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嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

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Academic year: 2021

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嘉南藥理科技大學專題研究計畫成果報告

計畫編號:CN9747

計畫名稱:子計畫(一):中草藥資源開發應用-抗氧化活性篩選

執行期間:97 年 01 月 01 日至 97 年 12 月 31 日

■整合型計畫 □個別型計畫

計畫總主持人:楊朝成 計畫主持人:

子計畫主持人:林清宮

中華民國98 年 02 月 27 日

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一、摘要

隨著現代化產業的加快和生活環境的諸多污染,使得許多 疾病叢生,再加上高齡化社會中慢性疾病的問題亦日漸嚴重,

因此,如何加強預防與人體有關的生理病變,已逐漸成為世界 先進國家及人民所共同關注之主題。其中,抗氧化更是近年來 醫藥界的研究主流之一。所謂抗氧化,通常是指能捕捉活性氧 (Reactive oxygen species,ROS)以避免活性氧所造成的鏈鎖反應 (Chain reaction)。事實上,抗氧化物質普遍存在植物體內,因此,

有關中草藥資源在抗老化、抗氧化以及癌症化學預防(Cancer chemoprevention)等方面之研究十分熱門。

要消除與疾病相關的氧化壓迫,可從膳食中攝取豐富的蔬 菜與水果,以確保身體中有充分的抗氧化營養素。近年來,許 多的研究亦嘗試由天然來源以尋求安全且具有強抗氧化效力之 抗氧化劑,其中以多酚及類黃酮為被研究最多之抗氧化物質,

此類物質廣泛存在於各種蔬菜、水果、種子、茶、紅酒或香辛 料中,其可作為一抗氧化劑,有效終止自由基鏈鎖反應。因此 從植物中尋求具有強抗氧化性的天然抗氧化物質進而達到生物 體保健之目的,已成為重要的研究課題。

本計畫結合藥理學院14位對中草藥資源開發應用有興趣 專業師資,擬由21種中草藥資源中篩選出具有抗氧化活性之物

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質,方法是以DPPH• (1, 1 - diphenyl-2-picryl-hydrazyl free radical) 及 ABTS•+ [2-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline -6-sulfonic acid) radical] 總抗氧化活性作為評估依據。中草藥包括三大來源,有 植物、動物及礦物,其所含之化學成分相當複雜,因此在進行 中草藥萃取前,對所用之材料的基源、產地、藥用部位、採集 時間與方法等進行考查,計畫所得成果可供有興趣教師繼續探 討中草藥資源在醫藥、食品及化粧品之應用與開發。

二、研究動機與研究問題

近年來「抗氧化」相關的「研究與應用」快速的發展,不 論在醫藥、食品、化粧品等與健康相關的產業中,我們可以發 現各式各樣與抗氧化相關的概念與產品。有許多研究已證實「抗 氧化與抗自由基」在美白與抗老化的功能上有顯著的正面效 益,因此市面上不斷有許多抗氧化與抗自由基的新成份被推 出,但是其「抗氧化功效」,仍待進一步確認。

人體在進行代謝情況下,而產生了自由基,這些自由基會 來攻擊我們的細胞,導致蛋白質、細胞膜以及DNA發生變異,

隨著這些損害的累積,組織和器官也在不斷退化,這也正是衰 老的象徵。另外,氧化DNA還會導致細胞的癌變,造成某些慢 性疾病的發生和退化性疾病的病因,包括心血管疾病。

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研究顯示,抗氧化劑能有效清除體內過量自由基的物質,

它能阻止氧化的發生,修復和防止氧化DNA損害,進而可以增 強免疫系統功能和延緩衰老。而目前常見的抗氧化劑有:維他 命C 、 維 他 命 E 、 β- 胡 蘿 蔔 素 、 類 黃 酮 (flavonoid) 、 多 酚 類 (polyphenol)和人體內自行製造的抗氧化酶等,這些抗氧化物質 可以防止自由基的損害。

於生物體正常之有氧代謝過程中會自然形成許多活性氧物 質(reactive oxygen species) , 活 性 氧 物 質 包 括 超 氧 陰 離 子 (superoxide anion radical,.O2-)、過氧化氫(hydrogen peroxide,

