第一型糖尿病與高血壓引起勃起功能障礙之病理機制與治療策略

全文

(1)國⽴立台灣師範⼤大學⽣生命科學系碩⼠士論⽂文. 第⼀一型糖尿病與⾼高⾎血壓引起勃起功能障礙之病理機制與治療策略 The Exploration of Pathophysiologic Mechanisms and Therapeutic Strategy for Type I Diabetes and Hypertension Induced Erectile Dysfunction. 研究⽣生：廖品豪 Pin-Hao Liao 指導教授：鄭劍廷博⼠士 Chiang-Ting Chien, Ph.D.. 中華民國 103 年 12 ⽉月 24 ⽇日.

(2) 誌謝⾛走出圖書館，漫步在深夜的師⼤大分部，這座滋養了我七年求學時光的校院，每個轉⾓角每塊磚⽡瓦都記錄著我青春歲⽉月中的某段故事。︒｡E201/202 教室、︑､普⽣生實驗室、︑､已經廢棄的廉價⼜又實惠的男三舍、︑､永遠在好吃與不好吃之間不停轉變的中西餐廳、︑､和別⼈人的男朋友⼀一起等⼥女朋友的學七⼀一樓、︑､餵飽了我無數餐的⼩小七、︑､陪伴我⼀一年研究所時光的 D315A 和⽀支持我⾛走完研究之路的氧化壓⼒力實驗室，這些地⽅方，就像是設在腦海記憶中的錨點，每當經過，回憶總是湧上⼼心頭。︒｡在鍵盤上敲下這些⽂文字的同時，也宣告著我的碩⼠士⽣生即將涯告⼀一段落了，回⾸首這三年來往事歷歷在⽬目。︒｡能夠完成這篇論⽂文，真的是需要太多⼈人的幫助了。︒｡最先要感謝的，是爸爸和媽媽，你們總是尊重我的選擇，不論我跌多少次跤，永遠在後⾯面⽀支持著我。︒｡在研究所的前半年我經歷了⼀一段很⼤大的挫折，很感謝⼼心怡的傾聽和幫助，也很慶幸當時能有千緻的陪伴與⿎鼓勵。︒｡會選擇⽣生理組，最先要感謝的便是我曾經的⽼老師，現在的師公⿈黃基礎⽼老師，因為您教授的動物⽣生理學課程點燃了我對動物⽣生理學的興趣。︒｡再來就是最重要的，我的恩師鄭劍廷⽼老師，⾄至今仍很慶幸在我求學⽣生涯最低潮的時期能夠遇到鄭⽼老師，對於⼀一位剛認識的學⽣生，⽼老師卻願意給予極⼤大的信任與期勉，這對當時的品豪真的是⾮非常重要的⿎鼓勵。︒｡在⽼老師的指導下，品 . 1 .

(3) 豪學會許多動物實驗的技術，也學會了如何撰寫論⽂文和指導學弟妹，更重要的是⽼老師不論再忙也願意親⾃自指導學⽣生的精神。︒｡也要感謝台⼤大醫院的劉詩彬醫師和醫師助理祐汝姊，劉醫師提供了充裕的研究⾦金費，讓品豪在嘗試研究技術上的突破時可以沒有後顧之憂，也因為有祐汝姊的幫忙處理了所有繁瑣的⾏行政事務，品豪才得以專⼼心在研究。︒｡感謝吳忠信⽼老師在品豪研究所第⼀一年給予的指導，⽼老師給予學⽣生最⼤大的研究⾃自由度讓品豪可以⼤大膽的磨練動物實驗，為我的⼿手術技巧打下了堅實的基礎。︒｡感謝張皓翔醫師陪我⼀一起整理出了我的論⽂文摘要架構，還借我您的辦公室讓我寫論⽂文。︒｡也感謝靜儀學姊教導我如何使⽤用⾃自由基測定儀。︒｡研究的路上有多少⾟辛酸和歡樂，最清楚的⼀一定是⼀一起從事研究的夥伴們。︒｡在這當中，第⼀一個要感謝的是曾經的世彬後來的李爸，在剛讀研究所時那段有點晦暗時光裡幸好有李爸的激勵和陪伴，你總能不停地丟出更多的想法與問題讓我能不停地挑戰⾃自⼰己與挑戰別⼈人。︒｡永遠懷念我兩⼀一起挑戰⼤大⼩小⿏鼠腎神經的每個深夜不停地交棒接棒，好幾次忙得太晚導致機⾞車還被鎖在學校裡⾯面必須兩個⼈人偷偷摸摸的從正⾨門騎出去。︒｡再來要感謝居然連⽼老師都要叫超哥的俊超，在 Westernblot 上提供了我⾮非常多的幫助，讓我從不是很懂到可以⾃自⼰己操作，真的是⾮非常感謝。︒｡感謝本實驗室的切⽚片染⾊色⼤大神可是其實是個中⼆二的煒哲教我如何做切⽚片染⾊色的統計。︒｡感謝怡慧恬⽂文幫忙處理實驗室的⼤大⼩小事讓我們可以專⼼心的做研究。︒｡感謝我們 . 2 .

(4) 實驗室的三姝玥希、︑､彥廷和伊婷，你們為實驗室⽣生活帶來了許多樂趣。︒｡感謝⼩小董學弟和詠詩學妹幫我買了好多次宵夜。︒｡感謝蚯蚓、︑､晉榮為實驗室提供了不少笑點。︒｡在論⽂文撰寫的最後階段真的是⽣生活作息不正常到需要很多⼈人的體諒和關⼼心。︒｡感謝銘亨和韻如開啟我登⾼高⼭山的興趣，我們⼀一起爬的那些百岳為我的碩⼠士⽣生活點綴了許多樂趣。︒｡在論⽂文衝刺的最後這幾個⽉月，感謝睿嫻的陪伴和體諒⽀支持著我。︒｡要感謝的⼈人真的很多，有太多的⼈人默默地幫助了我許多，在這裡要向所有幫助過我的⼈人致上深深的感謝。︒｡當然還要感謝那些⾮非⼈人類的，我的兩隻陪伴了我研究過程中許多寂寥夜晚的⼩小⿇麻煩，⾺馬尼貓和 FiFi ⿃鳥。︒｡碩⼠士只是⼈人⽣生的⼀一個階段，在這裡我學會了很多也想了很多。︒｡我想這當中最寶貴的就是在這過程中所認識的各位，因為讀了碩⼠士，才能在兩千多萬⼈人的台灣裡讓我們能夠⾛走到⼀一起，我將永遠珍惜這份緣份。︒｡接下來品豪要向⾃自⼰己⼈人⽣生的下⼀一站前進了，但是我相信不論未來我們相隔多遠，命運總會讓我們再聚在⼀一起。︒｡期待未來相逢笑談過往。︒｡. . 3 .

(5) 中⽂文摘要. 研究背景：⾼高⾎血壓與糖尿病為現代⼈人常⾒見之⽂文明病。︒｡⾼高⾎血壓與糖尿病造成男性勃起功能障礙可能是因⾎血管、︑､神經與平滑肌病變和內分泌睪固酮失調所致。︒｡我們推論其造成勃起功能障礙的病⽣生理機轉為：⾧長期⾼高⾎血壓與⾼高⾎血糖環境可能會增加活性氧產⽣生⽽而(1)引起發炎反應，(2) 降低陰莖海綿體之⼀一氧化氮產⽣生與作⽤用，(3)增加活性氧產⽣生會氧化⼤大分⼦子如 DNA、︑､脂質與蛋⽩白質造成陰莖海綿體內神經、︑､⾎血管與平滑肌⾁肉細胞進⾏行三種計畫性細胞死亡如細胞⾃自噬、︑､細胞凋亡與發炎性細胞死亡，(4)直接影響勃起功能之海綿體神經發⽣生⽣生理失調與病理結構病變⽽而無法刺激陰莖海綿體之勃起，(5) 影響 Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)/NF-E2-related factor (Nrf-2)/Heme-oxygenase 1 (HO-1)表現與訊息途徑⽽而造成勃起功能障礙。︒｡研究⽅方法：本研究利⽤用正常⾎血壓之 WKY 成年雄⿏鼠與⾃自發性⾼高⾎血壓之成年雄⿏鼠。︒｡實驗分成四組：正常⾎血壓 WKY 組(N=6)，糖尿病 WKY 組 (N=6)，⾼高⾎血壓 SHR 組 (N=6)與糖尿病合併⾼高⾎血壓 SHR 組 (N=6)。︒｡我以腹腔注射鏈佐霉素 (Streptozotocin，65 mg/kg)誘發第⼀一型糖尿病。︒｡ . 4 .

(6) 記錄海綿體內壓觀察代謝症候群⽼老⿏鼠的海綿體勃起功能，以⾼高感度化學發光偵測儀定量⾎血液中活性氧數量觀察氧化壓⼒力變化，以組織免疫染⾊色與西⽅方墨點法觀察三種計畫性細胞死亡包括細胞凋亡、︑､細胞⾃自噬與發炎性細胞凋亡相關蛋⽩白的表現與作⽤用，以及⼀一氧化氮量測儀觀察組織內⼀一氧化氮變化量。︒｡我亦探究⼀一氧化氮前驅化學物質與內⽪皮⼀一氧化氮合成酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS）抑制劑對勃起功能之影響。︒｡研究⽬目的：為釐清糖尿病與⾼高⾎血壓引起男性勃起功能障礙的病理機轉，並建⽴立找尋新型治療策略的動物⽣生理模式。︒｡. 研究結果：結果顯⽰示⾼高⾎血壓組(ΔICP/MAP = 0.22±0.02, N=6)與糖尿病組(ΔICP/MAP = 0.27±0.01, N=6)之陰莖海綿體勃起功能顯著低於控制組(ΔICP/MAP = 0.33±0.01, N=6)，且同時罹患⾼高⾎血壓與糖尿病的組別有更低之陰莖海綿體勃起功能(ΔICP/MAP = 0.20±0.02, N=6)。︒｡⾼高⾎血壓組(lucigenin ROS = 784±452 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 741±132 counts/120 sec, N=6)與糖尿病組(lucigenin ROS = 643±192 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 393±158 counts/120 sec, N=6)之氧. . 5 .

