國立立臺東大學生命科學研究所 碩士論論文
Department of Life Science National Taitung University Master Thesis
指導教授：李李俊霖 博士
Advisor: Chun-Lin Lee, Ph. D.
共同指導教授：胡焯淳 博士
Co-advisor: Cho-Chun, Hu Ph. D
以毛細管電泳偵測尿尿液中核苷 作為癌症生物標記之研究
Determination of urinary nucleosides as potential cancer biomarker using capillary electrophoresis
研 究 生： 吳佳憲 撰 Student: Chia-Hsien Wu
中華民國一百零零三年年一月
January, 2014
謝誌
感謝我的指導教授胡焯淳老老師在我的研究生涯中，對我的指導與 鼓勵勵，讓我可以順利利的完成學業，尤其是在論論文撰寫時給我許多寶貴 的意見見，並適時的引導我，讓我可以順利利進行行研究。感謝李李俊霖老老師 幫忙，並感謝謝明穆老老師及邱泰嘉老老師擔任我的口考委員，許多的老老 師幫忙讓我能順利利畢業。
也要感謝實驗室的學長姊及學弟妹，尤其是靜慧學姊給予許多寶 貴的資料料及意見見，讓我可以減少很多嘗試錯誤的機會；感謝實驗室的 專題生：玟玲玲、均孟、廷翰、純亦、馨屏等人，如果沒有你們在實驗 上的幫忙，我的研究就無法順利利進行行了了。
其次也要感謝白明忠主任對我進修計畫的支持，以其科內同事煥 霖、宜宗、元愷的大力力相助，在這兩兩年年期間幫忙分擔檢查室的工作。
最後要感謝我的父母及家人支持我讀讀研究所，不不斷給我鼓勵勵與加
油打氣。尤其是我的太太幸茹，一人挑起家庭的重擔，照顧秉宸和秉
叡，當我忙碌碌時更更是小心翼翼的不不敢吵我。在讀讀研究所的過程中，家
人無怨無悔的付出，一直是我最大的後盾讓我無後顧之憂。
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以毛細管電泳偵測尿尿液中核苷 作為癌症生物標記之研究
作 者 ： 吳 佳 憲
國 立立 臺 東 大 學 生 命 科 學 研 究 所
中文摘要
本研究以毛細管電泳搭配紫外可見見光吸收偵測器(簡稱CE-UV)，開發出簡易易 快速分離離六六種核苷標準品(胞苷、腺苷、尿尿苷、肌苷、N2,N2-雙甲基鳥苷、8-羥 基去氧鳥苷)與肌酸酐的方法，並可成功檢測癌症病人尿尿液中的四種核苷（胞苷、
腺苷、尿尿苷、肌苷）。本研究探討緩衝溶液硼酸鹽硼酸鹽濃度度、pH 值、羥丙基-β- 環糊精精（HP-β-CD）濃度度、及樣品前處理理添加硼酸鹽對分離離核苷的影響，結果最 佳分離離核苷的條件為 15 mM 硼酸緩衝溶液(pH 9.4)添加 30 mM HP-β-CD，並於 前處理理時添加 2 mM 硼酸鹽溶液。UV 偵測波長設在 254 nm，於電壓 16 kV 下，
進行行電泳，可在 7 分鐘內完成分離離。本方法最低偵測極限(LOD)可達 0.65 μM (N2,N2-雙甲基鳥苷，訊號/雜訊比＝3)。此外，本研究亦利利用毛細管區帶電泳分 離離肌酸酐。此兩兩種毛細管電泳方法偵測核苷標準品與的檢量量線之 R2 值皆大於 0.99，且同日間與異異日間波峰高度度的 RSD 值皆小於 2.81%，回收率率率則介於 86 % 至 110% 之間。利利用上述方法分析癌症患者的尿尿液，結果發現癌症患者尿尿液中 的平均核苷排放量量高於健康對照組受試者。本方法有潛力力可應用於癌症生物標記 的研究。
關 鍵 詞 ： 毛 細 管 電 泳 法 、 腺 苷 、 胞 苷 、 尿尿 苷 、 肌 苷 、 癌 症 生 物 標 記 、 羥 丙 基 -β-環 糊 精精
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Determination of urinary nucleosides as potential cancer biomarker using capillary electrophoresis
Chia-Hsien Wu Abstract
We developed a simple method for rapid detection of six nucleosides standards (cytidine, adenosine, uridine, inosine, N2,N2-dimethylguanosine, 8-hydroxydeoxyguanine), and creatinine by using capillary electrophoresis with UV detection. The method can successfully detect four urinary nucleosides (cytidine, adenosine, uridine, inosine) in cancer patients. We evaluated factors affecting separation of nucleosides, including buffer borate concentration, pH, concentration of HP-β-CD, addition of borate solution during sample pretreatment. Resulting optimum conditions were 15 mM borate buffer (pH 9.4) with 30 mM HP-β-CD and addition of 2 mM borate solution during sample pretreatment. The UV detector was set to 254 nm.
With 16 kV voltage, the analysis time was less than 7 min. The limits of detection was 0.65 μM (N2,N2-dimethylguanosine, S/N = 3 ). We also used capillary zone electrophoresis for analysis of urinary creatinine. R2 of calibration curve for both CE methods were > 0.99. RSD of intraday and interday peak height variation was less than 2.81% and their recovery ranged between 86% and 110%. In real sample application, the results showed that average urinary adenosine, cytidine, uridine, inosine levels were higher in patients with malignancy than in healthy individuals.
The methods may be useful in cancer biomarker screening study
.
Keywords：Capillary electrophoresis; Adenosine; Cytidine; Uridine; Inosine;
HP-β-CD; Cancer biomarker
iii
目錄錄
中文摘要 ... i
Abstract ... ii
目錄錄 ... iii
圖目錄錄 ... v
表目錄錄 ... vi
第一章 前言 ... 1
壹、 癌症簡介 ... 1
貳、 核苷與癌症的關聯聯性 ... 3
一、 核苷與血液、淋淋巴癌 ... 4
二、 核苷與肺癌 ... 5
三、 核苷與乳癌 ... 5
四、 核苷與肝膽腸胃道癌症 ... 6
參參、 毛細管電泳法的原理理 ... 10
一、 電滲流流 ... 10
二、 電泳流流 ... 11
三、 緩衝溶液的種類類 ... 11
四、 緩衝溶液的 pH 值 ... 12
五、 緩衝溶液的濃度度 ... 12
六六、 分離離電壓 ... 12
七、 毛細管的內徑與長度度 ... 12
八、 進樣的方式與時間 ... 12
肆、 以毛細管電泳法分析尿尿液中核苷的現況 ... 13
伍、 環糊精精之簡介 ... 15
陸陸、 研究動機 ... 19
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第二章 實驗材料料與方法 ... 20
壹、 藥品與溶劑 ... 20
貳、 儀器設備 ... 20
參參、 標準品與緩衝溶液配置 ... 21
肆、 真實樣品之前處理理及配製 ... 21
伍、 毛細管電泳實驗流流程 ... 24
第三章 實驗結果 ... 26
壹、 分析核苷的最佳化條件探討 ... 26
一、 硼酸鹽緩衝溶液的濃度度對核苷分離離之影響 ... 26