H2O2)、氫氧自由基(hydroxyl radical,.OH)、單重態氧(single oxygen,1O2)等,其來源可分為內在和外在兩方面,內在來源包 括粒腺體電子傳遞鏈、氧化反應、噬菌體細胞和自我氧化反應 等;另外生物體亦可經由傳染、離子幅射、空氣污染、抽煙與 毒物之入侵產生活性氧物質;截至目前為止,包含內在及外在 產生活性氧物質之路徑,有部分之機轉仍未完全明瞭。這些具 未成對電子的自由基化性相當活潑,可和體內許多重要分子如 核酸、蛋白質、或生物膜上之多元性不飽和脂肪酸反應,導致 生物體氧化性傷害,主要之反應為自由基除易引發細胞膜上之 不飽和脂肪酸進行脂質過氧化反應外並會與膜上酵素或接受體

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行共價結合,導致細胞膜完整性破壞,改變其結構功能及通透 性;另外自由基亦可和細胞內之蛋白質行交錯連結反應致使蛋 白質變性或結構改變,導致生物體內催化生化代謝反應進行所 需之酵素活性喪失,進而使細胞內之正常功能無法進行;而自 由基亦會攻擊DNA 分子,破壞其鹼基結構使其功能改變,造成 基因突變及毒性之產生;除此之外,脂質過氧化產物再經分子 內的環化、裂解等步驟所產生的丙二醛 (malondialdehyde,

MDA),亦具相當活性會和體內之脂質、蛋白質、核酸等分子行 交錯連結反應。近年來許多證據顯示自由基之堆積與破壞是造 成老化或與老化相關的退行性疾病如癌症、心血管疾病、白內 障、關節炎及巴金森氏症等疾病發生的重要因素,因此為了有 效的防制疾病的發生與發展,生物體必須抑制或清除這些活性 氧物質,於正常情況下,生物體中具有抗氧化之防禦系統,這 個系統由兩大部分組成,即抗氧化酵素及非酵素性之抗氧化物 質以交互協同之作用來移除活性氧與自由基,共同保護生物體 免受到活性氧物質之氧化性傷害。

酵 素 性 抗 氧 化 防 禦 系 統 主 要 含 有 superoxide dismutase(SOD)、catalase 與 Se-dependent glutathione peroxidase (GSH-Px)等,SOD 會促使超氧陰離子轉化成過氧化氫,以消除

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超氧陰離子;而過氧化氫會再經由 catalase 或 GSH-Px 還原成水 和氧;另外GSH-Px 亦會還原脂質過氧化物成為無毒害產物。

非酵素性之抗氧化系統主要包括維生素 E(tocopherol)、維生 素C(ascorbic acid)、麩胱甘胺酸(glutathione, GSH)、β-胡蘿蔔素 (β-carotene)及有機硒等。維生素 E 存在於生物膜及脂蛋白中是 一種重要的脂溶性抗氧化劑,可直接與自由基反應以有效阻止 自由基對生物膜及脂蛋白上多元不飽和脂肪酸進行脂質過氧化 鏈鎖反應,減少氧化緊迫(oxidative stress)之產生,進而降低 對生物體之傷害。維生素 C 為細胞內外液主要之水溶性抗氧化 劑,除可直接消除自由基進而有效終止自由基引發之鏈鎖反應 外,亦可將維生素 E 還原,然而維生素 C 的活性還原可以經由 GSH 加以再生,由此可知,抗氧化物質可以相輔相成的提供抗

氧化保護作用。麩胱甘胺酸為細胞內液主要之抗氧化劑,不僅 可經由 GSH peroxidase 之酵素性反應以還原脂質過氧化物或 H2O2 而間接抑制自由基之鏈鎖反應,亦可與自由基反應,使細 胞免受到自由基之傷害,另外GSH 在體內尚具有許多重要之生 理、生化功能。β-胡蘿蔔素為自然界廣泛存在之脂溶性色素,其 為維生素 A 的前趨物,在體內它可以消除單重態氧的毒性及作 為自由基的清除劑,特別是可以消除白血球(如吞噬細胞)所