(7) 化壓⼒力壓顯著⾼高於控制組(lucigenin ROS = 445±160 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 117±74 counts/120 sec, N=6)，且同時罹患⾼高⾎血壓與糖尿病的組別有更⾼高的氧化壓⼒力 (lucigenin ROS = 5820±259 counts/120 sec, N=6；luminol ROS = 4550±1537 counts/120 sec, N=6)。︒｡靜脈注射左旋精氨酸後各組勃起海綿體內壓與海綿體⼀一氧化氮量皆有提⾼高。︒｡控制組在注射⼈人⼯工合成的⼀一氧化氮提供劑 CCL5 後亦有較⾼高的勃起海綿體內壓。︒｡注射內⽪皮⼀一氧化氮合成酶(eNOS) 拮抗劑 N-硝基 -L- 精氨酸甲酯 (Nω-Nitro-L-Arginine methyl ester hydrochloride, L-NAME)會明顯降低所有組別之勃起海綿體內壓。︒｡與控制組⽐比較，糖尿病會增加發炎指標（Cluster of Differentiation 68 , CD68）、︑､細胞凋亡蛋⽩白 cleaved-Caspase-3、︑､細胞⾃自噬蛋⽩白 Beclin-1、︑､與保護性蛋⽩白 Nrf-2 之表現。︒｡與控制組⽐比較，⾼高⾎血壓亦增加發炎指標 CD68、︑､細胞凋亡蛋⽩白 cleaved-Caspase-3、︑､細胞⾃自噬蛋⽩白 Beclin-1、︑､與保護性蛋⽩白 Nrf-2 和 HO-1 之表現。︒｡⽽而糖尿病合併⾼高⾎血壓組別有更⾼高之發炎指標 CD68、︑､細胞凋亡蛋⽩白 cleaved-Caspase-3、︑､細胞⾃自噬蛋⽩白 Beclin-1、︑､與保護性蛋⽩白 Nrf-2 和 HO-1 之表現。︒｡在陰莖海組織染⾊色也⼀一致性發現糖尿病、︑､⾼高⾎血壓或是糖尿病合併⾼高⾎血壓會造成陰莖內神經、︑､海綿體和⾎血管組織 . 6 .

(8) 增加⽩白⾎血球浸潤、︑､CD68 單核球（Monocyte）數⽬目、︑､肥⼤大細胞（Mast Cell）數⽬目、︑､細胞凋亡與細胞⾃自噬數⽬目與纖維化程度⽽而 eNOS 表現則降低。︒｡. 結論：綜合以上實驗結果，代謝症候群引起勃起功能失常可能是透過氧化壓⼒力、︑､發炎、︑､細胞凋亡與細胞⾃自噬的增加，雖然 Nrf-2/HO-1 保護機制有略為增加但不能對抗嚴重的傷害程度。︒｡給予 CCL5 及左旋精氨酸可以改善勃起功能。︒｡關鍵字：⾼高⾎血壓、︑､第⼀一型糖尿病、︑､勃起功能障礙、︑､活性氧、︑､細胞凋亡、︑､細胞⾃自噬、︑､⼀一氧化氮. . 7 .

(9) Abstract Background: Diabetes and hypertension are modern civilization diseases, and they are also the major factors contributing to erectile dysfunction (ED) possibly via vascular, neuronal, smooth muscle cell damage and endocrine testosterone dysregulation. The possible pathophysiologic mechanisms of ED may be ascribed to excess reactive oxygen species (ROS) generation (1) leading to inflammation in the corpus cavernosum, (2) decreasing the production and activity of nitric oxide (NO), (3) oxidizing DNA, lipid and protein in vascular, neuronal and smooth muscle cells of corpus cavernosum leading to three types of programmed cell death, apoptosis, autophagy and pyroptosis, (4) directly impairing cavernous nervous function and structural alteration leading to ED, and (5) affecting of Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)/NF-E2-related factor (Nrf-2) and heme oxygenase 1 (HO-1) expression/signaling to leading to ED. The therapeutic potential of NO donors were also evaluated in our ED model. Purpose: I explored the pathophysiologic mechanisms and therapeutic effect of NO donors on hypertension and diabetes induced ED in the rats. Methods: I used adult male Wistar Kyoto rats (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR) in this study. I divided these rats into four groups, normal WKY (N=6), diabetic WKY (N=6), normal SHR (N=6) and diabetic SHR (N=6). I induced streptozotocin (65 mg/kg, i.p.) to induce . 8 .

(10) type I diabetes in WKY and SHR rats. I recorded intra-cavernous pressure (ICP) as the index of erectile function by electrical stimulation of cavernosal nerves. I used an ultrasensitive chemiluminescence analyzer to determine blood ROS and oxidative stress.. I utilized. Western Blotting and the immunohistochemistry to explore the possible proteins involved three types of programmed cell death, apoptosis, autophagy and pyroptosis in the penis tissue. I also used a NO detector to measure NO amount and the effect of NO donor and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor on hypertension and diabetes induced ED in the rats. Results: The ratio of ΔICP/MAP was significantly decreased in normal SHR (ΔICP/MAP = 0.22±0.02, N=6), diabetic WKY (ΔICP/MAP = 0.27±0.01, N=6), and diabetic SHR (ΔICP/MAP = 0.20±0.02, N=6) when compared to normal WKY rats (ΔICP/MAP = 0.33±0.01, N=6). The amount of oxidative stress was significantly increased in normal SHR (lucigenin ROS = 784±452 counts/120 sec, N=6; luminol ROS = 741±132 counts/120 sec, N=6), diabetic WKY (lucigenin ROS = 643±192 counts/120 sec, N=6; luminol ROS = 393±158 counts/120 sec, N=6), and diabetic SHR (lucigenin ROS = 5820±259 counts/120 sec, N=6; luminol ROS = 4550±1537 counts/120 sec, N=6) when compared to the normal WKY (lucigenin ROS = 445±160 counts/120 sec, N=6; luminol ROS = 117±74 counts/10 sec, N=6). Intravenous administration . 9 .

(11) of L-Arginine markedly increased the ICP and NO amount in all four groups. Intravenous synthetic NO donor CCL5 also dose-dependently increased ICP in the ED rats. However, eNOS inhibitor treatment (Nω-Nitro-L-Arginine. methyl. ester. hydrochloride,. significantly depressed ICP in all four groups.. L-NAME). When compared to. normal WKY rats, diabetes increased inflammatory cluster of differentiation 68 (CD68) and mast cells numbers, apoptotic cleaved Caspase-3, autophagic Beclin-1 and protective Nrf-2 expression in the penis. When compared to normal WKY rats, diabetes increased inflammatory cluster of differentiation 68 (CD68), mast cells numbers, apoptotic cleaved Caspase-3, autophagic Beclin-1 and protective Nrf-2 expression in the penis. In comparison with normal WKY, hypertension also enhanced CD68, apoptotic cleaved Caspase-3, autophagic Beclin-1 and Nrf-2/HO-1 expression. In addition, diabetic SHR had a highest CD68,. apoptotic. cleaved-Caspase-3,. autophagic. Beclin-1. and. Nrf-2/HO-1 expression when compared to normal WKY, diabetic WKY and SHR. The results from immunohistochemistry showed that diabetic WKY, SHR and diabetic SHR consistently displayed higher stains of leukocyte infiltration, CD68, mast cells, cleaved-Caspase-3, Beclin-1, fibrosis and Nrf-2/HO-1 expression and a decreased stain of eNOS in the impaired cavernosal nerves and vessels and corpus cavernosum of the penis. . 10 .

(12) Conclusion: Based on these results, diabetes and hypertension led to ED through the increased oxidative stress, inflammation, apoptosis and autophagy and the decreased NO synthesis and production. Although Nrf-2/HO-1 signaling is mildly enhanced after hypertension or diabetes, the upregulation seems to be inadequate to confer protection. The application of CCL5 and L-Arginine can improve the degree of ED.. Key words: Hypertension, Type I diabetes, Erectile dysfunction, Reactive oxygen species, Apoptosis, Autophagy, Nitric oxide. . 11 .

(13) ⽬目錄中⽂文摘要 ............................................................................................................................... 4 Abstract .................................................................................................................................. 8 縮寫表 ................................................................................................................................. 14 1-1、︑､研究背景與特⾊色 ............................................................................................................ 17 1-2 、︑､代謝症候群造成勃起功能障礙之機制及分類 .................................................. 18 1-2-1、︑､糖尿病與勃起功能障礙 ....................................................................................................... 18 1-2-2、︑､⾼高⾎血壓與勃起功能障礙 ....................................................................................................... 19 1-2-3、︑､⼀一氧化氮與勃起功能障礙 .................................................................................................. 20 1-2-4、︑､⾃自由基與勃起功能障礙 ....................................................................................................... 21 1-3、︑､計劃性細胞死亡與勃起失常之關聯 ....................................................................... 21 1-3-1、︑､計劃性細胞死亡意義 ............................................................................................................ 22 1-3-2、︑､計劃性細胞死亡之分類 ....................................................................................................... 22 1-3-3、︑､⾃自由基與計劃性細胞死亡 .................................................................................................. 24 1-4、︑､ Nrf-2-Keap1 pathway ..................................................................................................... 25 1-5、︑､左旋精氨酸在勃起過程中的重要性與其潛在治療效果 .................................. 27 1-6、︑､研究的重要性與⽬目的 ................................................................................................... 28 . 第⼆二章研究材料與⽅方法 Materials and Methods ................................................ 30 2-1、︑､實驗動物分組 ................................................................................................................. 31 2-1-1 ⾃自發性⾼高⾎血壓⿏鼠 (Spontaneously hypertensive rats, SHR) ........................................ 31 2-1-2 正常控制組⽼老⿏鼠 (Wistar-Kyoto rats, WKY) .................................................................. 31 2-2、︑､第⼀一型糖尿病誘發⽅方法 .............................................................................................. 32 2-2-1、︑､糖尿病誘發⽤用藥物：鏈佐霉素 Streptozotocin, STZ ............................................... 32 2-2-2、︑､糖尿病動物誘發⽅方式 ............................................................................................................ 32 2-3、︑､陰莖海綿體神經電刺激與海綿體內壓及⼀一氧化氮含量記錄 ........................ 33 2-3-1、︑､⿇麻醉與插管 ............................................................................................................................... 33 2-3-2、︑､游離陰莖海綿體神經 ............................................................................................................ 34 2-3-3、︑､陰莖海綿體內壓記錄 ............................................................................................................ 35 2-3-4、︑､即時陰莖海綿體組織⼀一氧化氮含量變化記錄 ........................................................... 35 . 12 .