二、 HP-β-CD 的濃度度對核苷分離離之影響 ... 31
三、 pH 值對核苷分離離之影響 ... 35
四、 樣品前處理理加入硼酸鹽溶液對核苷分離離之影響 ... 39
五、 緩衝溶液加入十二烷基硫硫酸鈉對核苷分離離之影響 ... 44
六六、 樣品保存溫度度對核苷訊號之影響 ... 46
七、 方法確效 ... 48
貳、 分析肌酸酐最佳化條件探討 ... 52
一、 pH 值對肌酸酐與尿尿酸分析之影響 ... 53
二、 磷酸鹽緩衝溶液的濃度度對肌酸酐與尿尿酸分析之影響 ... 57
三、 電壓對肌酸酐與尿尿酸分析之影響 ... 61
四、 方法確效 ... 65
參參、 真實樣品的應用 ... 68
第四章 結論論 ... 72
第五章 未來來展望 ... 73
第六六章 參參考文獻 ... 74
v
圖目錄錄
圖一、核苷與核苷酸結構示意圖 ... 9
圖二、β 環糊精精的分子構造圖 [52] ... 18
圖三、毛細管電泳分析作業示意圖 ... 25
圖四、不不同濃度度硼酸鹽緩衝溶液分析核苷所得的毛細管電泳圖譜 ... 28
圖五、緩衝溶液中不不同 HP-β-CD 濃度度分析核苷所得的毛細管電泳圖譜 ... 32
圖六六、不不同pH 值緩衝溶液分析核苷所得的毛細管電泳圖譜 ... 36
圖七、樣品前處理理加入不不同濃度度硼酸鹽溶液所得的核苷毛細管電泳圖譜 ... 40
圖八、緩衝溶液添加HP-β-CD 或十二烷基硫硫酸鈉，分析核苷的毛細管電泳圖譜 ... 45
圖九、不不同檢體保存溫度度與尿尿液中核苷訊號的變化 ... 47
圖十、不不同pH 值緩衝溶液分析肌酸酐與尿尿酸所得的毛細管電泳圖譜 ... 54
圖十一、不不同濃度度磷酸鹽緩衝溶液分析肌酸酐與尿尿酸所得的毛細管電泳圖譜 ... 58
圖十二、不不同電壓分析肌酸酐與尿尿酸所得的毛細管電泳圖譜 ... 62
圖十三、分析癌症病患與無病對照受試者尿尿液中核苷的毛細管電泳圖譜 ... 71
vi
表目錄錄
表一、以毛細管電泳法分離離尿尿液中核苷的研究及其分析條件 ... 14
表二、環糊精精的基本性質 [52] ... 17
表三、八種分析物的結構式 ... 22
表四、不不同濃度度硼酸鹽緩衝溶液分析核苷所得的波峰高度度 ... 29
表五、不不同濃度度硼酸鹽緩衝溶液分析核苷所得的分析物解析度度 ... 30
表六六、緩衝溶液中不不同HP-β-CD 濃度度分析核苷所得的波峰高度度 ... 33
表七、緩衝溶液中不不同HP-β-CD 濃度度分析核苷所得的分析物解析度度 ... 34
表八、不不同pH 值緩衝溶液分析核苷所得的波峰高度度 ... 37
表九、不不同 pH 值緩衝溶液分析核苷所得的解析度度 ... 38
表十、樣品前處理理加入不不同濃度度硼酸鹽溶液分析核苷所得的波峰高度度 ... 41
表十一、樣品前處理理加入不不同濃度度硼酸鹽溶液分析核苷所得的解析度度 ... 42
表十二、分離離核苷的最佳化條件 ... 43
表十三、檢量量線的線性範圍，精精確度度，偵測極限與定量量極限 ... 49
表十四、準確度度(回收率率率) ... 50
表十五、以毛細管電泳法分離離尿尿液中核苷的研究及其分析條件 ... 51
表十六六、不不同 pH 值緩衝溶液分析肌酸酐與尿尿酸所得的波峰高度度與遷移時間... 55
表十七、不不同 pH 值緩衝溶液分析肌酸酐與尿尿酸所得的遷移時間 ... 56
表十八、不不同濃度度磷酸鹽緩衝溶液分析肌酸酐與尿尿酸所得的波峰高度度 ... 59
表十九、不不同濃度度磷酸鹽緩衝溶液分析肌酸酐與尿尿酸所得的遷移時間 ... 60
表二十、不不同電壓分析肌酸酐與尿尿酸所得的波峰高度度 ... 63
表二十一、不不同電壓分析肌酸酐與尿尿酸所得的遷移時間 ... 64
表二十二、分離離肌酸酐與尿尿酸的最佳化條件 ... 66
表二十三、檢量量線的線性範圍，精精密度度，偵測極限，定量量極限 ... 67
表二十三、癌症病患與健康對照受試者基本資料料與尿尿液中核苷/肌酸酐的比值 ... 70
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第一章 前言 壹、 癌症簡介
癌症是指人體內一些生長分裂裂不不正常的細胞，因為生長不不受正常調控，而影 響並侵犯正常的組織器官，造成器官功能喪失並導致出血、疼痛、或阻塞塞等症狀狀，
是一種威脅人體生命與健康病症。根據衛生福福利利部國民健康署公布的國人十大死 因，癌症蟬聯聯十大死因之首已經連連續 31 年年。據統計，101 年年國人因癌症死亡人 數數為 43,665 人，占所有死因死亡人數數的 28.4% [1]，而其中，排名前三名的肺 癌，肝癌與大腸直腸癌就占了了因癌症死亡人數數一半以上。目前已知的癌症危險因 子，包括與遺傳因素、環境因素（吸菸，吸二手菸 [2]，廚房油煙 [3] 與空氣污 染，紫外線與放射線曝露露）、個人不不健康行行為（吸煙，喝酒，嚼檳榔，應酬多，
缺乏運動）、病毒感染（B型肝炎病毒，C型肝炎病毒 [4] ，人類類乳突瘤病毒 [5]
等）等等，而其有一部分是屬於可以改變的因素，例例如避免曝露露於致癌的環境因 素，改變個人不不健康行行為並建立立良良好的生活習慣。另一部分則可以透過定期篩檢，
在癌症的初期或癌前病變階段就診斷出來來，而進一步接受治癒性療療法，達到最大 治療療效益益與存活率率率。最好的例例子就是推廣子宮頸抹片篩檢(Pap smear)成功降降低子 宮頸癌發生率率率 [6]。其他例例子還有透過大腸鏡切切除腺性息肉，降降低日後罹罹患大腸 癌的風險 [7]；B型肝炎、C型肝炎病患定期接受腹部超音波檢查與甲型胎兒蛋白 檢驗，達到早期診斷肝癌，增加病患治癒率率率 [8,9]；以低劑量量電腦斷層掃描篩檢 肺部結節，達到早期診斷肺癌，增加病患治癒率率率 [10]。
上述的篩檢，往往涉及昂貴的影像學檢查、游離離輻輻射的曝露露或侵入性的處置，
且無法應用於大規模無症狀狀病人的篩檢。因此，各種癌症的生物標記也不不斷被研
2
發出來來，期望能用於高通量量的大規模篩檢，然而目前可供臨臨床使用的癌症生物標 記，常面臨臨靈靈敏性不不足（僞陰性）或缺乏專一性等等缺點，因此整體因癌症造成 的死亡率率率仍在持續攀升中。根據Feng等人發表於 2005 年年的研究 [11]，在連連續 52 例例病理理確診的大腸直腸癌病患中，只有 38.5％ 的患者血液中癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen, CEA）呈現異異常上升。甲型胎兒蛋白(α-fetoprotein, AFP) 是目前肝癌最具專一性的指標, 而依據 Tevisrani 等人發表於 2001 年年的一份病 例例對照性研究報告，當 AFP 的正常上限值定在 16 ng/mL 時，其診斷肝癌的敏 感 性 只 有 60% [12] 。 其 他 如 應 用 於 攝 護 腺 癌 的 攝 護 腺 特 異異 性 抗 原 (prostate-specific antigen, PSA)，在良良性攝護腺增生而無攝護腺癌的患者，時常也 會出現異異常上升的情形，即所謂的偽陽性 [13]。此外， Tompson 等人研究發現，
攝護腺癌病患中，有 50.8％ 患者其 PSA 值介於 2.1 – 4 ng/mL [14]，也就是 說說說約有一半攝護腺癌病人，其血液中 PSA 值低於一般認定的正常上限值(4 ng/mL），此即所謂的偽陰性。
傳統癌症生物標記通常只能用於輔助診斷單一種癌症，而目前癌症生物標記 的另外一個研究方向，是一次觀察大量量的代謝物的變化情形所組成的代謝體學 (metabolomics)，而非只觀察單一個生化指標。這樣的方式甚至可以藉由分析代 謝體學的特徵，反映出個體的健康狀狀態，或判斷是否有癌症 [13]。要達到這樣 的目標，必需要篩檢大量量癌症病患與健康對照受試者的檢體，然後進行行生物資訊 學的分析，其中有些未知的分子，甚至需要進行行質譜分析鑑定。因此，在進行行代 謝體學的研究之前，首先必須建立立一套簡易易靈靈敏又經濟的分析方法，可以分析大 量量生物樣品，而毛細管電泳分析法就具備了了這樣的優勢。而尿尿液核酸代謝物：核 苷則是一個適合的觀察目標，底下章節將介紹尿尿核苷與癌症的關係。
3
貳、 核苷與癌症的關聯聯性
核苷(Nucleoside)是一種醣甘胺(glycosylamine)分子，由鹼基加上五碳糖糖或去 氧核糖糖所組成，廣義來來看，核苷也含括了了去氧核苷。例例如（去氧）胞苷、尿尿苷、
（去氧）腺苷、（去氧）鳥苷與（去氧）胸腺苷，而這些核苷加上一個磷酸基團 就成為（去氧）核苷酸，是 DNA 與 RNA 的組成單位，如圖一所示。
修飾核苷大部分是從核糖糖核酸(Ribonucleic acid, RNA)而來來的，而且傳遞RNA (transfer RNA, tRNA)佔了了絕大部分。修飾核苷是透過轉譯後修飾產生，且每一種 化學修飾都都需要特定的酶來來完成 [15]，其與 RNA 的代謝速度度有關。例例如傳訊 者RNA(messenger RNA, mRNA)的 5’Cap 就是一種甲基化修飾的鳥苷，可以保 護 mRNA 不不被降降解。