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產生的過多自由基。有機硒有很強的抗氧化作用,硒為 GSH peroxidase 中之重要成分且參與 coenzyme Q 的合成,coenzyme Q 是另一個可以作為阻斷自由基鏈鎖反應的抗氧化物。

綜合上述,生物體內此等抗氧化防禦系統之物質或酵素彼此 具有交互協同之作用。事實上,適量的活性氧物質是維持生命 所必需的,如白血球活化時可產生超氧陰離子與過氧化氫等活 性氧物質,此活性氧物質對於白血球在殺滅細菌上扮演相當重 要的角色,而活性氧物質是否會對人體造成傷害,主要決定於 體內產生的活性氧物質與體內抗氧化防禦系統之間是否可以達 到平衡的狀況,然而此種平衡會因疾病、營養不良或隨著年齡 的增長而受到破壞,一旦失去平衡,即會形成氧化緊迫,劇烈 的氧化壓迫仍會造成細胞傷害或死亡,進而導致許多疾病的形 成,如前所述,此類疾病包括相關的退化性疾病如:癌症、心 血管疾病、巴金森氏症、白內障等,另外在促進老化上亦為一 重要因素。

三、文獻回顧與探討

天然藥物一直是人類獲得藥物的主要途徑,根據美國

「Annual Reports of Medicinal Chemistry」報導,1989~1995年 食品及藥品管理局(FDA)批准臨床觀察的299種抗癌新藥中,61

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%來自於天然物,顯示植化物(Phytocompound)或植物二次代謝 物在醫療保健之重要性。

多酚類(polyphenol)植物體成分中,以纖維素的含量最多,

其次是半纖維素、木質素,多酚類則是含量第四多成份,在陸 地上的植物幾乎含有多酚類。多酚類是植物體內所含有的數種 羥基的總稱,這種成分關係著植物的演化,目前也是植物分類 的重要指標之一。多酚類在植物體內的功能是防禦紫外線、抑 制植物體過氧化作用。單寧是最早被知道的多酚類,其能夠使 蛋白質及重金屬沉澱(Lai, 1999)。

USDA 於 2007 年 11 月公佈 Oxygen Radical Absorbance Capacity(ORAC)of Selected Foods-2007,包括了 277 種經

選擇具有抗氧化能力的食品。眾所周知許多慢性與退化性疾病 如癌症、心臟病、神經元退化疾病如阿茲海默症(Alzheimer)

及帕金森氏症(Parkinson)等均被認為是因為過氧化物質或含 自由基物質在人體體內引起的一連串反應,造成身體組成物質 如蛋白質、脂質及 DNA 受到傷害,這也是引起老化的主因。

攝食蔬菜、水果與堅果類食品可獲取抗氧化所需之礦物質及維 生素,如硒(Selenium)、維生素 C、E 與 β 胡蘿蔔素等,是抗 氧化物的極佳來源。

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在食物中含有許多抗氧化物質,傳統的抗氧化物質包括了 維生素C、維生素 E、β 胡蘿蔔素及硒元素;其他還有聚苯酚、

類黃酮素、原花青素及蕃茄紅素。其中以原花青素(Oligomeric proanthocyanidins,OPC 屬多酚類,為水溶性、高生體利用率 之生物黃酮素)最受專家重視,因為它的小分子結構能夠通透 血腦障壁,提供及加強腦內抗氧化的功能。同時它的抗氧化力 比維生素C 強 20 倍,比維生素 E 強 50 倍。

除此之外原花青素也是血管的守護神,保護血管彈性、阻 止LDL 膽固醇囤積在血管壁上及減少血小板凝集。對於皮膚,

原花青素可保護肌膚免於紫外線的荼毒、預防膠原纖維及彈性 纖維的退化,使肌膚保持應有的彈性及張力,避免皮膚下垂及 皺紋產生。在免疫系統上,原花青素具有毒殺乳癌、肺癌及胃 癌細胞的功能,對於胃黏膜細胞有促進生長效果。原花青素可 有效的紓解關節發炎現象,同時它也具有抗過敏的作用。

