第三節 實驗設計

第參章 研究方法與步驟

第一節 研究程序

本研究程序步驟(如圖 3-1)所示︰

圖3-1 本研究之流程圖 研究主題初探

相關文獻探討

確定研究主題

組訓 前 檢測

組訓 後 檢測

資 料 處 理

分析 與 撰述

結論 與 建議

大專院校啦啦隊

啦啦隊組訓 12 週對 大專女子抗氧化能 力的影響

第二節 研究對象

本研究之對象以參加由教育部主辦，中華民國大專院校體育總會 所承辦之「中華民國大專院校九十二學年度啦啦隊錦標賽」康寧醫護 暨管理專科學校競技啦啦隊校隊運動員 18 名為研究對象，以一般同 齡學生 14 人為對照組。實驗前，每位受試者均發給並填寫「受試者 須知與實驗同意書」(如附錄一)以及「受試者健康狀況調查表」 (如 附錄二)，若發現受試者患有肩部、腰部、下背脊柱受傷疼痛、後腿 肌肉拉傷等骨骼肌肉疾患，或懷孕之女生皆不適合接受此項測驗，則 予删除不參與本實驗。年齡、身高、體重等基本資料(如表 3-1)。

表3-1、受試者基本資料統計表

組 別 年齡(歲) 身高(公分) 體重(公斤)

實驗組(n=18) 18.11±1.84 159.94±6.06 56.99±11.98 對照組(n=14) 18.93±1.21 160.21±5.27 55.29±3.07

第三節 實驗設計

本研究採用康寧醫護暨管理專科學校啦啦隊校隊運動員 18 人為 實驗組，以一般同齡學生14 人為對照組。採重複量數(identical subject repeated measures)之設計。對實驗組施以 12 週(每週三天)之啦啦隊集 訓實驗，集訓前、後(分別於第一週及第十三週)，於安靜狀態下，由 合格護士在彼等肘前靜脈抽血10 ml，經正常處理程序後，送醫學檢 驗所進行抗氧化值包括肌酸激酶(CK) 、乳酸脫氫酶(LDH)、過氧化 物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)之檢測。

於實驗完成後，刪除各組不完整的數據資料，取其正常完整的數據資 料，進行統計分析比較。實驗變項：本研究以參加啦啦隊運動為自變

項(independent variables)，依變項(dependent variables)為集訓前、後採 血之血液生化值。啦啦隊校隊運動的強度，皆以無線心跳紀錄器於整 個實驗期間，各週抽取一天以隨機方式自 18 人中抽取 5(1/4)人，記 錄組訓綜合練習隊形時九十分鐘心跳強度。

第四節 實驗控制

在實驗前一週，發給每一位受試者一份「受試者須知與實驗同意 書」 (如附錄一)，及「受試者健康情況調查表」 (如附錄二)，並向 受試者說明有關本研究的目的、過程及回答有關問題，同時要求受試 者在同意書簽名，表示願意參加本研究實驗，然後再向受試者詳述測 驗程序、方法及相關細節。在正式實驗期間，每次抽血時間之前禁食 8 小時，早上 08：00 請專業護士抽血，抽血針頭均使用拋棄式針頭。

受試者在實驗期間，必須遵守受試者須知之注意事項，此外需特 別注意的事項包括實驗前一週，及實驗中不可熬夜、禁止喝酒及吸 煙、咖啡、茶，保持日常飲食習慣。本研究受試者必須穿戴無線心跳 記錄器(Heart Rate Monitor)，監測其訓練運動強度，以確定全程是否 達到中等強度以上的心肺耐力訓練效果。