(14) 2-3-5、︑､針對左旋精氨酸治療效果評估之給藥流程 ................................................................ 36 2-3-6、︑､針對 CCL5 治療效果評估之給藥流程 .......................................................................... 37 2-4、︑､西⽅方墨點轉漬 Western Blotting ................................................................................ 38 2-5、︑､免疫組織化學染⾊色 Immunohistochemistry, IHC ................................................. 45 2-6、︑､ Masson’s Trichrome Stain ............................................................................................ 48 2-7、︑､ TUNEL Assay .................................................................................................................. 49 2-8、︑､離體⾎血液⾃自由基測定 ................................................................................................... 52 . 第三章研究結果 Results ............................................................................................ 55 3-1、︑､ STZ 誘發第⼀一型糖尿病造成體重下降與⾼高⾎血糖及代謝參數變化 ............... 56 3-2、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病造成⾎血液⾃自由基增加 .................................................... 57 3-3、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病嚴重影響陰莖海綿體勃起內壓 .................................. 58 3-4、︑､左旋精氨酸與 CCL5 對由⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病所引起之勃起失常之治療效果 .............................................................................................................................................. 60 3-5、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病嚴重影響陰莖海綿體組織⼀一氧化氮釋放能⼒力與 eNOS 表現量 .............................................................................................................................. 61 3-6、︑､左旋精氨酸改善勃起時陰莖組織⼀一氧化氮釋放能⼒力 ...................................... 62 3-7、︑､⾼高⾎血壓誘發陰莖海綿體組織、︑､⾎血管與神經細胞發炎反應 ............................. 64 3-8、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病誘發陰莖海綿體組織、︑､⾎血管與神經細胞凋亡 ...... 65 3-9、︑､⾼高⾎血壓誘發陰莖海綿體組織、︑､⾎血管與神經細胞⾃自噬 ...................................... 65 3-10、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病誘發陰莖組織 Nrf-2/HO-1 保護機制 ...................... 66 3-11、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病導致陰莖海綿體組織與⾎血管週邊纖維化 ............. 68 . 第四章、︑､總結 Conclusion ............................................................................................ 69 . 第五章、︑､討論 Discussion ............................................................................................. 71 . 圖表 Figures ..................................................................................................................... 81 . 表格 Table ...................................................................................................................... 120 . 參考⽂文獻 .......................................................................................................................... 123 . 13 .

(15) 縮寫表 ARE. Antioxidant Response Element. Ca2+. Calcium ion. CCL5. CysaCysd Lu5. CS. Cavernous Sinus. eNOS. Endothelial Nitric Oxide Synthase. HO-1. Heme Oxygenase 1. HRP. Horseradish Peroxidase. ICP. Intra-Cavernous Pressure. IHC. Immunohistochemistry. IL-1. Interleukin 1. IL-18. Interleukin 18. Keap-1. Kelch like ECH-associated. ⼆二價鈣離⼦子⼈人⼯工合成⼀一氧化氮提供劑陰莖海綿體竇. Nω-Nitro-L-Arginine methyl ester 10-Methyl-9-(10-methylacridin-105-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazin edione. . 陰莖海綿體內壓免疫組織化學染⾊色. 第⼗十⼋八型⽩白細胞間介素. ium-9-yl) acridin-10-ium dinitrate,. Luminol. ⼭山葵過氧化酶. 第⼀一型⽩白細胞間介素. hydrochloride. Lucigenin. 內⽪皮⼀一氧化氮合成酶第⼀一型⾎血紅素氧化酶. Protein-1. L-NAME. 抗氧化反應因⼦子. 14 . 類 Kelch 第⼀一型 ECH 關聯蛋⽩白 N-硝基-L-精氨酸甲酯光澤精發光氨.

(16) MAP. Mean Arterial Pressure. NO. Nitric Oxide. NOS. Nitric Oxide Synthase. Nrf-2. Nuclear Factor E2-related Factor 2. O2-.. Superoxide. ONOO-. Peroxynitrite. PARP. Poly-ADP-Ribose Polymerase. PE50/240. Polyethylene Catheter-50/240. PMT. Photomultiplier. PVDF. Polyvinylidene-Fluoride Membrane. ⼀一氧化氮⼀一氧化氮合成酶核因⼦子 E2 相關因⼦子 2 超氧陰離⼦子過亞硝酸鹽聚 ADP 核糖聚合酶 50,240 號聚⼄乙烯管光電倍增管. Membrane SNAP. 平均動脈壓. S-Nitroso-N-acetyl-DL-Penicillami ne. SHR. Spontaneously Hypertensive Rats. STZ. Streptozotocin. TUNEL. Terminal Deoxynucleotidyl. 聚⼆二氟⼄乙烯膜 S-亞硝基⼄乙酰青霉胺⾃自發性⾼高⾎血壓⿏鼠鏈佐霉素. Transferase-Mediated Nick-End. TUNEL 細胞凋亡染⾊色. Labeling. . VOM. Veno-Occlusive Mechanism. WKY. Wistar-Kyoto rats. 陰莖靜脈閉塞機制 Wistar-Kyoto ⿏鼠. 15 .

(17) 第⼀一章緒論 Introduction. . 16 .

(18) 1-1、︑､研究背景與特⾊色. 許多研究指出⾼高⾎血壓與糖尿病患者普遍患有勃起功能障礙。︒｡患有勃起功能障礙的男性患者中有百分之三⼗十五⾄至七⼗十五同時患有糖尿病 (Vinik, Maser et al. 2003)。︒｡在⼀一個針對兩百三⼗十六位男性代謝症候群患者的研究報告當中指出，百分之九⼗十六點五有勃起功能障礙，百分之三⼗十九點六患者性慾低下，百分之⼆二⼗十⼆二點七出現早洩，百分之四點⼋八有延遲射精之情形 (Chughtai, Lee et al. 2011)。︒｡勃起功能障礙可能起因於雄性素分泌不⾜足、︑､⼼心⾎血管系統、︑､陰莖平滑肌與⾃自律神經受損 (Hecht, Neundorfer et al. 2001) 。︒｡⾼高⾎血壓與糖尿病可能透過雄性素分泌不⾜足（尤其是睪固酮）(Corona, Mannucci et al. 2009)、︑､陰莖⾎血管內⽪皮受損 (Huang 2009)、︑､陰莖平滑肌功能失常 (Dorrance, Lewis et al. 2002) 與海綿體神經病變 (Kamenov and Traykov 2012) 造成勃起功能障礙。︒｡本研究特點有四，（⼀一）本研究所使⽤用之技術為⽬目前已知唯⼀一能同時即時記錄⾎血壓、︑､海綿體內壓與海棉體組織⼀一氧化氮含量之⽅方法（⼆二）以⾼高⾎血壓合併糖尿病評估代謝症候群對勃起功能之影響，並討論三種計劃性細胞死亡（三）探討⼀一氧化氮在代謝症候群引起之勃 . 17 .

(19) 起功能失常中的變化（四）測試新型⼈人⼯工合成之⼀一氧化氮提供劑 CCL5 對⾼高⾎血壓與糖尿病引起之勃起功能失常的治療效果。︒｡. 1-2 、︑､代謝症候群造成勃起功能障礙之機制及分類. 1-2-1、︑､糖尿病與勃起功能障礙. 糖尿病引起的⾃自律神經受損對⼼心⾎血管、︑､呼吸、︑､消化、︑､泌尿⽣生殖、︑､體溫調節與神經內分泌系統造成的影響是造成患者⽣生命威脅的主因 (Low, Vernino et al. 2003, Boulton, Vinik et al. 2005, Vinik and Ziegler 2007)。︒｡在前⼈人的研究中指出，糖尿病引起勃起功能障礙的原因主要與⾃自律神經的受損有關 (Sasaki, Yoshimura et al. 2003)。︒｡陰莖海綿體神經的完整性對於正常的勃起功能有決定性的影響，即使是極⼩小的⼿手術損傷都有可能導致勃起不能 (Walsh and Donker 2002, Klotz 2004)。︒｡. . 18 .

(20) 1-2-2、︑､⾼高⾎血壓與勃起功能障礙. ⾼高⾎血壓與⼼心⾎血管疾病是男性勃起功能障礙的危險因⼦子 (Bansal 1988, Burchardt, Burchardt et al. 2000)，且勃起功能障礙的嚴重度與患有⾼高⾎血壓的時間及程度有關(Feldman, Johannes et al. 2000)。︒｡有報告指出，百分之三⼗十五點⼆二的⾼高⾎血壓患者有勃起功能障礙，⽽而正常組別僅有百分之⼗十四點⼀一患有勃起功能障礙 (Doumas, Tsakiris et al. 2006)。︒｡. 當陰莖⾎血管壁平滑肌與陰莖海綿體平滑肌舒張時，在平均動脈壓（ Mean Arterial Pressure, MAP ）的驅動下，流⼊入陰莖海綿體竇（Cavernous Sinus, CS）的⾎血流量增加導致勃起。︒｡當陰莖海綿體竇充滿了⾎血液後，陰莖靜脈閉塞機制（Veno-Occlusive Mechanism, VOM） (Valji and Bookstein 1987) 使陰莖⾎血液流出量減少，陰莖海綿體內壓得以維持。︒｡⾧長期的⾼高⾎血壓會導致陰莖海綿體平滑肌組織與⾎血管纖維化，使得陰莖海綿體竇順應性減低、︑､⾎血管壁增厚與管徑減少，進⽽而使得陰莖⾎血流量降低，陰莖靜脈閉合不全(Kovanecz, Rambhatla et al. 2008)，最終導致勃起功能失常 (Dorrance, Lewis et al. 2002, Javaroni and . 19 .

(21) Neves 2012)。︒｡然⽽而使⽤用抗⾼高⾎血壓的藥物例如 ACE 抑制劑可能導致勃起功能的惡化 (Weiss 1991)。︒｡因此，其治療策略仍需未來更進⼀一步的研究。︒｡. 1-2-3、︑､⼀一氧化氮與勃起功能障礙. 位於陰莖海綿體動脈內⽪皮細胞之左旋精氨酸 (L-Arginine) 透過內⽪皮⼀一氧化氮合成酶 (Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS) 或稱 NOS3 的催化產⽣生⼀一氧化氮 (Nitric Oxide, NO)，⼀一氧化氮⾃自內⽪皮細胞釋放⾄至海綿體組織間會使海綿體平滑肌細胞膜外之⼆二價鈣離⼦子 (Calcium ion, Ca2+) 流⼊入量減少引起平滑肌舒張。︒｡陰莖海綿體平滑肌舒張後⾎血液可以⼤大量流⼊入並填滿陰莖海綿體平滑肌間隙，使得陰莖充⾎血勃起。︒｡陰莖海綿體平滑肌與海綿體動脈的受損使得⼀一氧化氮的釋放異常是⽼老化、︑､糖尿病與⾼高⾎血壓造成的勃起功能障礙的主因 (Ushiyama, Morita et al. 2004)。︒｡⼀一氧化氮釋放異常可能起因於（ㄧ）eNOS 蛋⽩白表現量降低或酵素功能異常（⼆二）內⽪皮細胞左旋精氨酸貯存量不⾜足（三）⾃自內⽪皮細胞釋放⾄至⾎血液之⼀一氧化氮量減少（四）釋放出之⼀一氧化氮遭⾃自由基氧化失去功能。︒｡ . 20 .

