 天情形 A. 二倍體(WT) 丹參植株 B. 四倍體(1 mg/l) 丹參植株 C. 四倍體(2 mg/l) 丹參植株. 35.

(43) (A). (B). (C). 圖 4.4 丹參苗馴化後 4 個月成長於 7 吋盆栽 A. 二倍體(WT) 丹參植株 B. 四倍體(1 mg/l) 丹參植株 C. 四倍體(2 mg/l) 丹參植株. 36.

(44) 總結 本論文比較丹參二倍體(2x)與兩品系四倍體(4x-1 及 4x-2)與二 倍體(2x)之在植株形態、生長發育表現及藥用成分之差異。結果顯示, 四倍體丹參在生長及藥用成分含量方面明顯優於二倍體。四倍體的生長 量、葉片數及根數皆顯著較二倍體為高,其丹參酮 IIA 及隱丹參酮之含 量亦較高。在栽培試驗期間(從瓶苗至盆栽共 10 個月),2x 及 4x-2 植 株能開花,並經自然授粉後結種子。然而,4x-1 並未開花。本論文之結 果顯示,丹參二倍體與四倍體之生長發育有明顯的差異,且兩品系四倍 體之間的生長及開花性狀亦有明顯的差異。. 37.

(45) 第五章 參考文獻 宋振巧、王建華、王洪剛、趙夫娟、郝力武。 (2009)丹參開花與繁育特 性研究。園藝學報,36(6):905-910。 林義恭、賴瑞聲、陳邦華。 (2005)丹參的種子發芽試驗及哉培條件。行 政院農業試驗所 技術服務季刊,64:15-17。 夏奇鈮、陳威臣、曹進義、李秋儀、吳姿穎。 (2013)丹參多倍體毛狀根 誘導研究。台灣農業研究,62(3) :280-288。 夏奇鈮、陳威臣、曹進義。 (2010)多倍體植物的產生、利用與展望。農 農業試驗所技術服務季刊,84:14-17。 夏奇鈮、黃健覃、陳威臣、曹進義、梁淑惠、蔡新聲。 (2010)利用莖節 培養誘導多倍體台灣金線連之研究。台灣農業研究, 59(3): 165-176。 陳威臣、曹進義、夏奇铌。 (2007)丹參組織培養苗馴化處理及其植株丹 參酮含量分析。台灣農業研究,56:21-30。 張同吳(2011)臺灣丹參優良農業操作體系之建立。2011 臺灣丹參產業 發展研討會,51-64。 蔡岡倫(2011)丹參葉培植體試管內形態發生及多倍體之誘導。國立高 雄大學生物科技研究所碩士論文。 劉文婷、梁宗鎖、蔣傳中、何蔚娟。(2004)丹參生殖生物學特性研究。 現在中藥研究與實踐,第 18 卷第 5 期 P17-20。 Abdoli, M., Moieni, A., Badi, H.N. (2013) Morphological, physiological, cytological and phytochemical studies in diploid and colchicine-induced. 38.

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