第五節 啦啦隊組訓內容

實驗組每週組訓三天，分別於早、中、晚時間訓練，並以晚上啦 啦隊綜合競賽隊形的 90 分鐘練習時段為運動強度監測值，每次訓練 內容(如表 3-2)：

表3-2、受試者接受 12 週組訓的時間與內容 每天訓

練頻率 每天持續時間 訓 練 內 容 總時數

早 上

07：30

~

1. 晨操熱身運動(10 分鐘）

2. 體適能訓練：含心肺耐力的慢 跑、肌力、肌耐力、柔軟度等 訓練(40 分鐘)

3. 意象訓練(10 分鐘)

1 小時

中 午

12：15

~

1. 口號訓練(10 分鐘) 2. 舞蹈訓練(30 分鐘) 3. 複習技巧(10 分鐘) 4. 基本動作(10 分鐘) 5. 檢討溝通(10 分鐘)

1 小時

晚 上

18：00

~

1. 技巧教學 Stunts(Pyramid、

Basket Toss)(30 分鐘)

2. 跳躍教學 Jump(T 形跳躍、高 踢、Toe-touch 等動作訓練)(30 分鐘)

3. 翻滾教學(側翻、側翻 1/4 內 轉、後手翻、後空翻等動作訓 練(30 分鐘)

4. 綜合競賽隊形練習(90 分鐘運 動強度的監測時段)

3 小時

第六節 檢測指標

實驗過程的抗氧化物檢測指標，是將啦啦隊員組訓前、後的血液 取得後，立即逕送台北市聯合醫事檢驗所進行分析，並依下列的儀器 設備、試劑等標準程序步驟進行分析，所得結果及標準範圍值符合研 究的信、效度。

一、肌酸激酶(CK)的測定

(一) 測定儀器：

以美國製貝克曼廠SYNCHRON CX-7 DELTA 全自動血液 分析儀進行測定，儀器系統及原廠試劑為 Dedicated Reagent(試 劑如化學反應方程式所述)。

(二) 測定意義：

肌酸激酶與其同功酶的測量是用來診斷和治療心肌梗塞 以及肌肉相關的疾病，例如進行性肌失養症(Duchenne)，是指 肌肉營養失調。

(三) 測定方法：

肌酸激酶試劑測量肌酸激酶活性的方法，是酵素速率法 (Enzymatic rate method)。在反應中，肌酸激酶催化磷酸群從肌 酸激酶基質轉移到 ADP。接下來 ATP 的產生是經由己糖激酶 (Hexokinase)與葡萄糖-6-磷酸去氫酶(G6PDH)催化而產生還原 的NADH，進而測量出來的。肌酸激酶分析包含活化劑單硫代 甘油(monothioglycerol)。檢體與試劑的比例是 1：20。機器會 自動偵測340 nm 吸光度的改變，吸光度的改變直接與肌酸激 酶的活性成正比。

(四) 化學反應方程式：

二、乳酸去氫酶(LDH)的測定

(一) 測定儀器：

以美國製貝克曼廠SYNCHRON CX-7 DELTA 全自動血液 分析儀進行測定，儀器系統及原廠試劑為 Dedicated Reagent(試 劑如化學反應方程式所述)。

(二) 測定意義：

乳酸去氫酶的測量是用來診斷與治療肝疾病，例如急性病 毒性肝炎，肝硬化及轉移性肝癌，心臟疾病(例如心肌梗塞)，

肺臟或腎臟的腫瘤等。

(三) 測定方法：

乳酸去氫酶試劑用來測定其活性的原理是藉由酵素速率 法。在此反應中，乳酸去氫酶會催化丙酮酸(Pyruvate)成 L-乳 酸。此反應是可逆反應。在催化的同時，還原的 β-nicotinamide adenine dinucleotide hydrogenase (NADH)會氧化成菸草醯胺 (β-nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)。檢體與試劑的比 例是 1：20。機器會自動偵測 340 nm 吸光度的改變，吸光度 的改變直接與乳酸去氫酶的活性成正比。