(22) 1-2-4、︑､⾃自由基與勃起功能障礙. 氧化壓⼒力(Oxidative Stress)引起的神經⾎血管組織異常在糖尿病患者罹患勃起功能障礙的過程中是不可忽視的⼀一環 (Agarwal, Nandipati et al. 2006)。︒｡⾃自由基當中最主要的超氧陰離⼦子（Superoxide , O2-. ）會使⼀一氧化氮氧化形成過亞硝酸鹽 (Peroxynitrite , ONOO-) (Butler, Flitney et al. 1995, Darley-Usmar and White 1997, Trujillo, Alvarez et al. 1998)，使得陰莖⼀一氧化氮含量減少，破壞依賴⼀一氧化氮的平滑肌舒張功能。︒｡. 1-3、︑､計劃性細胞死亡與勃起失常之關聯. 陰莖海綿體組織、︑､陰莖海綿體⾎血管或陰莖海綿體神經細胞的損傷亦有可能是導致勃起功能失常的原因。︒｡細胞⾧長期處在⾼高⾎血壓與⾼高⾎血糖的惡劣環境下有可能出現計畫性細胞死亡（Programed Cell Death, PCD）或發炎反應。︒｡陰莖海綿體組織的損傷會使得勃起時海綿體充⾎血量降低或是陰莖⾎血液流出量的增加導致勃起時陰莖海綿體組織中⾎血量的減少，使得勃起時陰莖海綿體內壓降低；陰莖海綿體⾎血管的損壞會使得⾎血液流⼊入量減少或流出量增加；陰莖海綿體神經的損傷則會影 . 21 .

(23) 響勃起時訊息的傳遞。︒｡因此我們針對觀察上述各組織中幾種常⾒見的細胞損傷途徑例如細胞凋亡、︑､細胞⾃自噬或發炎進⾏行探究，透過代表性的蛋⽩白質表現量來衡量傷害的程度。︒｡. 1-3-1、︑､計劃性細胞死亡意義. 當細胞⽼老化、︑､遭遇到毒性物質或受到外在環境變動的影響時會開啟計劃性細胞死亡。︒｡在正常情況下這種計劃性的死亡可以淘汰功能不全或不正常的細胞，幫助維持⽣生體內代謝恆定。︒｡但是在許多疾病或是毒物的影響下也可能透過此機制導致細胞的不正常死亡⽽而造成正常⽣生理功能的失常。︒｡本實驗所採⽤用計劃性細胞死亡之定義乃參考 Fink 於 2005 年發表於 Infection and Immunity 之⽂文獻 (Fink and Cookson 2005)。︒｡. 1-3-2、︑､計劃性細胞死亡之分類. 1）細胞凋亡(Apoptosis) 細胞凋亡為細胞在外在環境刺激下受到基因調控所產⽣生的計劃性細胞死亡。︒｡細胞凋亡發⽣生時有幾個主要特徵，諸如細胞質中產⽣生⼩小 . 22 .

(24) 囊泡、︑､DNA 斷裂及染⾊色質濃縮等。︒｡細胞凋亡的過程中有許多蛋⽩白質的參與，可分為促進或引起細胞凋亡因⼦子如 p53, Bax, Bak, Nbk/Bik1, Bad, Bcl-xS，抑制因⼦子如 bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w, adenovirus E1B 19K, EBV BHRF1, Ced-9 等。︒｡在細胞凋亡過程中，腫瘤抑制基因 p53 受到 DNA 的損傷⽽而激發，刺激 Bax 的表現，導致粒線體內外膜間的 Cytochrome C 釋放⾄至細胞質中。︒｡Cytochrome C 與細胞質中的 Apaf-1 及 Procaspase-9 共同組成凋亡⼩小體 (Apoptotic body)，即為 Caspase-9 的活化態。︒｡ Caspase-9 會引起下游的 Caspase 級聯反應，活化 Caspase3,6,7 等能引起計劃性細胞死亡的蛋⽩白酶，例如使得 Procaspase-3 被激活為 Caspase-3 進⽽而引起 DNA 被核酸內切酶降解、︑､細胞縮⼩小與染⾊色質濃縮等結果(Yang, Yao et al. 2014)。︒｡因此，細胞質中的 Cytochrome C、︑､Caspase-3 表現量與 Bax/Bcl-2 之⽐比值可作為檢測細胞凋亡的指標。︒｡. 2）細胞⾃自噬(Autophagy) 細胞⾃自噬為真核細胞⽤用以清除細胞內⽼老化或壞損的胞器及異常堆積的物質的⽅方式。︒｡藉由⾃自噬⼩小體 (Autophagosome) 包裹壞損胞器或蛋⽩白質，並與細胞內的溶酶體 (Lysosome) 融合形成⾃自噬溶酶體 (Autolysophagosome) ，利⽤用溶酶體中的酵素將包裹中的胞器或蛋⽩白. . 23 .

(25) 質分解以維持細胞代謝平衡，且分解的同時亦能提供細胞所需的組成物質。︒｡在⾃自噬作⽤用中 autophagy-related gene 6 (Atg-6) 或稱 Beclin-1 與 Atg5-12 引起⾃自噬⼩小體的形成(Qian, Yang et al. 2011)，因此可作為檢測細胞⾃自噬的指標。︒｡. 1-3-3、︑､⾃自由基與計劃性細胞死亡. 細胞中各類胞器如粒線體當中的⾃自由基增加時可能透過 Caspases、︑､ Lysosomal proteases 或 Endonucleases 等蛋⽩白質的表現或活化引起三類計劃性細胞死亡如細胞凋亡（Apoptosis）、︑､細胞⾃自噬（Autophagy）與發炎性細胞凋亡（Pyroptosis） (Chen and Gibson 2008, Miao, Rajan et al. 2011, Orrenius, Nicotera et al. 2011, Qian, Yang et al. 2011, Yeh, Chiang et al. 2011)。︒｡由受損的粒線體產⽣生的⾃自由基如超氧陰離⼦子（O2-）與過氧化氫（H2O2）將促使粒線體將 Cytochrome C 釋放⾄至細胞質中活化 Caspase3 與 PARP 蛋⽩白進⽽而啓動細胞凋亡機制，同時也可能透過促進 Beclin-1、︑､LC3-II 與 ATG5-ATG12 等蛋⽩白質的表現引起細胞⾃自噬 (Chien, Chang et al. 2005, Chien, Shyue et al. 2007, Chen and Gibson 2008, Ha, Noh et al. 2012, Kathiria, Butcher et al. 2012) 。︒｡另⼀一⽅方⾯面，氧化壓⼒力的增加或發炎促使. . 24 .

(26) Inflammasome-caspase-1、︑､IL-1beta/IL-18 的活化與表現所引起的另⼀一種與細胞凋亡不同的計劃性細胞死亡發炎性細胞凋亡（Pyroptosis）會進⼀一步導致組織受損 (Miao, Rajan et al. 2011, Zheng, Whitman et al. 2011) 。︒｡在動物模式與臨床研究中已經證實在⾧長期慢性疾病中 Caspase-1 與 IL-1beta/IL-18 分泌量會增加 (Anders and Muruve 2011)。︒｡在本實驗中，我們預期有勃起功能障礙的⾼高⾎血壓與糖尿病⽼老⿏鼠的發炎與氧化壓⼒力的提升會在⾎血管組織、︑､平滑肌細胞與神經組織中引起三種計劃性細胞死亡。︒｡許多證據顯⽰示在糖尿病引起的神經⾎血管損傷中， Poly-ADP-Ribose Polymerase （PARP）的活化扮演著⾄至關重要的⾓角⾊色，同時也是糖尿病引起勃起功能障礙中相當重要的⼀一環。︒｡因為 PARP 酶的活化在糖尿病引起的勃起功能障礙中扮演了極為重要的⾓角⾊色，所以抑制 PARP 酶的活化將可能是預防糖尿病導致勃起功能障礙具有潛⼒力的治療策略 (Wan, Li et al. 2011)。︒｡. 1-4、︑､Nrf-2-Keap1 pathway. Nuclear Factor E2-related Factor 2 (Nrf-2) 為⼀一種保護性的轉錄因⼦子。︒｡ Nrf-2-Keap1 pathway 是細胞遭遇到外來傷害諸如毒物或⾃自由基時的細胞⾃自我保護機制。︒｡ Nrf-2 透過辨識⼈人類抗氧化反應因⼦子 . 25 .

(27) （Antioxidant Response Element, ARE）結合位以調控解毒酵素的表現，並且具有調控細胞抗氧化與抗發炎反應的功能，在許多疾病及計劃性細胞死亡中扮演了關鍵性的保護⾓角⾊色 (Kobayashi, Li et al. 2009, Copple, Goldring et al. 2010)。︒｡在⼀一般情況下，位於細胞質中的 Nrf-2 與類 Kelch 第⼀一型 ECH 關聯蛋⽩白 (Kelch like ECH-associated Protein-1, Keap1) 耦合形成 Nrf-2-Keap1。︒｡當細胞遭遇到傷害諸如毒化物或是⾃自由基攻擊時，Nrf-2 會與 Keap1 分開並穿越核膜進⼊入細胞核內與 DNA 上的 ARE 結合位結合，開啟保護性蛋⽩白例如第⼀一型⾎血紅素氧化酶 (Heme Oxygenase 1, HO-1) 的轉錄進⽽而啟動細胞的防衛機制。︒｡正常細胞在遭遇到氧化壓⼒力的提升或是外來傷害的增加時會啟動保護機制例如 Nrf-2 蛋⽩白所誘發的抗氧化保護途徑，因此可預期受損組織 Nrf-2 總表現量可能增加。︒｡但是當保護機制被破壞或是抑制時亦可能是造成更進⼀一步傷害的原因，因此我們測量 Nrf-2 蛋⽩白的表現量以釐清 Nrf-2 保護機制作⽤用與否且有無失常。︒｡. . 26 .

(28) 1-5、︑､左旋精氨酸在勃起過程中的重要性與其潛在治療效果. 陰莖海綿體內⽪皮細胞與神經纖維皆有⼀一氧化氮合成酶 (Nitric Oxide Synthase, NOS) 分佈 (Burnett, Lowenstein et al. 1992, Dail, Barba et al. 1995)。︒｡已知勃起過程中，儲存於陰莖海綿體內⽪皮細胞之左旋精氨酸 (L-Arginine) 會透過內⽪皮⼀一氧化氮合成酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS）催化產⽣生⼀一氧化氮 (NO)，⾃自內⽪皮細胞釋放⾄至海綿體組織間的⼀一氧化氮會使海綿體動脈平滑肌細胞內⼆二價鈣離⼦子 (Ca2+) 量減少引起平滑肌舒張使⾎血流量增加，⾎血液⼤大量流⼊入並充滿海綿體(Ignarro, Bush et al. 1990, Rajfer, Aronson et al. 1992)。︒｡⽽而給予⼀一氧化氮或⼀一氧化氮合成酶抑制劑會抑制勃起時的陰莖海綿體內壓（Intra-Cavernous Pressure, ICP）(Ignarro, Burke et al. 1984, Ignarro, Bush et al. 1990, Kim, Azadzoi et al. 1991)。︒｡因此，適量的補充左旋精氨酸可以預期能提⾼高此反應的速率。︒｡並且，左旋精氨酸的所具有的抗氧化能⼒力(Shan, Wang et al. 2013)應可減緩因⾼高⾎血壓或第⼀一型糖尿病所導致的⾼高氧化壓⼒力所帶來的組織傷害與及⼀一氧化氮的氧化。︒｡有研究指出，給予正常公⿏鼠⼝口服或靜脈注射左旋精氨酸皆可以提⾼高電刺激陰莖海綿體神經時的勃起海綿體內壓（ICP） (Escrig, Gonzalez-Mora et al. 1999)。︒｡所以，我推測經由靜脈給予適量的左旋精氨酸對於由⾼高⾎血 . 27 .