原花青素存在於某些植物、蔬菜、水果的皮、莖、葉、種 子中。葡萄籽、藍莓、小紅莓、松樹皮及夏威夷果葉子,都含 有原花青素的成份。其中以葡萄籽所含的原花青素比率獨佔鰲 頭。而在葡萄籽當中還含有許多強力之抗氧化物質,如兒茶酸、

咖啡酸、表兒茶酸、肉桂酸、延胡索酸與香草酸等各種天然有

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機酸,不但共同組成強力之抗氧化家族,也能夠幫助 OPC 的

吸收,同時這些物質都屬於水溶性的,攝取過多時會如同水溶 性維生素一樣,由尿液排出體外。

OPC 能幫助維生素 C、E 的吸收作用,也能抑制有害性酵 素的活動,有保護膠原蛋白(Collagen) 及彈性蛋白 (Elastin) 功 效,防止皮膚皺紋提早出現,減少紫外線對皮膚之傷害;它也 可以增加夜視力,保護眼睛,降低因糖尿病造成的視網膜病變 之可能性;另外它還有調節控制神經傳導物質的酵素,改善精 液結構而增加生育力,改善女性經前症候群之不適,阻礙黑色 素形成;另外也有實驗顯示 OPC 對於雄性禿頭之症狀有改善 之效果。

四、研究方法與步驟

※中草藥之萃取:

自順天堂藥廠取得所需中草藥(經過基源鑑定),將中草藥磨 成粉,用乙醇或乙醇/水萃取,經減壓濃縮後之萃取物,以冷凍乾 燥方式製備,分別稱重備用。

對於已被使用或未經過使用但有應用潛力之中草藥,在前 項萃取處理後,利用已建立抗氧化功效篩選與評估平台,進行 抗氧化有效性評估測試,確認中草藥資源之抗氧化能力。以下

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為本計畫擬篩選抗氧化之中草藥名稱、藥理作用及相關文獻:

※有效性評估:

各種中草藥,在前項萃取處理後,利用已建立抗氧化功效篩 選與評估平台,進行 in vitro 評估測試。

1、捕捉 DPPH 自由基能力測試:

DPPH 溶於乙醇中呈藍紫色,本身是一種穩定的自由基,此 實驗系統廣泛運用在抗氧化能力的測定,常使用 DPPH 來評估 抗氧化物的供氫能力。當加入的樣品,若可以和 DPPH 自由基 直接反應,則會阻止 DPPH 自由基進行連鎖反應,溶液顏色會 轉成黃色,即表示加入的樣品具有捕捉 DPPH 自由基的能力,

而呈現的顏色愈淡,則表示捕捉DPPH 自由基的能力愈佳。將樣 品先稀釋成各種不同濃度,利用分光光度劑 (ELISA reader) 測其 OD 540 nm 之吸光值,並與空白對照組的吸光值作比較,求出抑 制百分比,作圖畫線計算出 IC 50,即可判斷出樣品捕捉自由基 能力的強弱。

捕 捉 DPPH 自 由 基 能 力 (% ) = [1- A540 nm, sample/A540nm, blank)]×100

2、TEAC 總抗氧化能力測試:

此實驗系統是以ABTS 經過氧化氫與過氧化酶產生作用,產 生ABTS. + 陽離子自由基,待呈現穩定藍綠色,加入的待樣品,

若有清除 ABTS. + 陽離子自由基的能力,則顏色會變淺吸光值會 降低,以評估總抗氧化能力,並使用 trolox 為正標準品,作標 準曲線當對照,因此一般稱此實驗系統為 TEAC。總抗氧化能力

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的表示方式,可以用上述方式表示,或是以抗氧化力的方式呈 現,本研究的表示方式是用抗氧化力方式表示。先將樣品稀釋成 各種不同濃度,利用分光光度計,測其在 OD 734 nm 之吸光值,

比較空白對照組之吸光值,計算抑制百分比,作圖畫線求出 IC 50 值,即可比較出樣品清除總自由基能力的強弱。

總抗氧化能力(%) = [1-(A734 nm, sample / A734 nm, blank)]×100

五、結果

篩選植物 桑樹皮(Mulberry) 銀杏(Ginkgo biloba)