(四) 化學反應方程式：

+ +

+  → − + +

+

−

−

+

−

−

→

 +

+

→

 +

H NAD conate

Phosphoglu NAD

Phosphate e

Glu

ADP Phosphate e

Glu e

glu ATP

ATP Creatine ADP

osphate CreatinePh

PDH G HK

CK

6 6

cos

6 cos cos

6

+ +

← + →

−

Lactate NADH Pyruvate NAD

L

三、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的測定

(一) 測定儀器：

儀器系統以日本製HITACHI 廠 7070 分析儀進行測定，試 劑為美國製 RANDOX 廠 RANSEL 的試藥組。

(二) 測定意義：

谷胱甘肽過氧化物酶是機體細胞(尤其是紅血球)一個重 要的對抗氧化劑作用的防禦體系，它在細胞內能消除有害的氧 化代謝產物，阻斷脂質過氧化連鎖反應，從而保護細胞膜結構 和功能完整，缺乏時可致新生兒黃疸。

(三) 測定方法：

測定方法1

試 劑 劑 量

麩胺基硫(Glutathione) 4 mmol/l 麩胺基硫的還原酵素

(Glutathione Reductase) ≧0.5 U/l 菸草醯胺、磷酸鹽、腺嘌呤及氫

(Nicotinamide Phosphate Adenine hydrogenase，NADPH)

0.34 mmol/l

附註：試劑需先前處理，將試劑與緩衝液2 以等量體積混合，

在4℃可放兩天，而室溫下可放 8 小時。

測定方法2

緩 衝 劑 劑 量 酸鹼緩衝液(Phosphate Buffer)，pH 7.2 0.05 mol/l 附註：儲存於4℃。

測定方法3

呈色(Cumene)試劑 劑 量 氧化劑(Cumene Hydroperoxide) 0.18 mmol/l

附註：使用時須與等量的二次蒸餾水混合完全並激烈震盪，

此溶液不易溶解完全。每次使用時均需當場配置。原 溶液需保存於4℃。

測定方法4 稀釋液：

一瓶 4 號的稀釋原液與 200 毫升的二次蒸餾水混合均 勻，可保存於 4 ℃達一個月。

測血色素的一種試劑(Drabkin)：

一瓶 Drabkin 試劑加入 480 毫升二次蒸餾水，儲存時需 避光，在 4℃時可保存 6 個月。

(四) 實驗步驟：

1. 抽血時需以內含肝燐脂抗(heparin)凝血劑的綠頭管抽血。

2. 取 0.05 毫升的血液，加入 1 毫升的已配置好的稀釋液，

並靜置5 分鐘。

3. 加入 1 毫升已配置好的試劑，混合完全後 20 分鐘開始分 析。

4. 將比色機(spectrophotometer)的波長設定於 340 nm，石英 管取1 公分長的為主。

5. 將待測物(血液檢體)取 0.05 毫升，加入試劑 2.5 毫升及加 入0.1 毫升呈色試劑於石英管中混合均勻。

6. 一分鐘後讀取第一次的吸光值，開始計時並讀取第二分鐘 及第三分鐘的吸光值。

7. 空白試驗，將步驟 5 中的待測物以 0.05 毫升水取代之即 可。

8. 計算公式：

U/I of 溶血液(Haemolysate) = 8412 *ΔA 340 波長/分鐘 附註：Δ 代表兩個數據相扣。A 代表吸光度。

9. 參考範圍：除以血色素= 27.5-73.6 U/g Hb

(一) 測定儀器：

儀器系統以日本製HITACHI 廠 7070 分析儀進行測定，試 劑為美國製 RANDOX 廠 RANSEL 的試藥組。

(二) 測定意義：

在需氧生物中普遍存在的一種酶。它能催化超氧物陰離子 自由基歧化反應而成為基態的氧分子和過氧化氫。SOD 屬於 金屬酶，其性質不僅取決於蛋白質部分，而且還取決於結合到 活性部位的金屬離子。

(三) 測定方法：

測定方法1 (試劑的製備)