正常的核苷（嘌呤與嘧啶）經生物轉化後，一部分會經由回收途徑（Salvage passway）轉變成腺核苷單磷酸（Adenosine monophosphate, AMP），次黃嘌呤核 苷 單 磷 酸 （Inosine monphosphate, IMP ）， 鳥 嘌 呤 核 苷 單 磷 酸 （ Guanosine monophosphate, GMP），尿尿核苷單磷酸（Uridine monophosphate, UMP），胞核苷 單 磷 酸 （Guanosine monophosphate, CMP ） , 胸 腺 核 苷 單 磷 酸 （ Thymidine monophosphate, TMP），其餘最後會被降降解成尿尿酸或β-丙胺酸（β-alanine）、β- 胺基異異丁酸（β-aminoisobutyrate），而修飾核苷（modified nucleosides）則因無相 對應的分解酵素，造成它既不不易易被代謝降降解，也不不能被再回收利利用，只能通過尿尿 液排出體外 [16,17]。所以，尿尿中修飾核苷的量量能夠反映出人體內 RNA 的代謝 速度度。在許多狀狀態下，如孕婦，嬰幼兒與成長期兒童，血液疾病，發炎性疾病，
後天免疫不不全症候群（AIDS）以及癌症，體內 RNA 的代謝速度度會迅速增加 [13]。
此外，在帶有肝癌的實驗動物的肝組織中，可以觀察到負責修飾 RNA 的甲基化
4
轉移酶出現活性異異常上升的情形 [18]。綜合上述兩兩個因素（代謝速度度增加與修 飾酶活性增加）推測，當人體發生癌變時，血液和尿尿中修飾核苷含量量會急劇增加。
自從 Gehrke 等學者於 1978 年年首次報導成功偵測癌症病人尿尿液中的核苷以來來 [19]，陸陸續有許多學者觀察到，在不不同癌症病患的尿尿中核苷含量量皆高於一般健康 人，因此科學家提出透過檢測血液或尿尿中修飾核苷的含量量，來來推測體內腫瘤的存 在。目前以知的修飾核苷約有九十多種，其中二十種常被研究用來來當做診斷癌症 的生物標記 [20]。底下列列出文獻常用的二十種核苷及其縮寫：假尿尿苷（Psu, pseudouridine）、尿尿苷（U, uridine）、腺苷（A, adenosine）、胞苷（C, cytidine）、
1-甲基腺苷（m1A, 1-methyladenosine）、1-甲基肌苷或1-甲基次黃嘌呤核苷（m1I, 1-methylinosine）、1-甲基尿尿苷（m1U, 1-methyluridine）、5-甲基尿尿苷（m5U, 5-methyluridine）、2-甲基鳥苷（m2G, 2-methylguanosine）、N2,N2-雙甲基鳥苷
（m22G or dmG, N2,N2-dimethylguanosine）、肌苷或次黃嘌呤核苷（I, inosine）、
1-甲基鳥苷（m1G, 1-methylguanosine）、鳥苷（G, guanosine）、N4-乙醯胞苷（ac4C, N4-acetylcytidine）、6-甲基腺苷（m6A, 6-methyladenosine）、5-甲基胞苷（m5C, 5-methylcytidine）、7-甲基鳥苷（m7G, 7-methylguanosine）、（X, Xanthosine）、1,7- 雙甲基鳥苷（m1,7G, 1,7-dimethylguanosine）、2-吡啶酮-5-甲醯胺-N1-呋喃核糖糖苷
（PCNR, 2-pyridone-5-carboxamide-N1-ribofuranoside）。我們也回顧了了關於 RNA 修飾核苷應用各種癌症輔助診斷的文獻。
一、 核苷與血液、淋淋巴癌
Itoh 等人發現在急性骨髓性白血病（acute myeloid leukemia, AML）、慢性骨 髓 性 白血 病（chronic myeloid leukemia, CML）、急性淋淋巴性白血病（ acute
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lymphoblastic leukemia, ALL）與多發性骨髓瘤（multiple myeloma）患者尿尿液中 Psu 與 m1A 有上升情形，且化療療後病情緩解時，上述兩兩種尿尿液中核苷的排放量量 也會恢復復至正常 [21]。AML 與 CML 患者尿尿液中 Psu 的量量與血液中不不成熟細 胞的多寡，並無明顯關連連性。然而在 Rasmuson 的研究中，非霍杰金金氏淋淋巴瘤
（non-Hodgkin's lymphoma, NHL）患者病程的進展和尿尿液中 Psu 的量量有顯著的 相關性 [22]。
二、 核苷與肺癌
Waalkes 等人在 1982 年年以 HPLC 法偵測了了小細胞肺癌患者尿尿液中五種修 飾核苷的量量（Psu, m1A, m1I, m2G, m22G），結果發現癌症分期與異異常上升 的修飾核苷的數數目有顯著相關性，可作為患者預後以及存活率率率的指標 [23,24]。
Tamura等人則於 1986 年年發表了了尿尿液中 Psu 的量量與腫瘤負荷（tumor burden）呈 正相關 [25]。
三、 核苷與乳癌
Sasco 等人在 1996 年年報導，以免疫法（ELISA）檢測了了 68 位乳癌患者尿尿 液中六六種修飾核苷的量量，結果發現尿尿液中 m1A、m1I 在疾病較嚴重者（癌症已 轉移或無法手術者）有顯著上升的情形，且尿尿液中 m1A、m1I 上升者，其五年年 存活率率率較低，可作為預後因子 [26]。Zheng 等人在 2005 年年以毛細管微胞電動 層析法(MEKC)偵測了了 26 名乳癌病患、 20 名乳房良良性腫瘤病患與 41 名健康 對照受試者等三個群組尿尿液中之十三種修飾核苷，結果發現乳癌病患的尿尿中修飾 核苷排放量量，顯著高於良良性腫瘤病患或健康對照受試者。以此十三種修飾核苷的 濃度度為資料料向量量，進行行主成份分析(principal component analysis)，則 73％ 的乳
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癌病患可與健康受試者區別開來來 [27]。 2009 年年，Cho 等人採用 HPLC/MS/MS 方式偵測乳癌患者手術前後以及健康對照受試者的十四種尿尿液中核苷（包含四種 去氧修飾核苷），結果發現乳癌病患手術前尿尿液中 m22G、m1A、8-OHdG、
5-Hydroxymethyl-2’-deoxyuridine 的量量顯著高於健康對照組，且在手術後兩兩週再 次偵測，大部分患者的尿尿中核苷排放量量都都下降降到接近正常的範圍，顯示尿尿中修飾 核苷除輔助診斷外，也有發展為療療效評估或預後因子的潛力力 [28]。 2011 年年，
Hsu 等人也使用 LC/MS/MS 方式偵測 36 名乳癌患者尿尿液中核苷的量量，結果發 現乳癌患者尿尿中 C、m3C、I 的量量，顯著高於健康對照受試者 [29]。
四、 核苷與肝膽腸胃道癌症
Clark 等人在 1983 年年發現，以黃麴毒素 B1 誘發肝癌的小鼠，其尿尿液中的 假尿尿苷( Psu )有異異常上升的情形，且這種現象在肝腫瘤尚未形成的癌症前期就能 觀察到 [30]。之後 1986 年年 Tamura 應用 HPLC 法偵測尿尿液中假尿尿苷，並設定 假尿尿苷上升高於健康對照組平均值兩兩個標準差為肝癌陽性，同時合併血清中胎兒 蛋白作為診斷工具，結果發現肝癌的診斷敏感度度可達 83% （19 of 23 HCC patients） [31]。Yang 研究團隊在 2004 年年以 HPLC 法偵測了了肝惡惡性腫瘤、急 性、慢性肝炎，與肝硬化等四個群組病患之尿尿液中的十五種修飾核苷排放量量，結 果發現肝惡惡性腫瘤組病患的五種尿尿液修飾核苷（Psu, m1A, X, m1I, m1G），顯著 高於其它三組 [32]。 2008 年年，黃智銘等人以高效毛細管電泳法(HPCE)分析了了 21 位肝細胞癌病患腫瘤切切除前與手術後三天尿尿中四種修飾核苷(m5U, I, Ac4C, X)排放量量的變化，並與 10 位良良性肝腫瘤病患、 21 位肝硬化病患以及 30 位健 康人做比較。結果發現手術前尿尿中修飾核苷排放量量顯著高於手術後或其它肝硬化
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或良良性肝腫瘤病患 [33]。2009 年年鄭隆隆賓等人首次發表了了以高效液相層析/串串聯聯質 譜(HPLC/MS/MS)法，對 25 位肝細胞癌病患與 20 位健康人尿尿中七種修飾核苷 (包括一種去氧修飾核苷 dG)進行行分析，結果發現肝細胞癌病患尿尿液中的三種修 飾核苷(C, A, I)顯著高於健康人，並能增加肝癌診斷的靈靈敏度度，由原本單獨使用 甲型胎兒蛋白的 68％，提升至 80％ [34]。 2009 年年， Lai 等人以 HPLC/MS/MS 方式偵測 26 位大腸癌患者與 18 位健康對照組受試者尿尿液中的九種核苷（包括 兩兩種去氧核苷），結果發現大腸癌病患尿尿中修飾核苷 A、C、m22G、U 與 8-OHdG 的排放量量顯著高於對照組 [35]。