名 白果

植物基本 介紹

桑樹皮:桑樹有許多種,有喬木也有灌木,有「華桑」、

「白桑」、「雞桑」等多個品種。桑樹原產亞洲西部、中 國、日本,是養蠶業的重要飼料,很早就在中國培育,

果實稱為桑椹,初生白色,成熟後成為紫黑色。根皮(桑 白皮)、桑椹、桑葉都可以作為中藥使用。此外桑椹可以 釀酒,樹皮可以造紙,造出的紙稱為「桑皮紙」。桑白皮 含樺木酸(betulinic acid)及四種新的黃酮類衍生物及 α-及 β-香樹精、揮發油、軟脂酸、谷甾醇、葡萄糖、果膠、

多縮戊糖、十一葵烯醇(undecaprenol)及十二葵烯醇 (dodecaprenol)。藥理:利尿、、降血壓、鎮靜、安定、

抗驚厥。

銀杏:銀杏(Ginkgo biloba),又名白果,和它相親的植物

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在兩億七千年前就已經生成,屬於銀杏門。有人將銀杏 稱為「活化石」和「孑遺植物」。銀杏為裸子植物,只有 種子的構造,尚未演化出被子植物的果實,但銀杏種子 的種皮發達,粗看起來與被子植物的果實沒有什麼不 同。據《本草綱目》記載:「白果小苦微甘,性溫有小毒,

多食令人腹脹」。「熟食溫肺、益氣、定喘嗽、縮小便,

止白濁,生食降痰,消毒殺蟲,嚼漿塗鼻面手足,去鼻 疽皰黑干黯皴皺及疥癬疳蟲陰虱」。直到近代才有西方學 者研究銀杏的藥用價值,銀杏葉子裡包含黃酮類化合 物,可以入藥。

抗氧化篩 選結果

桑樹皮:抗氧化能力 65.8mg ± 8%/100ml(萃取液)

銀杏:抗氧化能力 13.6mg ± 6.3% /100ml(萃取液)

附註:1.上述結果是利用捕捉 DPPH 自由基能力測定法測 定。

2.抗氧化能力表示方式是利用不同濃度的標準參

考物為gallic acid,分別測出捕捉 DPPH 自由基 能力後製成檢量線(Calibration curve),然後測出 萃取液的捕捉DPPH 自由基能力,代入檢量線方

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程式計算出100ml 植物萃取液相當於 X mg gallic acid 的捕捉 DPPH 自由基能力。

參考文獻

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cancer development. Recent Research Developments in

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Cancer (2001), 3(Pt. 2), 491-523.

篩選植物 橄欖(olive) 學 名

Olea Europaea

植物基 本介紹

橄欖:最近陸陸續續有許多研究發表橄欖萃取物對健康

有多方面的好處,除了是很好的抗氧化劑來源外,對骨 骼健康也有幫助。橄欖葉中還有一種稱為 Oleuropein 的 苦味成份,此成份可使樹長得比較強壯,還能抵抗昆蟲 咬和細菌的侵害,經科學家研究Oleuropein 對於骨骼健 康應也有幫助。橄欖含大量的多酚化合物,如水合酪氨 酸(Hydroxytyrosol)及酪醇(Tyrosol),在預防心血管

疾病、抗氧化及抗發炎反應都很有正面助益。橄欖萃取 物(oleuropein)能降低血脂質過氧化物等不好物質的產 生,這些不好的物質會造成血管的不通暢而影響血量的 流通,若是組織長期缺血會導致氧化壓力的增加,進而 引發疾病的產生。多攝取這類天然抗氧化物對健康應都 是有多方面益處的。橄欖含大量的多酚複合物,對於預 防心血管疾病、抗氧化及抗炎反應都有幫助。

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抗氧化篩 選結果

本實驗取市售不同品牌之橄欖萃取液進行抗氧化能力測 定,結果如下:

橄欖萃取液1:抗氧化能力 426.2mg(gallic acid)/100ml(萃 取液)

橄欖萃取液2:抗氧化能力 106.2mg(gallic acid)/100ml(萃 取液)