混合的受質 劑 量

超氧化酵素(Xanthine) 0.05 mmol/l

I. N. T. 0.025 mmol/l 附註：一瓶加入20 毫升的 CAPS 緩衝液，存於 4℃，可使用

10 天。

測定方法2

緩 衝 液 劑 量 CAPS，pH 10.2 40 mmol

保存劑(EDTA) 0.94 mmol/l

附註：存於4℃。

測定方法3

緩 衝 液 劑 量

黃鹼氧化酶(Xanthine Oxidase)溶液 80 U/l 附註：一瓶加入 10 毫升的二次蒸餾水，存於 4℃，可使用

14 天。

測定方法4

稀 釋 液 劑 量 酸鹼緩衝液(Phosphate Buffer)，pH 7 0.01 mmol/l (四) 標準溶液的製備：

1. 將一瓶標準液加入 10 毫升的二次蒸餾水。

2. 以逐步稀釋方式稀釋標準液，並畫出標準曲線，稀釋如下 表。

3. 所有稀釋過的標準液，均儲存於 4℃，可使用 14 天。

4. 磷(S1)是為稀釋液。

標準液的體積 稀釋液的體積 最後濃度

S6 未稀釋的標準液 5

S5 5 毫升的 S6 5 毫升 2.5 S4 5 毫升的 S5 5 毫升 1.25 S3 5 毫升的 S4 5 毫升 0.625 S2 3 毫升的 S3 6 毫升 0.208 附註：S 是代表標準物質(Standard)

(五) 實驗步驟：

1. 抽血時需以內含肝燐脂(heparin)抗凝血劑的綠頭管抽血。

2. 取 0.5 毫升全血以 3000 轉離心 10 分鐘後，倒除血漿。

3. 洗滌血球四次，每次以 0.9%鹽(NaCl) 3 毫升洗，並每次 以 3000 轉離心 10 分鐘後去除上清液。

4. 紅血球加入 2 毫升的冷二次蒸餾水，混合均勻後置 4 15℃ 分鐘。

5. 將檢體混合液以稀釋液稀釋 25 倍。

6. 將比色機的波長設定於 505 波長(nm)，石英管取 1 公分 長的為主。

7. 分別將 S1~S6 標準液取 0.05 毫升，加入混合的受質 1.7 毫升混合均勻後，加入 0.25 毫升的黃鹼氧化酶(Xanthine Oxidase)溶液於石英管中並混合均勻。

8. 也分別將待測物(稀釋過的血液檢體)取 0.05 毫升，加入 混合的受質 1.7 毫升混合均勻後，加入 0.25 毫升的黃鹼 氧化酶溶液於石英管中並混合均勻。

9. 30 秒後讀取第一次的吸光值，開始計時並讀取第三分鐘 的吸光值。

10. 計算濃度。

五、丙二醛(MDA)的測定

(一) 測定儀器：

儀 器 系 統 以 日 本 製 SHIMAPZU 廠 CL-770 比 色 機 (SPECTROPHOTOMETER)進行測定，利用呈色法讀取吸光 值。

(二) 測定意義：

MDA 是體內含量最多的脂質過氧化物，係源自細胞膜遭 破壞時，心血管方面的疾病及DNA 遭破壞的遺跡，為一重要 之氧化性傷害的指標。

(三) 測定方法:

1. 採血前不需空腹，無收集時間限制。

2. 全血及抗凝固劑量為 2.0 mL。

3. 避免使用溶血和混濁的檢體。

(四) 控制狀態：

1. 離心血液(3000 轉、五分鐘)將血漿分出。

2. 檢體若 48 小時內未檢驗分析，需-70 ℃冰凍保存，可存 放一個月；經冷凍的血清，使用前需混合均勻再離心檢 驗。

(五) 實驗設備與材料：

1. 高速離心機( High Speed Centrifuge)。

2. 水浴(Water bath)100 ℃。

3. 血液振動儀(Vortex mixer)。

4. 玻璃試管(Glass test tubes)。

5. 2ml 含蓋子的塑膠試管(Eppendorf tubes)。

6. 巴比士酸(Thiobarbituric acid，TBA，120 mM)。

7. 20 %三氯醋酸(Trichloroacetic Acid，TCA 在 0.6 mol/L 鹽酸)。

8. 乙醇(Ethanol)。

9. 蒸餾水(Distilled water)。

(六) 試劑的製作方法：

1. 巴比士酸(Thiobarbituric acid ，TBA，120 mM)：1.729 g TBA /100 mL 蒸餾水。

2. 20%三氯醋酸(TCA 在 0.6 mol/L 鹽酸)：20 g TCA / 95 mL 蒸餾水+5 mL 12 鹽酸。

3. 標準物質：1,1,3,3-試劑(Tetraethoxypropane)、型號 T9889，廠牌為 Sigma。

吸釋10 uL 試劑+ 4 mL 乙醇(1000 uM) → 10 uL + 5 mL

蒸餾水(20 uM)。

4. 品管物質：可以收集2 個組別(正常人及洗腎病人)血清或 血漿各 30-50ml 混合均勻，離心 5000 轉 10 分鐘，分裝 750ul 到 2ml 含蓋子的塑膠試管，保存-85℃。

5. 參數表現：每 20 支檢體為一批，前面 1 組標準物質，20 支前後必須帶 1 組品管(正常人及洗腎病人)，各一支 0.5 及1.0uM 標準物質。

6. 儲存時間：試劑，儲存於室溫 3 個月。品管物質，儲存 於室溫-70 3℃ 個月。

(七) 校正標準物質：

1. 使用自己配製的標準物質，現泡，每一次泡 2 組。從 20 uM 配製不同濃度 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 uM(用蒸餾水 稀釋)。

2. 校對過程：每一批樣本必須用自配的標準物質及品管物 質的數據去校正樣本的結果。

3. 品管物質：正常組及洗腎組，以品管物質的結果比較。

(八) 測試過程：

1. 將啦啦隊員血漿檢體，品管物值從-70℃移到 4℃解凍。

2. 準備 2 ml 含蓋子的塑膠試管，編上號碼，加入下列：

標準物質 病人血漿

樣 本 750 uL ( 0.75 mL) 750 uL ( 0.75 mL) 20%試劑 750 uL ( 0.75 mL) 750 uL ( 0.75 mL) 3. 因當加入 20%試劑(TCA)，血漿檢體很快凝固所以必須注

意一次只能加4 支而馬上混合均勻。

4. 去蛋白(Deproteinizing)步驟：

(1) 保溫 4 20 ℃ 分鐘。

(2) 離心 11000 轉/15 分鐘。

(3) 準備新玻璃試管。

(4) 取 1 ml 離好的上清液到編好號碼的玻璃試管。

(5) 各加 200 ul 巴比士酸，混合均勻。

(6) 放進水浴 100℃，30 分鐘。

(7) 冷卻後，15 –30 分鐘內比色，535 及 580 波長。

5. 計算方式：樣本結果(uM)

啦啦隊員的樣本(535 – 580 波長)吸光度

= 標準物質1.0 uM(535 – 580 波長)吸光度 × 1.0

(九) 結果報告：

1. MDA 範圍值 0.39 ± 0.15 uM。

2. 結果異常的處理：

(1) 特別高或低必須重作。

(2) 試劑容易產生結晶，可泡在熱水協助溶解結晶。

3. MDA 濃度結果單位：uM 至小數第二位。

第七節 資料處理

(一) 所有數據皆以IBM/PC 與 SPSS 10.0 版統計套裝軟體處理，結 果採用M±SD 表示。

(二) 各指標在組訓前、後各組的組內差異以相依樣本 t-test 分析。

(三) 顯著水準定為百分之五 (α= 0.05)。