修飾去氧核苷(modified deoxynucleosides)是來來自於 DNA，是 DNA 受到氧 化壓力力的攻擊而產生經過體內基因修補系統修復復後，這些修飾去氧核苷會經由尿尿 液排出，可反應出 DNA 氧化損傷的程度度 [36]。DNA 氧化損傷是造成老老化，退 化性疾病，與癌症的重要因之一，而 DNA 氧化損傷的標記則能用來來評估癌症 的風險，老老化的情形以及癌症治療療效果的評估。目前研究大多以 8-羥基去氧鳥 嘌呤核苷(8-OHdG)做為 DNA 氧化損傷的標記，因為它會造成基因突變（point mutation, CG→ AT） [37]，且常在一些癌症相關的基因中被發現 [38]。此外，
在實驗動物的標的組織中，8-OHdG的含量量也與癌症的發生率率率有關連連性 [39]。
2008 年年，Makoto 等人以免疫組織染色法分析了了 104 位慢性C型肝炎患者的肝 臟組織病理理切切片中 8-OHdG 表現量量，並且持續追蹤患者是否發生肝細胞癌。結 果發現在肝切切片 8-OHdG 表現量量高於 30% 組，其病患累累積肝細胞癌發生率率率顯 著高於 8-OHdG 表現量量低於 30% 組。這表示 DNA 氧化損傷標記 8-OHdG 在 慢性C型肝炎是一個肝細胞癌的危險因子 [40]。在肺癌，大腸癌，婦科癌症與頭 部癌症患者，也有研究指出其尿尿液中 8-OHdG 的含量量顯著高於健康對照組受試
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者(35.26±27.96 nM versus 13.51±5.08 nM，P<0.05) [41]，此外當患者接受手術 切切除腫瘤，或化學治療療之後，尿尿液中的 8-OHdG 的含量量則出現顯著下降降的情形 [41]。
大部分文獻都都只探討了了癌症與 RNA 修飾核苷或 DNA 修飾去氧核苷兩兩者 其中一種的關聯聯性，目前同時偵測尿尿液中修飾核苷與 DNA 氧化損傷標記 8-OHdG 的文獻只有兩兩篇 [28,35]，是關於大腸癌與乳癌患者尿尿液中修飾核苷的 變化，結果發現數數種尿尿中 RNA 修飾核苷以及 DNA 修飾去氧核苷在癌症病患 都都有上升的趨勢，且在乳癌患者手術後，兩兩者同樣會下降降到接近健康對照組的平 均值。
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圖一、核苷與核苷酸結構示意圖
Fig. 1 Structure characteristics of nucleosides and nucleotides
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參參、 毛細管電泳法的原理理
電泳是指帶電荷物質在電場中，受到電場的作用力力而移動的現象，所謂毛細 管電泳就是將電泳的現象移到 25〜～100 μm 的細管中進行行，而傳統平板電泳的膠 體，在毛細管電泳中就變成了了充滿毛細管的緩衝溶液，提供分析物質在管內移動 的介質。實際操作時，首先將毛細管充滿緩衝溶液，之後再將分析物由毛細管入 口處注入，之後將毛細管兩兩端置放於兩兩個裝有緩衝溶液的容器，然後將電極也分 別置入兩兩個緩衝溶液的容器中，施加電壓，此時分析物質即開始產生電泳的現象，
並依荷質比的差異異以不不同的速度度朝出口端移動，當分析物到達接近出口端的偵測 器時，即可被偵測到而產生訊號。毛細管材質一般為融矽毛細管（fused silica），
管外塗佈一層 polyamide 高分子聚合物，可增加韌性而減少斷裂裂的情形。而毛 細管內徑小，表面積與體積的比值高，散熱佳，可於高電場的情況進行行分離離而不不 過熱。由於所需的設備簡單、分離離效率率率高、溶劑耗損少、所需樣品少以及分析快 速等等優點，毛細電泳已廣泛應用於生物化學、醫學，製藥與分析化學等等領領域 [42]。
影響毛細管電泳分析物分離離的因素包括下列列幾點：
一、 電滲流流
電滲流流（electroosmotic flow, EOF）是緩衝溶液在毛細管中移動的重要現象。
毛細管材質內壁表面含有矽醇官能基 (SiOH, pKa=1.5)，當緩衝溶液 pH ≧2 時，
SiOH 會解離離成 SiO- 而帶負電，緩衝溶液中的陽離離子有一部分會被吸附到管壁 上而形成電雙層，其餘則向管柱中心形成濃度度逐漸降降低的擴散層。而由於管壁至 中心的陽離離子電荷分佈不不均，會產生 Zeta 電位（ζ）。當毛細管施加電壓後，
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擴散層中的陽離離子受到負極吸引，會往負極移動，同時也帶動管柱中的溶液整體 往負極移動，此即所謂的電滲流流， 其與ζ 的關係如下公式所示 [43]：
Ve0 = ( ε ζ / 4π η ) x E。
Ve0：電滲流流的移動速率率率 ε：介電常數數
ζ：zeta 電位
η：緩衝溶液的黏稠度度 E：電場強度度
電滲流流與緩衝溶液的黏度度成反比，黏度度越大時，電滲流流越小。電滲流流與 Zeta 電位成正比， Zeta 電位越大，電滲流流也越大。
二、 電泳流流
帶電分析物在電場中，受到電場的作用力力而移動，稱之為電泳流流。電泳流流的 移動方向與分析物本身所帶電荷有關，會往與本身所代電荷相反的電極移動。毛 細管電泳中，在設計條件下使電滲流流遠大於電泳流流時，則不不論論分析物所帶電荷為 何，所有分析物一律律跟電滲流流往負極移動，然而其淨遷移率率率則為電滲流流與電泳流流 同時作用在該分析物上的淨移動力力所造成的結果。因此，移動到毛細管出口偵測 端的順序為 1.帶正電分析物 2.不不帶電分析物 3.帶負電分析物。
三、 緩衝溶液的種類類
每一種緩衝溶液有一定的 pH 緩衝範圍與不不同的介電常數數，需根據分析物 的性質(pKa)選擇適當種類類的緩衝溶液，以維持 pH 穩定。
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四、 緩衝溶液的 pH 值
緩衝溶液的 pH 值會影響毛細管壁 SiOH 解離離程度度，進而影響 Zeta 電位 與電滲流流 EOF 的大小。此外，pH 值也會影響分析物本身的所帶的電荷與電泳 流流。
五、 緩衝溶液的濃度度
緩衝溶液濃度度增加時，離離子強度度也增強，同時溶液黏度度也上升，電滲流流與電 泳流流都都會變小。
六六、 分離離電壓
分離離電壓會影響分析物遷移時間的長短與解析度度，但並不不會改變對分析物的 選擇性。
七、 毛細管的內徑與長度度
毛細管管徑越細，長度度越長，一般來來說說說解析度度也越高。
八、 進樣的方式與時間
進樣的方式可分類類為壓力力進樣，重力力進樣，電動進樣，真空抽吸進樣；而進 樣時間長短會影響樣品進入毛細管的體積。此外，樣品注射之體積所佔毛細管總 體積之比例例，甚至可能影響緩衝溶液的導電度度，進而影響分離離效率率率。
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肆、 以毛細管電泳法分析尿尿液中核苷的現況
分析尿尿液樣品中核苷與修飾的核苷的方法，包括免疫法，高效液相層析法
（HPLC）以及毛細管電泳法結合 UV 檢測（HPCE-UV）或光電二極管陣列列檢 測器（HPCE-DAD）或質譜（MS）檢測。免疫法的測定需要使用專一性的單株 抗體，然而並非每個核苷都都有商品化的單株抗體可用，且可能會發生交叉反應
（cross-reaction），而造成僞陽性的結果；而高效液相層析法所需要的檢體體積 較大，且需要繁複的分析管柱處理理流流程，而且過程中需要使用大量量有機溶劑；而 質譜儀檢測則需要昂貴的儀器且不不利利於自動化操作流流程，因此本實驗使用毛細管 電泳法結合 UV 檢測的方式檢驗尿尿液中核苷。
表一列列出了了近十二年年內，使用毛細管電泳法分析尿尿液中核苷的相關研究。大 部分的研究使用固相萃取法 (SPE) 進行行樣品前處理理，以去除檢體中基質干擾。
由於核苷（除去氧核苷外）含 1,2-順式二醇，會與硼酸鹽發生錯合作用 [44]，
因此緩衝溶液的選擇大都都以硼酸鹽緩衝溶液為主。大部份的研究者使用毛細管微 胞電動層析法 (MEKC) 分離離核苷，而於緩衝溶液中加入界面活性劑十二烷基硫硫 酸 鈉 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) 或 溴 化 十 六六 烷 基 三 甲 銨 (Cetyltrimethylammonium Bromide, CTAB)，形成微胞（Micelle），而分析物根據 疏水性的差異異，則進入微胞的機會也不不同，因此分析物在緩衝溶液與微胞之間分 配係數數也不不同，藉此來來進行行分離離。表一所列列出的研究，其偵測方式大都都是以紫外 /可見見光（UV/VIS）為主，偵測極限大都都在微莫爾濃度度範圍（μM） [27,45-48]，
當以質譜儀偵測時，則可將偵測靈靈敏度度提昇至 nM 的範圍 [49]。
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表一、以毛細管電泳法分離離尿尿液中核苷的研究及其分析條件