(29) 壓或第⼀一型糖尿病所導致的勃起功能障礙具有改善的效果。︒｡. 1-6、︑､研究的重要性與⽬目的. 由於⽬目前⼈人類⽣生活與飲⾷食習慣的改變，隨著許多成年男性罹患⾼高⾎血壓與糖尿病的⽐比例逐年提升，勃起功能障礙的發⽣生也逐年提升。︒｡正常的性⽣生活是維持健康家庭關係不可或缺的。︒｡因為勃起功能失常導致的性交不能不僅可能引起夫妻關係失和，更可能因此降低⽣生育率，進⽽而加劇⼈人⼝口⽼老化。︒｡然⽽而，⽬目前市⾯面上使⽤用的藥物如威⽽而剛與犀利⼠士雖能暫時性恢復勃起功能，卻不具備治療效果，同時因為副作⽤用的關係在使⽤用上造成⼀一定的⾵風險與困難度。︒｡因此，對於⾼高⾎血壓與糖尿病引起的男性勃起功能失常的研究與及有效且安全的治療藥物的發現顯得格外重要。︒｡. 本實驗將透過記錄海綿體內壓觀察⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病⽼老⿏鼠的海綿體勃起功能；⾎血液⾃自由基觀察氧化壓⼒力變化；西⽅方墨點法觀察陰莖組織細胞凋亡、︑､細胞⾃自噬、︑､發炎蛋⽩白與保護蛋⽩白的表現量；組織免疫染⾊色觀察陰莖各部位細胞凋亡、︑､細胞⾃自噬、︑､發炎蛋⽩白與 eNOS 的表現；⼀一氧化氮量測儀觀察組織內⼀一氧化氮改變量。︒｡⽬目的為透過電⽣生 . 28 .

(30) 理與分⼦子⽣生物學技術釐清⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病引起男性勃起功能障礙之間的病理機轉，建⽴立新型治療策略的動物⽣生理研究模式並測試具有潛⼒力的治療藥物。︒｡. . 29 .

(31) 第⼆二章研究材料與⽅方法 Materials and Methods. . 30 .

(32) 2-1、︑､實驗動物分組. 實驗動物分為四組，分別為控制組 (WKY-CON, N=6)、︑､糖尿病組 (WKY-STZ, N=6)、︑､⾼高⾎血壓組 (SHR-CON, N=6) 與⾼高⾎血壓糖尿組 (SHR-STZ, N=6)。︒｡本實驗所使⽤用之動物均取⾃自樂斯科實驗動物中⼼心 (BioLASCO Taiwan Co., Ltd)。︒｡. 2-1-1 ⾃自發性⾼高⾎血壓⿏鼠 (Spontaneously hypertensive rats, SHR). 本實驗使⽤用⾃自發性⾼高⾎血壓⿏鼠 (Spontaneously Hypertensive Rats, SHR)作為⾼高⾎血壓之模式動物。︒｡SHR 為⽬目前已廣泛被當作研究⾼高⾎血壓的動物模式。︒｡此品系在出⽣生後五周起會出現⾃自發性⾼高⾎血壓。︒｡研究指出 SHR 的海綿體勃起能⼒力有顯著下降的趨勢 (Clark, Sahu et al. 1991)。︒｡. 2-1-2 正常控制組⽼老⿏鼠 (Wistar-Kyoto rats, WKY). WKY 為 SHR 近交品系的對照組，於本實驗中作為⾼高⾎血壓組別之 . 31 .

(33) 對照組。︒｡. 2-2、︑､第⼀一型糖尿病誘發⽅方法. 2-2-1、︑､糖尿病誘發⽤用藥物：鏈佐霉素 Streptozotocin, STZ. 鏈佐霉素 (Streptozotocin, STZ; Sigma, Missouri, USA) 為⼀一種由鏈球菌所產⽣生的抗⽣生素，對胰島 β 型細胞具有毒殺作⽤用，為⽬目前研究第⼀一型糖尿病動物模式常⽤用的誘發藥物。︒｡於本實驗中使⽤用單次⾼高劑量腹腔注射鏈佐霉素來誘發動物產⽣生第⼀一型糖尿病。︒｡. 2-2-2、︑､糖尿病動物誘發⽅方式. 於動物七周⼤大始飼養於國⽴立台灣師範⼤大學動物房，給予充⾜足乾淨飼料、︑､墊料與⾃自來⽔水。︒｡⽇日夜週期為⼗十⼆二⼩小時光亮-⼗十⼆二⼩小時⿊黑暗。︒｡於動物⼋八周⼤大時將動物禁⾷食六到⼋八⼩小時。︒｡於注射前，將鏈佐霉素以 10 mg/ml 的濃度溶於檸檬酸鈉 (0.1 mol/L Sodium Citrate Buffer, pH 4.5; Sigma, Missouri, USA)中，因鏈佐霉素溶解後必須在五分鐘內注射完. . 32 .

(34) 畢，建議先以 1.5ml 離⼼心管將之分裝後置於攝⽒氏-20 度冷凍，待注射前再溶於檸檬酸鈉，且過程需避光。︒｡在糖尿病組動物腹腔注射⾼高劑量的鏈佐霉素 (Streptozotocin, STZ, 65 mg/kg; Sigma, Missouri, USA) 誘發糖尿病，對照組則注射對應體積的溶劑檸檬酸鈉。︒｡由於鏈佐霉素對胰島 β 型細胞的傷害屬於壞死（Necrosis）型毒殺，為避免短時間內胰島 β 型細胞內的胰島素⼤大量釋放導致動物因⾎血糖過低⽽而休克死亡，建議於注射藥物後改以重量百分率濃度 10％的果糖⽔水餵⾷食⼀一天，再改回⾃自來⽔水餵⾷食。︒｡本糖尿病誘發之步驟與⽅方法乃參考 Wu 於 2001 年發表於 Current Protocols in Pharmacology 之⽂文獻 (Wu and Huan 2001)。︒｡記錄誘發後第 0, 7, 14, 21, 28 天之⾎血糖與體重變化。︒｡於本實驗中，認定空腹⾎血糖值⾼高於 140 mg/dL 且顯著⾼高於控制組即為罹患第⼀一型糖尿病。︒｡. 2-3、︑､陰莖海綿體神經電刺激與海綿體內壓及⼀一氧化氮含量記錄. 2-3-1、︑､⿇麻醉與插管. 將誘發成功四周後的實驗動物腹腔注射胺甲酸⼄乙酯 (Urethane,. . 33 .

(35) 1500 mg/kg; Sigma, Missouri, USA) ⿇麻醉。︒｡動物採取仰躺姿勢保定於⼿手術台上。︒｡將動物頸部⽪皮膚及筋膜縱向剪開露出氣管，於氣管柔軟處橫向切開⼀一 2-3mm 的開⼝口後插⼊入 3-4cm PE240 軟管並以細尼⿓龍線將氣管與軟管綁牢。︒｡再以灌注含肝素（Heparin, 10U/1ml）⽣生理⾷食鹽⽔水之 PE50 細管進⾏行左頸動脈插管連接壓⼒力轉換器(BP-100, IWorx/CB Sciences, Dover, NH, USA) 以記錄動脈內壓，另以灌注⽣生理⾷食鹽⽔水之五⼗十號聚⼄乙烯管（Polyethylene Catheter-50, PE50）進⾏行右頸靜脈插管以便後續實驗給藥。︒｡本研究所使⽤用之動物模式配置圖如下。︒｡. 2-3-2、︑､游離陰莖海綿體神經. ⾃自下腹中線以⼿手術⼑刀劃開表⽪皮與肌⾁肉層，找出位於前列腺背側的盆腔神經節 (Pelvic Ganglion) 下⾏行分⽀支海綿體神經 (Cavernous Nerve)，以玻璃棒謹慎地將神經⾃自前列腺 (Prostate) 游離，以兩⽀支不鏽鋼電極勾起，另⼀一端連接電刺激器 (S9 Stimulator, Grass, Wisconsin, USA)。︒｡. . 34 .

(36) 2-3-3、︑､陰莖海綿體內壓記錄. 將陰莖包⽪皮⾃自中線剪開露出陰莖，於動物陰莖左側根部以已灌注含肝素之⽣生理⾷食鹽⽔水之⼀一次性頭⽪皮針 (24G*3/4” Scalp Vein Set; Nipro, Osaka, Japan) 插⼊入陰莖海綿體，另⼀一端連接壓⼒力轉換器 (BP-100, IWorx/CB Sciences, Dover, NH, USA) 記錄海綿體內壓 (ICP)。︒｡⼿手術完成後讓動物休息五分鐘待海綿體內壓穩定後進⾏行ㄧ分鐘的電刺激 (6V/60Hz/duration=10ms)。︒｡海綿體內壓以壓⼒力轉換器及橋接式放⼤大器 (ML224 Quad Bridge Amp; ADInstruments, New South Wales, Australia) 將壓⼒力訊號轉換成電訊號傳⼊入⽣生理訊號記錄儀 (ML870 PowerLab 8/30; ADInstruments, New South Wales, Australia) 同步記錄於電腦並顯⽰示於螢幕上。︒｡. 2-3-4、︑､即時陰莖海綿體組織⼀一氧化氮含量變化記錄. ⼀一氧化氮探針 (INC-020, NO Electrode; Inter Medical co., Ltd, Aichi, Japan ) 於使⽤用前須先進⾏行校正 (Ichimori, Ishida et al. 1994, Noiri, Peresleni et al. 1996)。︒｡先將⽣生理⾷食鹽⽔水以氮氣脫氧2⼩小時，將校正⽤用⼀一氧化氮供體 S- 亞硝基⼄乙酰青霉胺 . 35 .