附註:1.上述結果是利用捕捉 DPPH 自由基能力測定法測 定。

2.抗氧化能力表示方式是利用不同濃度的標準參

考物為gallic acid,分別測出捕捉 DPPH 自由基 能力後製成檢量線(Calibration curve),然後測出 萃取液的捕捉DPPH 自由基能力,代入檢量線方 程式計算出100ml 植物萃取液相當於 X mg gallic acid 的捕捉 DPPH 自由基能力。

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A. 對於產業界、國家發展及其他應用方面預期之貢獻:

1. 在學術研究方面:了解中草藥抗氧化基本活性作用之訊 息,提供中草藥科學化依據與學術應用價值。

2. 在其他應用方面,從分出之部分或成分之活性篩選可以了 解此中草藥之抗氧化作用,藉以開發新化粧品或其他產 品,確立漢中草藥之抗氧化活性成份,並期望進一步開發 成為新的化粧品經濟作物,以提高中草藥之經濟效益,進 而增加中草藥之應用性,開發應用資源。

3. 對於參與之工作人員,預期可獲之訓練。參與人員可從研 究中學到分離技術,以及對所分離之化合物所進行的生物

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活性篩選有進一步之訓練。了解化學與生物活性之相互配 合之重要性,並進一步了解化粧品製造的流程。訓練其遇 到困難時如何著手思考和尋求解決的方法。計畫在各類專 業教師團隊與研究所學生人力的投入,配合現有之生物技 術中心、中草藥開發應用中心、民生保健發展暨健康促進 中心、化粧品檢驗中心支援,相互搭配合作,彼此間相互 交流與討論,將中草藥進行完整的應用探討。

B. 中草藥資訊服務中心

1. 本計畫兼具實務與學術特色,具體收集各類中草藥資訊,提 供實務與學術研究所需資源,建立具有豐富性、實用性、快 速性、可靠性與服務性的網路搜尋資料平台,期許成為令人 肯定並且卓越的一流資訊服務中心。

2. 廣泛且具體收集中草藥資訊、研究文獻與實際使用之中草藥 有效成分之研究。

3. 建立台灣中草藥科技資訊網站,建置各國法規與相關科學文 獻資料庫。

C.推廣中草藥資源之應用價值:

1. 推廣傳統中草藥添加於化粧品或其他產品,促進相關產業 (例如中藥廠、化粧品產業)之多元發展與互動。

2. 推廣傳統中草藥與生活文化間多樣性利用之應用。

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六、結論:

中草藥應用在護膚、美容上流傳已久,古代人已將天然動植物應 用於化粧上:如用鳳仙花染指甲、指甲花染髮、無患子洗髮、動物油 脂護膚;後來隨著科技的進步,更能由天然物中取得有效成分,且將中 草藥應用於化粧品符合當今世界化粧品發展的潮流,加上國人有許多 人對於中草藥研發具有豐富經驗,因此有潛力能將天然物加以研究製 造出一系列無毒、無害、無副作用、具有營養和療效的化粧品,以提 昇產業水準,並將具我國祖先藥學智慧之化粧品推向國際舞台。

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1998. Evaluation of the EpiOcular tissue model as an alternative to the Draize eye irritation test. Toxicology in vitro 12, 455-461.

(21)

八、附錄

參與教師一覽表 系(所)

教師姓名 職稱 電話 e-mail

粧品所 陳榮秀 特聘教授 2409 [email protected]

粧品系 李佳芬 教授 0933611286 [email protected]

粧品所 林清宮 副教授 7380 [email protected]

粧品系 李淵博 助理教授 2427 [email protected]

粧品系 周宗翰 助理教授 2417 [email protected] 粧品系 梁家華 助理教授 2421 [email protected]

w

藥學系 陳莉螢 助理教授 2209 [email protected] 藥科所 黃秀琴 副教授 2105 [email protected] 醫化系 陳榮才 副教授 0930855696 [email protected]

u.tw

藥學系 楊政哲 副教授 2210 [email protected]

醫化系 李淑婉 副教授 2319 [email protected] .tw

粧品系 蔡玫琳 助理教授 0956877722 [email protected] 醫化系 張朝明 副教授 2304 [email protected]

粧品系 張妙玲 助理教授 2416 [email protected]

參考文獻

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