Table 1. Analytical conditions of studies determining urinary nucleosides by capillary electrophoresis Real
sample
Preparation Detection type Condition Analysis time
LOD Ref.
Urine SPE CE-MS with positive ion mode
BGE: prepared by mixing 150 mM acetic acid with 15% methanol and 15% ethanol; uncoated fused silica capillary (60 cm × 50 μm I.D.);
voltage 25 kV
18 min 0.009–3.82 (μM)
[49]
Urine SPE UV at 254 nm BGE: 300 mM SDS, 25 mM Na2B4O7, 50 mM phosphate (pH 6.9); uncoated fused silica capillary (50 cm × 50 μm I.D.); voltage 7 kV
45 min 3.1–74.2 (μM)
[45]
Urine SPE UV at 254 nm BGE: 160 mM SDS, 100 mM Na2B4O7, 72.5 mM NaH2PO4 (pH 6.7) ; uncoated fused silica capillary (70 cm × 50 μm I.D.); voltage 25 kV
25 min 0.17–2.26 (μM)
[47]
Urine SPE UV in the range from 190 to 390 nm
BGE: 25 mM borate, 42.5 mM phosphate
pH 6.7, 200 mM SDS; uncoated fused-silica capillary (57.0 cm × 50 mm I.D.); voltage 15 kV,
30 min 4.8–12.2 (μM)
[46]
Urine SPE UV at 254 nm BGE: 25 mM CTAB, 25 mM Na2B4O7 , 25 mM NaH2PO4 (pH 9.50); uncoated fused silica capillary (48 cm × 50 μm I.D.);; voltage −15 kV
7 min 0.55–1.67 (M)
[48]
Urine SPE UV at 254 nm BGE: 300 mM SDS, 25 mM Na2B4O7, 50 mM NaH2PO4 (pH 6.9); uncoated fused silica capillary (50 cm × 50 mm I.D.); voltage 7 kV
45 min － [27]
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伍、 環糊精精之簡介
環糊精精（cyclodextrins）是由六六個以上葡萄糖糖以 α—1, 4—糖糖苷鍵聯聯合而成的 巨環聚合物，依組成的葡萄糖糖數數目不不同而命名。其中最常見見三種的是 α環糊精精
（α-cyclodextrin）、β環糊精精（β-cyclodextrin）、γ環糊精精（γ-cyclodextrin），分別由 六六個、七個與八個葡萄糖糖分子所組成，表二列列出了了其基本性質。Villiers 在 1891 年年的時候首先發現了了環糊精精，之後 1902 到 1911 年年間， Schardinger 鑑定出 α、
β環糊精精，且在 1930 年年代鑑定出 γ環糊精精，不不久之後 Cramer 等人發現了了環糊 精精具有形成包容錯合物的能力力。到了了 1950 年年代，環糊精精的基礎物理理化學特性，
包括幫助藥物溶解與提高藥物穩定性等特質，已被研究發表出來來，然而真正將環 糊精精應用於藥物學的產品則在 1970 年年代末期才出現 [50]。目前工業生產環糊 精精 是 使 用 一 種 天 然 的 酶 ， 稱 為 環 糊 精精 葡 萄 糖糖 轉 移 酶 （ cyclodextrin glucosyltransferase, CGTase），其會將澱粉分解產生環糊精精。CGTase 從兩兩端切切斷 呈螺螺旋狀狀的澱粉，之後再將頭尾連連接起來來組成一個中空錐筒狀狀構造。CGTase 可 以合成各種形式的環糊精精，取決於剪切切出來來的澱粉長度度不不同，而不不同的 CGTase 對於 α、β、γ 環糊精精生成的比例例也不不同 [51]，需經純化步驟來來分離離出這三種形 態的環糊精精，其分離離原理理則是利利用他們對水的溶解度度不不同。
環糊精精具有特殊的結構，如圖二所示，包括內部疏水性的腔室以及外部親水 性的環狀狀開口，以 β環糊精精為例例，其葡萄糖糖單體 C6 位置的羥基為一級羥基，
C2、C3 位置的羥基則為二級羥基，β環糊精精具有七個一級羥基與十四個二級羥 基，分別位於中空錐筒狀狀構造的開口兩兩端（一級羥基端窄，二級羥基端寬），屬 於極性親水性部份；而各個葡萄糖糖單體的 C3 的甲基、O、與 C5 的甲基則面向 腔室內部排成三列列，屬於非極性疏水性部份 [52]。環糊精精可以利利用其疏水性的
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腔室為主體，包合各種不不同的有機、無機化合物，離離子或稀有氣體，形成主客錯 合物（host-guest complex）或稱為內包錯合物（inclusion complex），這些錯合物 的穩定性與客體分子的大小，形狀狀與疏水性有關，此外環糊精精與客體分子間的非 共價鍵結作用力力（凡得瓦力力、氫鍵與疏水性交互作用）也扮演重要的角色。當各 種物質被環糊精精包合後，其穩定性，溶解度度與揮發性等各種理理化性質會產生明顯 的改變，也因此使它可廣泛應用於許多不不同的領領域，例例如，醫藥、化妝品、分析、
材料料合成及分子生物等。尤其是醫藥方面的應用，除了了增加藥物溶解度度、穩定性、
與生體可用率率率，降降低藥物的毒性、副作用、苦味與對黏膜的刺刺激性外 [50]，其 本身也具有療療效，可應用於膽固醇代謝異異常的疾病 （尼曼匹克症，Niemann-Pick disease） [53]。
羥丙基-β-環糊精精（HP-β-CD）是由 β-CD 與環氧丙烷（propylene oxide）經 化學反應後，將 β-CD 的一級羥基對稱取代為 CH2CHOHCH3而來來的。由於此取 代基具高極性，因此 HP-β-CD 的溶解度度也大幅提昇，且毒性低於 β-CD [54]。
HP-β-CD 在分析化學的應用，主要是用來來分離離異異構物，其分離離原理理是藉由 異異構物本身立立體空間結構的差異異，造成所與環糊精精所形成的內包錯合物穩定度度不不 同，而達到分離離。此外，它也可以幫助提昇疏水性物質的溶解度度。本研究首次將 其應用於幫助分離離尿尿液中的核苷。
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表二、環糊精精的基本性質 [52]
Table 2. Characteristics of cyclodextrins
環糊精精
α β γ
葡萄糖糖單體數數目 6 7 8
分子式（無水） C36H60O30 C42H70O35 C48H80O40
分子量量（無水）g/mol 972.85 1134.99 1297.14
腔室高度度，nm 0.8 0.8 0.8
腔室內徑，nm（估計值） 0.52 0.66 0.84
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圖二、β 環糊精精的分子構造圖 [52]
Fig. 2 Molecular structure of β-cyclodextrin
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陸陸、 研究動機
癌症的診斷與預後相關的生物標記，一直都都很有研究價值，主要是因為其高 盛行行率率率與高復復發率率率，而有用的生物標記可能幫助臨臨床醫師在疾病早期診斷出來來，
讓患者有機會接受治癒性的治療療，且在治療療後的追蹤，也同樣能幫助醫師篩選出 高復復發危險性的病患，進行行更更密切切的追蹤。數數種尿尿液中核酸代謝物組成的代謝體 學，是有別於傳統生化學腫瘤標記外的另一個癌症生物標記的研究方向，但需要 一個靈靈敏，簡單，迅速的分析工具，來來分析大量量生物檢體，探尋有用的生物標記。
因此本研究希望開發出一種不不須前處理理或萃取步驟的毛細管電泳法，可迅速 分析癌症與健康對照受試者尿尿液中的數數種修飾核苷與 DNA 氧化損傷標記 8-OHdG 的變化，作為之後大量量篩檢作業的工具。