(37) (S-Nitroso-N-acetyl-DL-Penicillamine, SNAP; Sigma, Missouri, USA) 溶於攝⽒氏三⼗十七度之⽣生理⾷食鹽⽔水中 (1.1 mg/ml) 配製成校正液。︒｡於⼀一褐⾊色玻璃⼩小瓶中盛裝攝⽒氏37度5毫升脫氧⽣生理⾷食鹽⽔水及磁⽯石攪拌⼦子，置於加熱攪拌器上 (HTS-1003, Hotplate Sterrer; LMS, Tokyo, Japan)，將探針浸泡於其中。︒｡校正初先記錄基線，後依次滴⼊入10 微升校正液，每次滴⼊入後需待數值平穩在滴⼊入第⼆二次，共計滴⼊入五次，即可得校正曲線。︒｡探針所記錄之訊號由電化學放⼤大器 (IMEC-601/601A, Electrochemical Amplifier; Inter Medical co., Ltd, Aichi, Japan) 整合放⼤大並由⽣生理訊號記錄儀 (ML870 PowerLab 8/30 ; ADInstruments, New South Wales, Australia) 同步記錄於電腦並顯⽰示於螢幕上。︒｡實驗動物陰莖⿔龜頭處插⼊入19號針頭 (19G*11/2” Terumo Needle; Terumo, Tokyo, Japan) 作為導管。︒｡將⼀一氧化氮探針插⼊入導管即可開始量測陰莖組織⼀一氧化氮變化量。︒｡. 2-3-5、︑､針對左旋精氨酸治療效果評估之給藥流程. 紀錄開始後持續記錄 5 分鐘之基線，於 5 分鐘時靜脈注射 0.2 毫升之⽣生理⾷食鹽⽔水。︒｡於 35、︑､41、︑､47 分鐘時各給予 1 分鐘的電刺激與 5 . 36 .

(38) 分鐘的休息。︒｡於 53 分鐘時靜脈注射 0.2 毫升的左旋精氨酸 (L-Arginine, Sigma, Missouri, USA) (25 mg/kg body weight) (Escrig, Gonzalez-Mora et al. 1999)，靜置 30 分鐘後於 83、︑､89、︑､95 分鐘時各給予 1 分鐘的電刺激與 5 分鐘的休息。︒｡於 91 分鐘時靜脈注射 0.2 毫升的 eNOS 拮抗劑 N- 硝基 -L- 精氨酸甲酯. (Nω-Nitro-L-Arginine methyl ester. hydrochloride, L-NAME; Sigma, Missouri, USA) (3 mg/kg body weight)(Richard, Hogie et al. 1995, Escrig, Gonzalez-Mora et al. 1999, Li, Shaw et al. 2005) ，靜置 30 分鐘後於 121、︑､127、︑､133 分鐘時各給予 1 分鐘的電刺激與 5 分鐘的休息後結束紀錄。︒｡. 2-3-6、︑､針對 CCL5 治療效果評估之給藥流程. 紀錄開始後持續記錄5分鐘之基線，於5分鐘時靜脈注射0.2毫升之⽣生理⾷食鹽⽔水後給予1分鐘3伏特之陰莖海綿體神經電刺激，接著給予 5分鐘的休息；於下⼀一次電刺激前給予1 µg 之⼈人⼯工合成⼀一氧化氮提供劑CysaCysd Lu5 (CCL5, 1 µg/300g body weight)，接著給予1分鐘3伏特之陰莖海綿體神經電刺激並於休息5分鐘後接續下⼀一實驗流程。︒｡於6伏特的電壓強度下依序給予不同劑量之CCL5（0 µg, 1 µg, 2 µg, 3 µg and 4 µg/300g body weight）並電刺激陰莖海綿體神經電⼀一分 . 37 .

(39) 鐘，每次電刺激結束需休息5分鐘始可接續下⼀一次電刺激，於記錄完5 組不同劑量的陰莖海綿體最⼤大勃起內壓後結束紀錄。︒｡. 2-4、︑､西⽅方墨點轉漬 Western Blotting. 1）組織萃取液製備與蛋⽩白質定量. 將攝⽒氏-80 度冷凍的陰莖組織浸於液態氮中研磨成粉，加⼊入 RIPA-Protease Inhibitor 混勻於冰上靜置 15 分鐘後以攝⽒氏四度 14000rpm 離⼼心半⼩小時後取上清液保存。︒｡以蛋⽩白質定量試劑（Bio-RAD Protein Assay; BIO-RAD, Hercules, California, USA) 定量。︒｡. 2）架模與鑄膠. 以 100％酒精擦拭架模⽤用玻璃表⾯面避免灰塵與凹凸不平影響電泳時蛋⽩白質的泳動速率。︒｡將鑄膠台(BIO-RAD, Hercules, California, USA) 架好後倒滿 ddH2O 靜置五分鐘檢測是否漏液。︒｡鑄膠前須先選擇膠體濃度，膠體越濃蛋⽩白質跑得越慢越適合觀察⼩小分⼦子蛋⽩白質，除特殊情況外，⼀一般建議使⽤用可觀察各種⼤大⼩小分⼦子量的的 10％膠體。︒｡（⾒見下表）. . 38 .

(40) Resolving Gel 10% (Lower Gel). Stacking Gel 4% (Upper Gel). ddH2O. 4.11 ml. ddH2O. 6.11 ml. 1.5M Tris-HCl. 2.5 ml. 0.5M Tris-HCl. 2,5 ml. (Resolving Buffer). (Stacking Buffer). Acrylamide/Bis. 3.33 ml. Acrylamide/Bis. 1.3 ml. 10% APS. 5 µl. 10% APS. 50 µl. TEMED. 10 µl. TEMED. 10 µl. 注⼊入下層膠體 (Resolving Gel) 後滴少許 100%酒精壓平膠體，靜置數分鐘待膠體凝結後注⼊入上層膠體 (Stacking Gel) 放⼊入⿒齒梳（Comb）靜待數分鐘凝結。︒｡（此時若要存放⾄至下次再使⽤用，切勿取下⿒齒梳，連玻璃取下以清⽔水沖洗後放⼊入夾鏈袋中加 ddH2O 或 Running buffer 置於攝⽒氏 4 度冰箱存放，但不建議存放過久。︒｡）將鑄好之膠體連同玻璃⼀一同放⼊入電泳槽中注滿 Running Buffer。︒｡（⾒見下表）. 10X Running Buffer. . Tris base. 30.0 g. Glycine. 144.0 g. 39 .

(41) SDS. 10.0 g. ddH2O. 1000 ml. 3）配置與注⼊入樣本液. 樣本液的配置精準尤為重要，在配置前須先計算每⼀一格所需注⼊入的樣本液中的濃度與⽐比例。︒｡原則上，每格注⼊入之溶液總體積、︑､Sample Buffer 體積及蛋⽩白質總量必須相等，不⾜足的部分以 RIPA-Protease Inhibitor 補⾜足⾄至總體積相等，⼀一般⼗十格的情況下，每格不要注⼊入超過 30 µl，⼗十五格時每隔不要超過 25 µl。︒｡最外側兩格注⼊入 5 µl Protein Ladder (Chromatein Prestained Protein Ladder; Vivantis, Oceanside, California, USA) 並補 RIPA-Protease Inhibitor 與 1X Sample Buffer ⾄至體積與其他格相同。︒｡. 4）電泳. 電泳時需確定電極是否反接。︒｡電泳分為兩階段，第⼀一階段⽬目的是使蛋⽩白質進⼊入膠體中，此階段使⽤用較低電壓 (60V) 以便每⼀一格的蛋⽩白質泳動時不致有速度上的差異。︒｡待每⼀一格蛋⽩白質皆抵達下膠時可調整⾄至⾼高電壓 (90-110V) 此為第⼆二階段，即讓蛋⽩白質於下膠中泳動並 . 40 .

(42) 依照不同分⼦子量所產⽣生的速率差⽽而分開。︒｡觀察 Protein Ladder 與 Protein Buffer 之位置以決定何時停⽌止電泳。︒｡. 5）轉漬. 電泳後蛋⽩白質已分佈於膠體中，下⼀一步乃將膠體中的蛋⽩白質轉漬⾄至聚⼆二氟⼄乙烯膜. (Polyvinylidene-Fluoride Membrane, PVDF. Membrane; Darmstadt, Germany)上以進⾏行後續的抗體結合。︒｡轉漬的原理是利⽤用蛋⽩白質受 SDS 變性後帶負電的特性將負極端的蛋⽩白質從膠體推送⾄至正極端的 PVDF Membrane 上。︒｡轉漬時轉漬槽中需注⼊入 Transfer Buffer (TG buffer : Methanol : ddH2O = 1 : 2 : 7)（⾒見下表），其基本配置模式⾒見下圖。︒｡設定電流為 100mA 轉漬 12-18 ⼩小時，並將轉漬槽置於攝⽒氏四度冰箱中並免溫度過⾼高，需特別注意正負極是否有反接的情形。︒｡. 10X TG Buffer. . Tris. 30 g/L. Glycine. 144 g/L. 41 .

(43) 6）檢視蛋⽩白質轉漬結果及切膜. 為了確認蛋⽩白質轉漬的結果是否如預期或是有瑕疵，將轉漬後的膜置於麗春紅 (Ponceau S; Sigma, Missouri, USA) 中，帶負電的麗春紅可與帶正電的氨基酸與及蛋⽩白質的⾮非極性區域結合，進⽽而形成紅⾊色的條狀帶。︒｡麗春紅可以蒸餾⽔水、︑､PBS 或含有 0.1% Tween 20 的 Tris-buffered saline solution (TBST) 洗淨。︒｡以麗春紅染⾊色後，可依實驗需求進⾏行膜的切割。︒｡. 7）Blocking . 42 .

(44) 將膜置於 blocking buffer (HyBlock 1-min Blocking Buffer, Hycell international Co. Ltd., Taipei, Taiwan) 中 45 秒後，浸泡於 TBST Buffer （⾒見下表）置於平⾯面震盪器 (OS701, KS Orbital Shaker; IKA, Staufen, German) 上以轉速 100rpm 震盪清洗三次，每次五分鐘。︒｡. 10X TBS Buffer Tris. 30 g/L. NaCl. 80 g/L. KCl. 2 g/L. PH (25. ). 7.4 ± 0.2. 8）⼀一級抗體接合. ⼀一級抗體會與⽬目標抗原如蛋⽩白質、︑､胜肽、︑､醣類等進⾏行特異性結合，通常不與染劑結合，不會顯⾊色。︒｡此步驟之⽬目的為使抗體接合⾄至⽬目標抗原上。︒｡分別將對應 Nrf-2（Cell Signaling, Inc.）, β-actin（Sigma, Missouri, USA）, cleaved Caspase-3（Cell Signaling, Inc.）, CD68（AbD Serotec）, Beclin-1（Protein Tech Group, Chicago, IL）之抗體依照相對應的⽐比例（根據該抗體廠商所提供之建議濃度）溶於 TBST buffer，並將與之 . 43 .

