行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
L-glutamine 添加對燒燙傷老鼠營養素代謝及免疫反應之影
響 (II)
計畫類別： 個別型計畫 計畫編號： NSC91-2314-B-002-329- 執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣大學醫學院外科 計畫主持人： 陳維昭 計畫參與人員： 賴育妮 報告類型： 精簡報告 處理方式： 本計畫可公開查詢中 華 民 國 92 年 10 月 8 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫名稱：L-glutamine 添加對燒燙傷老鼠營養素代謝及免疫反應之影響(II) Effects of L-glutamine supplementation on nutrient metabolism and immune response in thermal injured mice (II)
計畫類別：個別型計畫 計畫編號：NSC-91-2314-B-002-329 執行期間：91 年 8 月 1 日 92 年 7 月 31 日 計畫主持人：陳維昭 計畫參與人員：賴育妮
執行單位：台大醫學院外科
中華民國九十二年八月二十 日
中文摘要
本研究以燒燙傷小鼠的動物模式來探討 glutamine (GLN)之添加對燒燙傷小鼠血 中 T 淋巴球分佈及特異性抗體產生之影響。由於燒燙傷病患最常被綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)感染，本研究以綠膿桿菌疫苗在燒傷前注入，來研究燒 傷前後不同時間 點特異性綠 膿桿菌抗體 產 生之情形。實驗 以剛斷奶之 雄性 BALB/c mice 為對象，將小鼠分成 2 組，一組以酪蛋白為蛋白質來源，另一組則 以 4﹪(w/w)的 GLN 取代酪蛋白，兩組除胺基酸組成不同外，其餘飼料組成均完 全相同。實驗開始前先眼窩採血當成測量抗體之基準值，並將綠膿桿菌疫苗(PEIF) 注入小鼠背部皮下，在第四週時給予第二次疫苗注射，實驗期共 7 週。在第七週 結束時將小鼠引致 30%燒傷，並於燒傷後 24 小時犧牲取血，測定 T 淋巴球分布 情形，及各不同時間點抗體產生之情形。結果顯示在 T 淋巴球分布方面，不論 是 CD3, CD4, CD8 在兩組之間均無差異。特異性綠膿桿菌抗體之產生，則在燒 傷前的各時間點及燒傷後 GLN 添加組均顯著較控制組高。此結果顯示 GLN 之 添加有促進體液性免疫反應之作用，但 CD4 T 細胞之增生可能不是特異性抗體 產生之原因。 關鍵字：燒傷、glutamine、T 淋巴球分佈、特異性抗體、疫苗、綠膿桿菌 AbstractThis study investigated the effect of glutamine (GLN) supplementation on specific antibody production and T lymphocyte distribution in burned mice vaccinated with detoxified Pseudomonas exotoxin A linked with the outer membrane proteins I and F, named PEIF. Fifty BALB/c mice were assigned to 2 groups. One group was fed a control diet with casein as the protein source, while the other group was
supplemented with 4% GLN replaced part of casein. The 2 groups were
isonitrogenous. The mice were immunized twice with PEIF, and the production of specific antibodies against PEIF was measured every week. After 8 weeks, all mice received a 30% body surface area burn injury. Mice were sacrificed 24h after the burn. The distribution of blood T lymphocyte subpopulations and the specific antibody production were analyzed. The results demonstrated that there were no significant differences in CD3, CD4 and CD8 T cell populations between the 2 groups after the burn. The production of specific antibodies against P. aeruginosa
significantly increased in the GLN group at 4 and 7 weeks after immunization, and 24 h after the burn. These results suggest that vaccinating mice with GLN
supplementation may enhance humoral immunity before and after burn injury.