由於肝癌與大腸癌為癌症死亡原因的第二、三名 [1]，因此在選擇偵測目標 時，我們參參考了了 2009 年年鄭隆隆賓等人的研究結果：肝細胞癌病患尿尿液中的三種修 飾核苷 (C, A, I) 高於健康人 [34]，以及 2009 年年， Lai 等人的發現：大腸癌病 患尿尿中修飾核苷 A、C、m22G、U 與 8-OHdG 的排放量量顯著高於對照組 [35]，
而選擇偵測的苷項目為 8-OHdG、A、C、m22G、U、I 等六六種。
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第二章 實驗材料料與方法 壹、 藥品與溶劑
實驗中所使用之磷酸氫二鈉 (Na2HPO3)、磷酸二氫鈉 (NaH2PO3)、氫氧化鈉 (Sodium hydroxide)、十六六烷基硫硫酸鈉 (SDS)、羥丙基-β-環糊精精（HP-β-CD）、
四硼酸鈉 (Sodium tetraborate)、肌酸酐（Creatinine）及核苷標準品 (胞苷、腺 苷、尿尿苷、肌苷、雙甲基鳥苷、8-羥基去氧鳥苷) 均購自美國 Sigma 公司。
尿尿酸則是購自於 Riedel-de-Haen 公司。二次去離離子水由美國 Barnstead 公司 出產之超純水系統所製，電阻值皆大於 18 MΩ/cm。
貳、 儀器設備
（一） 紫外光-可見見光吸收儀 Lambda EZ210 購自美國 Perkin Elmer。
（二） 毛細管電泳系統 Model Prince 250 CE System。
（三） 紫外光吸收偵測器 Bischoff Lambda 1010。偵測器經電腦以 WPrince 32 bit 軟體控制，以 SISC 32 2.0 中文版軟體系統擷取與處理理數數據。偵測核苷 時波長設定為 254 nm；偵測肌酸肝和尿尿酸波長設定為 240 nm。
（四） 毛細管柱購自美國 Plymicro Technologies Inc.公司，其為內徑為 75 μm，
外徑為 375 μm 的 Undeactivated fused silica Column，總長為 60 公分，
有效長度度為 50 公分。
（五） pH meter 使用 pH/ion meter D-23，購自日本 HORIBA。
（六六） 去離離子水使用 NANO pure Infinty UV/UFe，購自美國 Barnstead Thermolyn。
（七） 超音波震盪器 BRANSON 1510 購自美國。
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（八） 迷你微量量離離心機 (Mini Centrifuge) QS-7011 (轉速 6500 rpm)，購自 美國 Quick Spin。
參參、 標準品與緩衝溶液配置
標準品（肌酸酐、尿尿酸、胞苷、腺苷、尿尿苷、肌苷、雙甲基鳥苷和 8-羥基 去氧鳥苷）使用二次水配置為濃度度 1×10-2 M 的母液備用，並存放於 4℃ 冰箱 中，實驗進行行前，再稀釋到所需的濃度度。上述八種分析物的結構式列列於表三。
分析肌酐酸與尿尿酸的緩衝溶液是使用磷酸氫二鈉 (Na2HPO3)、磷酸二氫鈉 (NaH2PO3) 與純磷酸 (H3PO4) 所混合，使用時再配製所需濃度度及所需 pH 值；
分析核苷的緩衝溶液是以四硼酸鈉 (Sodium tetraborate) 和羥丙基-β-環糊精精
（HP-β-CD）或十六六烷基硫硫酸鈉 (SDS) 混合而成，再以 10 M 氫氧化鈉 (NaOH) 調配至所需的 pH 值。
肆、 真實樣品之前處理理及配製
本實驗的真實樣品為人體尿尿液，包括來來自台東馬偕醫院的 10 位健康對照組 受試者與 10 位癌症患者（基本資料料請見見表 15），在簽署受試者同意書後 (馬偕 紀念念醫院 IRB 計畫編號 13MMHIS069)，收集其隨機中段尿尿液，並將尿尿液檢體 儲存於 －80℃下。實驗前，將尿尿液樣品置於室溫下回溫，然後取 1 mL 的尿尿液 樣品，以 6500 rpm 離離心 15 分鐘，之後取出上清液部分備用，進行行電泳分析時，
再以超純水稀釋至所需倍率率率後即可上機偵測。為使核苷濃度度符合檢量量線之線性範 圍，偵測健康對照組受試者尿尿液中的核苷時，稀釋倍率率率為 20 倍，偵測癌症病人 的尿尿液核苷則是以 30 倍稀釋，此外，偵測肌酸酐時的稀釋倍率率率為 400 倍。
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表三、八種分析物的結構式
Table 3. Molecular structure of eight analytes
胞苷 ( Cytidine ) 腺苷(Adenosine)
肌苷(Inosine) 尿尿苷(Uridine)
N2,N2-雙甲基鳥苷(N2,N2-dimethylguanine) 8-羥基去氧鳥苷( 8-hydroxy-2-deoxyguanosine)
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尿尿酸(Uric acid) 肌酸酐(Creatinine)
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伍、 毛細管電泳實驗流流程
新的毛細管先充滿 0.1 M NaOH 溶液後，靜置 8~12 個小時，之後將 NaOH 以 ddH2O 置換備用。每天進行行實驗之前，先以 0.1 M NaOH 1000 mbar 沖洗 20 分鐘，再用 ddH2O 1000 mbar 沖洗 10 分鐘，之後即可開始進行行實驗。每次電 泳實驗結束，進行行下一次電泳實驗前，先用 0.1 M NaOH 1000 mbar 沖洗 1 分 鐘，如圖 3A 所示，之後以 0.1 M ddH2O 1000 mbar 沖洗 2 分鐘，再用緩衝溶 液 1000 mbar 沖洗 3 分鐘，如圖 3B 所示，接著以 100 mbar 進樣 6 秒，如 圖 3C 所示，最後再以高壓電進行行電泳分析，分離離分析物，如圖 3D 所示。電 泳完畢之後，以緩衝溶液 1000 mbar 推 1 分鐘將毛細管內殘餘樣品推出。每天 實驗結束後，使用 0.1 M NOH 1000 mbar 沖洗 5分鐘，ddH2O 1000 mbar沖洗 5 分鐘，最後讓毛細管內充滿 ddH2O 的情況下，即可關機。
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圖三、毛細管電泳分析作業示意圖
Fig. 3 Scheme of capillary electrophoresis operation (A) 使用 0.1 M NaOH 沖洗毛細管
(B) 使毛細管充滿緩衝溶液 (C) 注入分析樣品
(D) 施加高壓電，分離離分析物
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第三章 實驗結果
壹、 分析核苷的最佳化條件探討
含1,2-順式二醇的核苷在高 pH 值環境會與硼酸離離子發生錯合作用，改變分 析物的質荷比，影響分離離解析度度，因此硼酸鹽緩衝溶液常見見於毛細管電泳分離離核 苷的實驗中 [27,45-48]。十二烷基硫硫酸鈉(SDS) [27,45-47]、十六六烷基三甲基溴化 銨(CTAB) [48]，也被報導過用於微胞電動力力毛細管電層析法（MEKC）分離離尿尿液 中核苷。本實驗初期曾嘗試了了於硼酸鹽緩衝溶液加入 CTAB 或 SDS，但均無法 順利利分離離胞苷與腺苷，之後參參考了了 2011 年年 Xiaojing Ding 等人所發表應用於分 離離奶粉中核苷酸的方法 [55]，利利用羥丙基-β-環糊精精（HP-β-CD）與樣品形成內 包錯合物 (inclusion complex) 程度度的差異異，以及核苷與硼酸離離子間的錯合作用，
順利利分離離胞苷、腺苷、尿尿苷、肌苷、雙甲基鳥苷、8-羥基去氧鳥苷等六六種核苷標 準品。以下探討了了影響分離離效率率率的因素，並找出分離離核苷的最佳化條件。
一、 硼酸鹽緩衝溶液的濃度度對核苷分離離之影響
1,2-順式二醇與硼酸鹽的錯合作用只發生於高 pH 值的環境下 [44]，所以我 們先將緩衝溶液的 pH 值維持在 pH 9.4，並將 HP-β-CD 的濃度度固定在 30 mM，
然後分別探討 10、15、20、25、30 mM 五種不不同濃度度的四硼酸鈉緩衝溶液，對 分離離效率率率的影響，分析核苷標準品所得的波峰高度度與解析度度的結果列列於表四、表 五，而電泳圖結果如圖四所示。隨著四硼酸鈉緩衝溶液濃度度增高，因為離離子強度度 變大使得 Zeta 電位降降低，導致電滲流流降降低，而使分析物的遷移時間拉拉長。當濃 度度大於 15 mM 時，8-羥基去氧鳥苷、胞苷與腺苷樣品訊號重疊的情形會更更明顯，
造成解析度度下降降。而當四硼酸鈉緩衝溶液濃度度為 10 mM 時，雖然遷移時間較短，
27
但 8-羥基去氧鳥苷與胞苷以及胞苷與腺苷之間的解析度度較四硼酸鈉緩衝溶液濃 度度為 15 mM 時差。因此選擇 15 mM 四硼酸鈉緩衝溶液濃度度為最佳分離離條 件。