(45) 相對應的膜浸⼊入其中，於攝⽒氏 4 度，以轉速 50rpm 震盪 12 ⼩小時。︒｡將⼀一級抗體回收後以 TBST buffer 清洗 3 次，每次 5 分鐘，以移除未接合之⼀一級抗體。︒｡. 9）⼆二級抗體接合. 已接合⼭山葵過氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 之⼆二級抗體會與⼀一級抗體上特定⽚片段結合。︒｡此步驟之⽬目的為使⼆二級抗體與前⼀一步驟之⼀一級抗體接合，以達到顯⾊色的⽬目的。︒｡將⼆二級抗體以 1:10000 之⽐比例溶於 TBST Buffer 中，並將膜浸於對應之⼆二級抗體中，於室溫下以轉速 50rpm 震盪 1 ⼩小時。︒｡將溶液移除後以 TBST Buffer 清洗 3 次，每次 5 分鐘，以移除未接合之⼆二級抗體。︒｡. 10）呈⾊色. 將發光氨（Luminol）與過氧化氫（Peroxide）(HyECL Western Chemiluminescent Kit, Hycell International Co. Ltd., Taipei, Taiwan ) 以1:1混勻後均勻分佈於膜上。︒｡發光氨（Luminol）會被過氧化氫（ Peroxide 及 HRP 氧化產⽣生化學螢光，透過冷光影像分析儀（ ImageQuant LAS 4000 mini, Luminescent Image Analyzer; GE. . 44 .

(46) Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom）記錄並分析。︒｡. 2-5、︑､免疫組織化學染⾊色 Immunohistochemistry, IHC. 免疫組織化學染⾊色（Immunohistochemistry, IHC）是利⽤用組織抗原與抗體的專⼀一性接合反應將染劑接合⾄至特定蛋⽩白質上。︒｡其基本步驟可分為切⽚片、︑､脫蠟⽔水化、︑､抗原活化、︑､Blocking、︑､抗原抗體反應、︑､呈⾊色與脫⽔水封⽚片。︒｡操作步驟如下：. 1）脫蠟與⽔水化. 先將玻⽚片置⼊入烘箱中以攝⽒氏 65 度烘⽚片 5 分鐘使蠟融化，接著將玻⽚片依序浸⼊入以下溶液： a. Xylene 5min b. Xylene 5min c. 100% EtOH 2min d. 100% EtOH 2min e.. 95% EtOH 2min. f.. 75% EtOH 2min. . 45 .

(47) g.. 50% EtOH 2min. h. ddH2O 暫存. 2）抗原活化. 將脫蠟⽔水化完成之玻⽚片置於以⽔水浴槽加熱⾄至攝⽒氏 95 度之 Antigen Retrieval Buffer 中浸泡 20 分鐘使抗原活化。︒｡靜置降溫⾄至室溫後取出以圈畫筆圈畫組織樣本，並滴上 3%H2O2 靜置 15 分鐘。︒｡以 PBS Buffer 清洗兩次。︒｡. 3）Blocking. 輕扣玻⽚片去除玻⽚片上之 PBS 液體，滴上 5% BSA (in PBS) 靜置於常溫 1-4 ⼩小時。︒｡以 PBS Buffer 清洗兩次。︒｡. 4）抗原抗體反應. 輕扣玻⽚片去除玻⽚片上之 PBS Buffer 液體，滴上⼀一抗後靜置於攝⽒氏 4 度冰箱中 12-18 ⼩小時，讓抗體緩慢穩定地與蛋⽩白質接合。︒｡以 PBS Buffer 清洗兩次並輕扣玻⽚片將玻⽚片上之 PBS Buffer 甩乾。︒｡滴上⼆二抗 (1:800) 置於常溫中 0.5-1 ⼩小時。︒｡以 PBS Buffer 清洗兩次。︒｡. . 46 .

(48) 5）呈⾊色. 呈⾊色的第⼀一個步驟是要讓被抗體染到的地⽅方呈現咖啡⾊色。︒｡玻⽚片下墊⼀一張⽩白紙，將 DAB (ImmPACT DAB Peroxidase Substrate; Vector, Burlingame, California, USA) 滴於組織樣本上靜置約兩分鐘，觀察組織是否已呈現咖啡⾊色，接著以 PBS Buffer 清洗兩次。︒｡第⼆二步是是讓細胞核呈現藍紫⾊色，⽅方法是將 DAB 呈⾊色後的組織滴上⼀一⾄至兩滴西式⼗十倍的 Hematoxylene 靜置 1-3 分鐘，以 PBS Buffer 清洗兩次。︒｡於顯微鏡下觀察是否已成功染⾊色。︒｡. 6）脫⽔水封⽚片. 將染⾊色完成之玻⽚片依步驟 1 脫蠟⽔水化的相反順序逐漸脫⽔水。︒｡將浸置於 Xylene 中的玻⽚片取出滴上數滴封⽚片膠後 (Mounting Medium; Leica Biosystems, Nussloch, Germany) 蓋上蓋玻⽚片。︒｡靜置於抽氣櫃中陰乾，隔⽇日即可觀察與拍攝。︒｡. . 47 .

(49) 2-6、︑､Masson’s Trichrome Stain. 本實驗利⽤用此⽅方法檢測陰莖組織之纖維化程度，染⾊色後膠原纖維呈現藍⾊色，細胞核呈現⿊黑⾊色，細胞質、︑､肌⾁肉、︑､紅⾎血球等均呈紅⾊色。︒｡本實驗使⽤用 Polysciences, Inc., Taipei, Taiwan 提供之 Masson’s Trichrome Stain Kit，其染⾊色步驟如下：. 1）脫蠟與⽔水化. 參照 2-5 步驟 1 脫蠟與⽔水化 2）滴約 100µl Bouin’s Fixative Solution 於脫蠟⽔水化後的切⽚片組織上（視切⽚片組織⼤大⼩小⽽而定），置於攝⽒氏 60 度 1 ⼩小時。︒｡ Note: 置於烘箱時注意不要讓溶液乾掉。︒｡. 3）將玻⽚片置於流動的⾃自然⽔水下五分鐘以清除 Picric acid。︒｡. 4）滴約 100µl Weigert’s Iron Hematoxylin Working Solution 於切⽚片組織上靜置 10 分鐘後以流動的⾃自然⽔水清洗 5 分鐘，再以 ddH2O 清洗⼀一次。︒｡. . 48 .

(50) 5）滴約 100µl Biebrich Scarlet-acid Fusion Solution 於切⽚片組織上靜置 5 分鐘後以 ddH2O 清洗⼀一次。︒｡ 6）滴約 100µl Phosphotungstic/Phosphomolybdic acid 於切⽚片組織上靜置 10 分鐘後，將溶液移除。︒｡ 7）直接滴約 100µl Aniline blue 於切⽚片組織上靜置 5 分鐘後以 ddH2O 清洗⼀一次。︒｡ 8）滴約 100µl Acetic acid 於切⽚片組織上靜置 1 分鐘後以 ddH2O 清洗⼀一次。︒｡. 9）脫⽔水封⽚片. 將染⾊色完成之玻⽚片依步驟 1 脫蠟⽔水化的相反順序逐漸脫⽔水。︒｡將浸置於 Xylene 中的玻⽚片取出滴上數滴封⽚片膠後 (Mounting Medium; Leica Biosystems, Nussloch, Germany) 蓋上蓋玻⽚片。︒｡靜置於抽氣櫃中陰乾，隔⽇日即可觀察與拍攝。︒｡. 2-7、︑､TUNEL Assay. 本實驗利⽤用 . TUNEL 49 . (Terminal. Deoxynucleotidyl.

(51) Transferase-Mediated Nick-End Labeling) Assay (DNA Fragmentation Kit; BioVision, Milpitas, California, USA) (Chien, Lee et al. 2001) 測定切⽚片組織中細胞凋亡程度。︒｡本實驗所使⽤用之⽅方法乃依照原廠所提供之操作步驟說明，其步驟如下：. 1）脫蠟與⽔水化. 參照 2-5 步驟 1 脫蠟⽔水化步驟. 2）細胞透化（Cell Permeabilization）. 將蛋⽩白質酶 K (Proteinase K) 以 10 mM Tris pH 8 稀釋 100 倍，滴約 100µl 於玻⽚片組織上，於常溫下靜置 20 分鐘後以 PBS Buffer 清洗⼀一次。︒｡. 3）去內⽣生性過氧化氫酶活性 (Inactivation of Endogenous Peroxidase). 滴約 100 µl 的 3% H2O2 於玻⽚片組織上，靜置 5 分鐘後以 PBS buffer 清洗⼀一次。︒｡. 4）平衡 (Equilibration). 將 5X Reaction Buffer 以 ddH2O 稀釋五倍後滴約 100 µl 於玻⽚片 . 50 .

(52) 組織上，靜置 10 到 30 分鐘，此時可準備步驟 5-i 所需使⽤用之 DNA Labeling Solution（⾒見表 2-7-1）。︒｡. 5）去氧核醣核酸標記與呈⾊色 (DNA Labeling Reaction and Detection). i.. 將步驟 4 的 1X Reaction Buffer 移除後滴約 50 µl 於玻⽚片組織上，並覆蓋⼀一⽚片封⼝口膜 (Parafilm)，靜置於攝⽒氏 37 度 1 ⾄至 1.5 ⼩小時後移除封⼝口膜並以 PBS Buffer 清洗⼀一次。︒｡. ii. 滴約 100 µl 之 Blocking Buffer 於玻⽚片組織上，於常溫下靜置 10 分鐘。︒｡ iii. 移除 Blocking Buffer，並⽴立刻滴上 100 µl 之 Antibody Solution（⾒見表 2-7-2）於玻⽚片組織，於常溫下靜置 1-1.5 ⼩小時後以 PBS buffer 清洗⼀一次。︒｡ iv. 滴約 100 µl 之 Blocking Buffer 於玻⽚片組織上，於常溫下靜置 10 分鐘。︒｡ v. 移除 Blocking Buffer，並⽴立刻滴上 100 µl 之 Conjugate Solution 於玻⽚片組織，於常溫下靜置 30 分鐘後以 PBS Buffer 清洗⼀一次。︒｡. . 51 .

(53) vi. 提前 5 分鐘將⼀一⽚片錠狀 DAB 與⼀一⽚片錠狀 H2O2/Urea 溶於 1 毫升之⾃自來⽔水中。︒｡（⾃自來⽔水中的⾦金屬離⼦子可提升 DAB 的反應速率。︒｡DAB 是強烈致癌物質，使⽤用時須謹慎勿直接接觸。︒｡）滴約 100 µl 於玻⽚片組織，於常溫下靜置 15 分鐘後以 ddH2O 清洗⼀一次。︒｡. 6）對⽐比染⾊色 (Counterstain). 滴約 100 µl 之甲基綠 (Methyl Green Counterstain) 於玻⽚片組織上，於常溫下靜置 3 分鐘後⽴立刻於 100%酒精中迅速的浸⼊入兩次。︒｡更換新的 100%酒精後重複上述步驟⼀一次。︒｡. 7）脫⽔水封⽚片. 將染⾊色完成之玻⽚片依步驟 1 脫蠟⽔水化的相反順序逐漸脫⽔水。︒｡將浸置於 xylene 中的玻⽚片取出滴上數滴封⽚片膠後 (Mounting Medium; Leica Biosystems, Nussloch, Germany) 蓋上蓋玻⽚片。︒｡靜置於抽氣櫃中陰乾，隔⽇日即可觀察與拍攝。︒｡. 2-8、︑､離體⾎血液⾃自由基測定. ⾎血液中⾃自由基的多寡可以反映出⽣生物體內氧化壓⼒力的⾼高低。︒｡本實 . 52 .