計畫緣由與目的
燒燙傷(thermal injury)是一種會增加氧化壓力之創傷，其在病理、生理上的變化 包括嚴重的氮流失，代謝速率增加、賀爾蒙分泌之改變及免疫功能降低，另外燒 燙傷也會促使活性氧自由基之產生，而使遠離燒傷部位之器官受損，傷口難以癒 合易受細菌感染(1)。有報告顯示在受傷及手術狀況下，血中 GLN 的濃度明顯下 降，可能因而抑制免疫反應(immunosuppression)。嚴重燒燙傷時血中 GLN 之濃 度會降低，而補充較高量 GLN 之燒傷老鼠其腸道細菌轉移(translocation)之比例 較低。另外，依據臨床統計資料顯示綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)是目前院 內感染之主要致病菌，燒燙傷病患亦最常被綠膿桿菌感染(2)。目前關於 GLN 補 充對燒傷影響的研究並不多，大多著重在蛋白質及 GLN 之代謝，並無關於 GLN 對燒傷感染方面之研究，亦無對體內氧化狀態之研究，故在上年度計畫我們以燒 燙傷小鼠的動物模式，來探討 GLN 之添加對燒燙傷老鼠體內 nitric oxide(NO)產 生，一般營養素代謝，及抗氧化酵素系統之影響，及 GLN 添加對燒燙傷後感染 綠膿桿菌致死率之影響。本年度計劃著重在 GLN 添加對燒傷時特異性抗體產 生，及 T 淋巴球分布情形之影響。由於燒燙傷病患最常被綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染，本研究以綠膿桿菌疫苗在燒傷前注入，來探討燒傷前後特異性 綠膿桿菌抗體產生之情形。 材料與方法 本實驗以 50 隻剛斷奶之雄性 BALB/c mice 為對象，將老鼠分成 2 組，實驗開始 前先眼窩採血當成測量抗體之基準值，並將綠膿桿菌疫苗(PEIF)與 Freund’s complete adjuvant 等量相互乳化後注入小鼠背部皮下，並給予實驗飲食。兩組之 實驗飲食分別為，一組以酪蛋白為蛋白質來源，另一組則以 4﹪(w/w)的 GLN 取 代酪蛋白，兩組除胺基酸組成不同外，其餘飼料組成均完全相同。protein、fat、 carbohydrate 約佔總熱量之 20%、12%、68%。由前驅實驗已得知 PEIF 抗原注入 後約在 3-4 週時抗體 titer 達到高峰，此時再追加疫苗則在第 6-7 週時 titer 會再上 升，故於第四週(第 29 天)時給予第二次疫苗加強注射，以增強抗體之分泌，實 驗期共 7 週。在第七週結束時(第 50 天)將小鼠引致 30%燒傷，並於燒傷後 24 小 時犧牲取血及器官。全血以 Flow Cytometry 測定 T 淋巴球分布情形，血漿測定 baseline(第 1 天)、第 29 天、第 50 天(燒傷前)及第 51 天(燒傷後 24 小時)等各不 同時間點小鼠體內抗體產生之情形。另外在燒燙傷後 24 小時將小鼠之脾臟取出 分離出淋巴細胞以體外刺激之方式，分析其細胞激素 interleukin (IL)-4, IL-6 之產 生量。結果與討論
本研究結果顯示在 T 淋巴球分布方面，不論是 CD3, CD4, CD8 在兩組之間均無 差異(Table 1)。此結果與 Gismondo 等人(3)之研究不同，Gismondo 等人之研究顯 示與控制組相較，GLN 添加會增加裸鼠腸道中 CD3, CD4, CD8 淋巴球分布。可 能原因為 1) Gismondo 等人之研究為體外實驗，本實驗為體內實驗，體外實驗未 必能真正反應體內狀況。2) 前之實驗鼠為正常鼠本實驗則為燒傷老鼠，在代謝 壓力不同之狀況下，可能引致不同之結果。但在本實驗中我們發現，特異性綠膿 桿菌抗體之產生，在燒傷前的各時間點及燒傷後 GLN 添加組均顯著較控制組高 (Fig 1)。此結果顯示 GLN 之添加有促進體液性免疫反應(humoral immunity)之作 用，但 CD4 T 細胞之增生可能不是特異性抗體產生之原因。為了解細胞激素之 分泌在抗體產生作用上所扮演的角色，我們也以體外刺激的方式，以 mitogen 刺 激脾臟細胞來觀察與特異性抗體產生相關細胞激素分泌之情形，IL-4, IL-10 是由 Th2 type 細胞所分泌，Th2 type 細胞會活化 B 細胞並促進抗體之產生(4)，在本實 驗中 GLN 添加組與控制組在 IL-10 分泌上並無差異，但 IL-4 則 GLN 添加組顯 著較控制組高，此結果顯示 GLN 可能藉由促進 IL-4 之分泌來增加抗體之產生。 計畫成果自評 本計畫已遵照當初之實驗設計執行完畢，計畫之結果已投稿美國 Nutrition 雜誌， 目前已獲接受正在付印中。
Table 1. Blood CD4, CD8, and CD3 cells and the CD4/CD8 ratio
Between the 2 groups after the burn
CD4 (%) CD8 (%) CD4/CD8 CD3 (%)
Control
32.4 ± 6.9 14.8 ± 2.4 2.18 ± 0.23 45.3 ± 7.0
GLN
31.3 ± 4.8 12.8 ± 2.2 2.46 ± 0.25 38.5 ± 5.8
Data are expressed as the mean ± SD.
There were no significant differences in the distribution of CD4, CD8, CD3 populations or the CD4/CD8 ratio between the 2 groups.
Fig. 1. Production of PEIF-specific antibodies in the control and Gln groups. Mice were immunized twice with recombinant PEIF protein on days 1 and 28, and sera antibody titers were measured by ELISA at weeks 0, 4, 7, and 24h after the burn. The dilution of mice antiserum was 1:1000. * Significant difference between the 2 groups (p < 0.05).
References
1. Tredget EE, Yu YM. The metabolic effects of thermal injury. World J Surg 1992;16:68-79.
2. Holder IA. The pathogenesis of infection owing to Pseudomonas aeruginosa using the burned mouse model: experimental studies from the Shriners Burns Institute, Cincinnatti. Can J Microbiol 1985;31:393-402.
3. Gismondo MR, Drago L, Fassina MC, et al. Immunostimulating effect of oral glutamine. Dig Dis Sci 1998;43:1752-1757.
4. Dipiro JT. Cytokine networks with infection: mycobacterial infections, leishmaniasis, human immunodeficiency virus infection, and sepsis. Pharmacotherapy 1997;17:205-223.