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圖四、不不同濃度度硼酸鹽緩衝溶液分析核苷所得的毛細管電泳圖譜
Fig. 4 Electropherograms of nucleosides in various borate buffer concentrations 在固定濃度度的 HP-β-CD（30mM）、 pH 9.4、分離離電壓 16 kV、偵測波長 254 nm 的條件下，使用 (A) 10 mM、 (B) 15 mM、 (C) 20 mM、 (D) 25 mM、 (E) 30 mM，
等不不同濃度度的硼酸鹽緩衝溶液分析六六種核苷標準品所得的電泳圖譜。核苷分析物 標 示 ： (1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine 、 (2) Adenosine 、 (3) Cytidine 、 (4) N2,N2-dimethylguanine、(5) Uridine、(6) Inosine
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表四、不不同濃度度硼酸鹽緩衝溶液分析核苷所得的波峰高度度
Table 4. Effect of various buffer concentration on peak height of the six nucleoside standards
Peak height (mV) Buffer
Concentration (mM)
10 15 20 25 30
8OHdG 7.64 7.88 7.11 6.80 6.87 A 5.23 5.70 5.90 5.65 5.63 C 2.87 3.13 3.25 3.18 3.19 m22G 7.10 7.55 7.75 7.62 7.48 U 4.31 4.48 4.92 4.79 4.82 I 5.25 6.48 5.30 5.22 5.06
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表五、不不同濃度度硼酸鹽緩衝溶液分析核苷所得的分析物解析度度 Table 5. Effect of various buffer concentration on resolution of the six nucleoside standards
Resolution Buffer
Concentration (mM)
10 15 20 25 30
8OhdG/A 0.68 0.73 0.80 0.88 0.88 A/C 1.13 1.10 0.91 0.89 1.02 C/m22G 0.95 1.14 1.09 0.98 0.89 m22G/U 2.91 3.46 2.92 2.44 2.80 U/I 1.81 2.40 2.01 1.69 1.71
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二、 HP-β-CD 的濃度度對核苷分離離之影響
早在 1970 年年代就學者發表使用環糊精精膠體進行行核酸的層析分離離 [56]，而 Madhusudanan 等 人 以 質 譜 儀 碰 撞 誘 導 解 離離 光 譜 證 實 了了 核 苷 與 β 環 糊 精精
（β-cyclodextrin，β-CD）會產生非共價鍵結的主客錯合物（host-guest complex）
或稱為內包錯合物（inclusion complex） [57]。過去曾有少數數文獻報導過同時使 用硼酸鹽與 β-CD 或 HP-β-CD 成功分離離數數種核苷酸 [55,58-60]，而核苷比核苷 酸少了了磷酸基團，更更容易易與硼酸鹽或環糊精精形成錯合物，因此本實驗分別探討了了 含0、10、20、30、40 mM 五種不不同 HP-β-CD 濃度度的四硼酸鈉緩衝溶液 (15 mM，
pH 9.4) 對核苷分離離的影響，分析核苷標準品所得的波峰高度度與解析度度結果列列於 表六六、表七，而電泳圖的結果如圖五所示。在沒有添加 HP-β-CD 時可發現 8- 羥基去氧鳥苷、腺苷、胞苷的訊號有重疊的現象。當 HP-β-CD 濃度度由 10 mM 增 加到 40 mM 時，8-羥基去氧鳥苷、腺苷、胞苷三者訊號的解析度度也隨之上升，
同時伴隨遷移時間逐漸延長。推測為核苷先與四硼酸鈉產生錯合，再與 HP-β-CD 產生主客錯合物，此錯合物較原先分析物帶更更多負電且質量量增加，因而延長遷移 時間，提高分離離效率率率。當 HP-β-CD 濃度度到達 40 mM 時，會導致胞苷與雙甲基 鳥苷間的解析度度降降低，且遷移時間超過 7 分鐘，所以最後選擇 30 mM HP-β-CD 作為最佳化條件。
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圖五、緩衝溶液中不不同 HP-β-CD 濃度度分析核苷所得的毛細管電泳圖譜 Fig. 5 Electropherograms of nucleosides in buffer with various HP-β-CD concentrations
在固定濃度度的硼酸鹽（15mM）緩衝溶液、 pH 9.4、分離離電壓 16 kV、偵測波長 254 nm 的條件下，使用 (A) 0 mM、 (B) 10 mM、 (C) 20 mM、 (D) 30 mM、 (E) 40 mM，等不不同濃度度的 HP-β-CD 緩衝溶液分析六六種核苷標準品所得的電泳圖譜。
核苷分析物標示：(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine、(2) Adenosine、(3) Cytidine、
(4) N2,N2-dimethylguanine、(5) Uridine、(6) Inosine
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表六六、緩衝溶液中不不同 HP-β-CD 濃度度分析核苷所得的波峰高度度 Table 6. Effect of various HP-β-CD concentration in buffer on peak height of the six nucleoside standards
NR : non resolved
Peak height (mV)
HP-β-CD (mM) 0 10 20 30 40 8OHdG NR 7.37 6.11 5.88 6.17
A NR NR 5.67 5.64 5.64
C NR NR 3.18 3.22 3.20
m22G 7.73 7.44 6.89 6.71 6.56 U 5.29 5.01 4.85 4.72 4.56 I 7.04 0.84 6.52 6.39 6.02
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表七、緩衝溶液中不不同 HP-β-CD 濃度度分析核苷所得的分析物解析度度 Table 7. Effect of various HP-β-CD concentration in buffer on
resolution of the six nucleoside standards
NR : non resolved
Resolution
HP-β-CD (mM) 0 10 20 30 40
8OhdG/A NR NR 0.96 1.02 1.00
A/C NR NR 0.91 1.03 1.15
C/m22G NR NR 1.09 0.84 0.79
m22G/U 2.54 2.97 3.11 3.54 3.42 U/I 2.24 2.53 2.21 2.26 2.33
35
三、 pH 值對核苷分離離之影響
在毛細管電泳分離離的過程，緩衝溶液的 pH 值會影響電滲流流的大小，進而 影響整體遷移時間與分析物的解析度度。此外緩衝溶液的 pH 值對核苷本身的荷 電的情形也有不不同程度度的影響，進而影響核苷在毛細管內遷移的速度度，因此可藉 由調整pH值來來控制分析物間的分離離度度。而本實驗使用四硼酸鈉做為緩衝溶液，
與帶順式二醇的核苷間的錯合作用，更更深受 pH 值的影響。我們利利用 5 M HCl 和 5 M NaOH 調整緩衝溶液酸鹼度度至 9.2、9.25、9.3、9.4、9.5 等的五種 pH 值，
在 15 mM 四硼酸鈉緩衝溶液（含固定 30 mM 濃度度的 HP-β-CD）下進行行條件 探討，分析核苷標準品所得的波峰高度度與解析度度結果列列於表八、表九，而電泳圖 結果如圖六六所示。當 pH 值由 9.2 升至 9.5 時，整體遷移時間延長，推測是由 於核苷-硼酸鹽錯合物中的硼酸鹽之自由羥基離離子化（pKa = 9.2）[55]，而使得 整個錯合物更更具負電性，同時胞苷跟雙甲基鳥苷訊號的解析度度也隨之上升。當 pH 值低於 9.3 時，胞苷跟雙甲基鳥苷訊號一直無法分離離，直到 pH 值達 9.4 以 上時，才可分離離，而在 pH 9.5 的情況下，8-羥基去氧鳥苷與腺苷訊號有會有重 疊的現象。因此選擇 pH 9.4 為最佳分離離條件。