(54) 驗. 藉. 由. 兩. 種. 化. 學. 發. 光. 物. 質. 發. 光. 氨. (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, Luminol; Sigma, Missouri, USA). 與光澤精（ 10-Methyl-9-(10-methylacridin-10-ium-9-yl). acridin-10-ium dinitrate, Lucigenin; Sigma, Missouri, USA）測定⾎血液中的⾃自由基。︒｡Luminol 在遇到帶氫⾃自由基如過氧化氫時會被氧化並放出微弱的冷光。︒｡類似地，Lucigenin 在遇到超氧陰離⼦子時也會被氧化發出冷光。︒｡這些微弱的光⼦子訊號在通過光電倍增管（Photomultiplier, PMT; Tohoku Electronic Industry, Miyagi, Tokyo）時會被放⼤大，透過化學冷光測定儀 Electronic Industry,. (CLA-ID3, Chemiluminescence Detector; Tohoku Miyagi, Tokyo) 可以去定量不同⾎血液樣本遇到. Luminol 與 Lucigenin 時的發光強度，進⽽而可以去⽐比較不同樣本間⾃自由基的多寡。︒｡其操作⽅方式如下：. 1）⾎血液組織採樣. 於動物犧牲前 5 分鐘，於頸動脈插管處採⾎血液樣本 1 毫升，並⽴立即進⾏行⾃自由基測定。︒｡. 2）化學冷光測定儀預冷. . 53 .

(55) 化學冷光測定儀運作時光電倍增管時產⽣生的⾼高溫會影響偵測數值且會使機器損壞，因此必須同時以冷卻器降溫。︒｡於偵測前需提早 30 到 60 分鐘運作冷卻器，使光電倍增管於運作時維持在攝⽒氏五度。︒｡. 3）⾃自由基偵測. 於樣本盤中放⼊入磁⽯石轉⼦子使之轉動並注⼊入 200 µl ⾎血液樣本，記錄. i.. ⼀一分鐘基線訊號。︒｡注⼊入 500 µl 之 Luminol 或 Lucigenin，記錄四分鐘後取出樣本盤清. ii.. 洗乾淨。︒｡樣本盤以清⽔水與清潔劑沖洗，再以 ddH2O 沖洗乾淨，最後以拭鏡. iii.. 紙將殘餘⽔水珠吸乾，將樣本盤以鋁箔紙封存避光。︒｡. . 54 .

(56) 第三章研究結果 Results. . 55 .

(57) 3-1、︑､STZ 誘發第⼀一型糖尿病造成體重下降與⾼高⾎血糖及代謝參數. 變化. 為了確定實驗使⽤用之動物是否罹患第⼀一型糖尿病，並且衡量其⽣生理代謝參數的變化，我們在誘發後四周間量測各組⾎血糖、︑､體重、︑､飲⽔水量、︑､排尿量、︑､攝⾷食量與排遺量的變化。︒｡在誘發第⼀一型糖尿病後的四周後，罹患第⼀一型糖尿病之組別所增加的體重百分⽐比（-0.4±19%, N=6）顯著低於其控制組（+37.2±14%, N=6）（p<0.05），同時罹患第⼀一型糖尿病與⾼高⾎血壓之組別（-16.6±3%, N=6）之體重增加百分⽐比亦顯著低於僅罹患⾼高⾎血壓組（+19.9±7%, N=6）（p<0.05）（圖 1）。︒｡誘發四周後罹患第⼀一型糖尿病組之⾎血糖值（439±131 mg/dL, N=6）相較於控制組（81±17 mg/dL, N=6）有顯著提升（p<0.01），同時罹患第⼀一型糖尿病與⾼高⾎血壓之組別⾎血糖值（537±77 mg/dL, N=6）亦顯著⾼高於僅罹患⾼高⾎血壓組（69±12 mg/dL, N=6）（p<0.01）（圖 2）。︒｡罹患第⼀一型糖尿病組別之攝⾷食量（WKY-STZ: 31.6±1.6 g, N=6; SHR-STZ: 29.2±5.4 g, N=6）與排遺量（WKY-STZ: 28.7±7.6 g, N=6;. . 56 .

(58) SHR-STZ: 29.7±14.8 g, N=6 ）皆顯著⾼高於其控制組之攝⾷食量（WKY-CON: 22.6±2.5 g, N=6; SHR-CON: 22.2±5.1 g, N=6）與排遺量（WKY-CON: 14.6±1.4 g, N=6; SHR-CON: 16.5±4.2 g, N=6）（p<0.05）（圖 3）。︒｡罹患第⼀一型糖尿病組別之飲⽔水量（WKY-STZ: 100.7±2.3 ml, N=6; SHR-STZ: 97.5±0.7 ml, N=6）與排尿量（SHR-STZ: 89.0±11.5 ml, N=6; SHR-STZ: 82.5±17.7 ml, N=6）皆顯著⾼高於其控制組之飲⽔水量（WKY-CON: 36.5±6.4 ml, N=6; SHR-CON: 34.7±4.5 ml, N=6）與排尿量（WKY-CON: 16.5±2.12 ml, N=6; SHR-CON: 9.3±1.2 ml, N=6）（p<0.01）（圖 4）。︒｡由結果可知，我們所使⽤用的糖尿病誘發⽅方式可成功的誘發第⼀一型糖尿病，且在四周內之⾎血糖與代謝數值即出現明顯的改變。︒｡. 3-2、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病造成⾎血液⾃自由基增加. ⾼高⾎血壓與糖尿病皆可能造成體內氧化壓⼒力的提升，⽽而不正常的氧化壓⼒力增加除了會直接造成組織的損害，也可能誘發計劃性細胞死亡或發炎造成進⼀一步的損害，進⽽而影響勃起功能。︒｡因此我們測量各組⽼老 . 57 .

(59) ⿏鼠⾎血液中超氧陰離⼦子與帶氫⾃自由基量，以了解不同傷害所造成的氧化壓⼒力變化。︒｡本實驗結果顯⽰示，同時罹患⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病組⾎血液超氧陰離⼦子（CL Count = 5820±259/120 sec, N=6）顯著⾼高於⾼高⾎血壓組（CL Count = 784±452/120 sec, N=6）、︑､第⼀一型糖尿病組（CL Count = 643±192/120 sec, N=6）與控制組（CL Count = 445±160/120 sec, N=6） (圖 5)。︒｡另⼀一⽅方⾯面，第⼀一型糖尿病組（CL Count = 393±158/120 sec, N=6）與⾼高⾎血壓組（CL Count = 741±132/120 sec, N=6）⾎血液中帶氫⾃自由基顯著⾼高於控制組（CL Count = 117±74/120 sec, N=6），且同時罹患⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病組⾎血液中帶氫⾃自由基（ CL Count = 4550±1537/120 sec, N=6）顯著⾼高於各組（圖 6）。︒｡由結果可知，⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病皆為造成實驗動物⾎血液氧化壓⼒力提升的因⼦子，且兩者具有加成作⽤用。︒｡. 3-3、︑､⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病嚴重影響陰莖海綿體勃起內壓. 在成功誘發第⼀一型糖尿病四周後，我們量測各組別⽼老⿏鼠在短暫電 . 58 .

(60) 刺激陰莖海綿體神經時的陰莖海綿體內壓變化（圖 8），並且在進⾏行⼀一氧化氮探針校正（圖 9）後量測海綿體組織⼀一氧化氮含量（圖 10）。︒｡結果顯⽰示罹患第⼀一型糖尿病組（WKY-STZ: 29.78±2.25 mmHg, N=6）與同時罹患⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病組（SHR-STZ: 36.40±1.20 mmHg, N=6 ）其陰莖海綿體勃起時最⼤大海綿體內壓顯著低於控制組（WKY-CON: 43.47±1.09 mmHg, N=6）（p<0.01）（圖 11）。︒｡當將⾎血壓的因素計⼊入後，我們發現在海綿體內壓（圖 12）與平均動脈內壓（圖 13）做⽐比值時，罹患第⼀一型糖尿病組（WKY-STZ: 0.43±0.01, N=6）與罹患⾼高⾎血壓組（SHR-CON: 0.45±0.01, N=6）其⽐比值相較於控制組有降低的趨勢但無顯著差異（WKY-CON: 0.47±0.01, N=6 ）；同時罹患⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病組其⽐比值（ SHR-STZ: 0.37±0.01, N=6）顯著低控制組（p<0.01）、︑､第⼀一型糖尿病組（p<0.05）與⾼高⾎血壓（p<0.05）（圖 14）。︒｡由實驗結果可知，第⼀一型糖尿病與⾼高⾎血壓皆為造成⼤大⿏鼠勃起功能惡化的因⼦子，且同時罹患兩者時對於勃起功能的傷害具有加成作⽤用。︒｡. . 59 .

(61) 3-4、︑､左旋精氨酸與 CCL5 對由⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病所引起之. 勃起失常之治療效果. 經由頸靜脈給予適當劑量的左旋精氨酸（L-Arginine, Sigma, Missouri, USA）（25 mg/kg body weight）之後，控制組（WKY-CON: 0.53±0.04, N=6）與第⼀一型糖尿病組（WKY-STZ: 0.45±0.01, N=6）勃起時陰莖海綿體內壓與平均動脈壓之⽐比值（圖 14）相較於注射前皆有改善的趨勢但無顯著差異；⾼高⾎血壓組（SHR-CON: 0.52±0.01, N=6）及同時罹患⾼高⾎血壓與第⼀一型糖尿病組（SHR-STZ: 0.46±001, N=6）勃起時陰莖海綿體內壓與平均動脈壓之⽐比值相較於注射前皆有顯著改善（ p<0.05 ）。︒｡在給予 eNOS 抑制劑 N- 硝基 -L- 精氨酸甲酯（Nω-Nitro-L-Arginine methyl ester hydrochloride, L-NAME, Sigma, Missouri, USA）（3 mg/kg body weight）後，各組別勃起時陰莖海綿體內壓與平均動脈壓之⽐比值相較於注射前亦皆有顯著的下降（WKY-CON: 0.32±0.01, N=6; WKY-STZ: 0.28±0.02, N=6; SHR-CON: 0.19±0.00, N=6; SHR-STZ: 0.19±0.01, N=6）（p<0.01）。︒｡可知，勃起前適量的給予左旋精氨酸對由⾼高⾎血壓或第⼀一型糖尿病引起之勃起功能 . 60 .