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圖六六、不不同 pH 值緩衝溶液分析核苷所得的毛細管電泳圖譜
Fig. 6 Electropherograms of nucleosides in various pH value of buffer
分析條件：15 mM 硼酸鹽緩衝溶液含 30 mM HP-β-CD、分離離電壓 16 kV、偵測 波長254 nm。使用(A) pH 9.2、 (B) pH 9.25、 (C) pH 9.3 、 (D) pH 9.4、 (E) pH 9.5，等不不同 pH 值的緩衝溶液，分析六六種核苷標準品所得的電泳圖譜。核苷分 析物標示：(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine、(2) Adenosine、(3) Cytidine、(4) N2,N2-dimethylguanine、(5) Uridine、(6) Inosine
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表八、不不同 pH 值緩衝溶液分析核苷所得的波峰高度度
Table 8. Effect of various pH value of buffer on peak height of the six nucleoside standards
NR : non resolved
Peak height (mV)
pH 9.20 9.25 9.30 9.40 9.50
8OHdG 7.38 7.15 7.17 6.88 6.04
A 5.92 5.64 5.73 5.34 5.54
C NR NR NR 3.00 3.27
m22G NR NR NR 7.46 6.56
U 4.58 4.54 4.55 4.50 4.48
I 6.31 6.23 6.30 6.33 6.20
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表九、不不同 pH 值緩衝溶液分析核苷所得的解析度度
Table 9. Effect of various pH value of buffer on resolution of the six nucleoside standards
NR : non resolved
Resolution
pH 9.20 9.25 9.30 9.40 9.50
8OhdG/A 1.23 1.14 1.10 0.78 0.56
A/C NR NR NR 1.00 0.95
C/m22G NR NR NR 1.43 1.32
m22G/U NR NR NR 3.18 3.34
U/I 2.00 1.85 2.09 2.05 2.00
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四、 樣品前處理理加入硼酸鹽溶液對核苷分離離之影響
除了了使用硼酸鹽緩衝溶液提高核苷的分離離效率率率，我們也嘗試在樣品前處裡裡階 段，於樣品中直接添加四硼酸鈉溶液，增加四硼酸鈉與核苷接觸反應的時間，期 望與樣品先形成穩定的錯合物，一旦上機進行行電泳時，再與緩衝溶液中 HP-β-CD 結合，形成內包錯合物，進而增加分離離效率率率。本實驗直接添加 0、2、4、6、8 mM 五種不不同濃度度的四硼酸鈉溶液至樣品中，然後探討其對核苷分離離之影響。分析核 苷標準品所得的波峰高度度與解析度度結果列列於表十、表十一。
如圖七所示，未添加四硼酸鈉溶液時，可發現 8-羥基去氧鳥苷和腺苷有訊 號重疊的現象。當樣品中添加 2 mM 的四硼酸鈉溶液時，可看出 8-羥基去氧鳥 苷和腺苷具有良良好的分離離效果。隨著添加的四硼酸鈉濃度度增加，會發生訊號強度度 降降低的現象，且解析度度也變差，如表十、表十一所示，因此選擇於樣品中添加 2 mM 的四硼酸鈉溶液作為最佳化條件。
綜合前述影響核苷分離離條件的實驗分析後，我們將所探討出的最佳化條件列列 於表十二。
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圖七、樣品前處理理加入不不同濃度度硼酸鹽溶液所得的核苷毛細管電泳圖譜 Fig. 7 Electropherograms of nucleosides with addition of various concentration of borate solution during sample pretreatment
分析條件：15 mM 硼酸鹽緩衝溶液（pH 9.4）含 30 mM HP-β-CD、分離離電壓 16 kV、偵測波長 254 nm。於樣品中添加 (A) 0 mM、 (B) 2 mM、 (C) 4 mM、 (D) 6 mM、 (E) 8 mM，等不不同濃度度的硼酸鹽溶液分析六六種核苷標準品所得的電泳圖 譜。核苷分析物標示：(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine、(2) Adenosine、(3) Cytidine、
(4) N2,N2-dimethylguanine、(5) Uridine、(6) Inosine
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表十、樣品前處理理加入不不同濃度度硼酸鹽溶液分析核苷所得的波峰高 度度
Table 10. Effect of addition of various concentration of borate solution during sample pretreatment on peak height of the six nucleoside standards
Peak height (mV) Sample pretreatment
borate (mM)
0 2 4 6 8
8OHdG 3.11 3.28 3.27 2.83 2.97 A 3.41 3.84 3.49 3.53 3.57 C 1.87 1.86 1.82 1.73 1.84 m22G 5.26 4.44 4.22 4.08 4.37 U 2.72 2.42 2.38 2.05 2.26 I 4.50 3.77 3.55 3.36 3.72
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表十一、樣品前處理理加入不不同濃度度硼酸鹽溶液分析核苷所得的解析 度度
Table 11. Effect of addition of various concentration of borate solution during sample pretreatment on resolution of the six nucleoside standards
Resolution Sample pretreatment
borate (mM)
0 2 4 8 10
8OhdG/A 1.01 1.52 1.18 1.33 1.33 A/C 1.57 1.84 1.42 1.70 1.57 C/m22G 2.36 2.36 2.24 2.23 1.89 m22G/U 7.34 7.87 6.96 7.34 6.37 U/I 4.60 4.72 4.72 4.84 4.29
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表十二、分離離核苷的最佳化條件
Table 12. Optimal conditions for separating nucleoside standards
Wavelength 254 nm
pH 9.4
HP-β-CD concentration 30 mM
Applied voltage 16 kV
Buffer concentration 15 mM borate solution
Sample preparation 2mM borate
Total length 60 cm (50 cm effective length) Capillary 75 μm i.d. and 375 μm o.d
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五、 緩衝溶液加入十二烷基硫硫酸鈉對核苷分離離之影響
表一中，有數數篇文獻報導過使用含 SDS 之緩衝溶液，以微胞電動力力毛細管 電層析法 （MEKC）分離離尿尿液中核苷 [27,45-47]，藉著分析物疏水性的差異異，
則進入 SDS 所形成的微胞的機會也不不同，可藉此增加分離離效率率率，同時伴隨遷移 時間的延長。
本研究一開始使用 SDS 以 MEKC 方式分離離胞苷、雙甲基鳥苷、尿尿苷、肌 苷等四種核苷標準品，並探討了了緩衝溶液 pH 值、硼酸鹽緩衝溶液的濃度度、SDS 的濃度度與分離離電壓對核苷分離離的影響，結果此方法的最佳化條件為 15 mM 硼酸 緩衝溶液 (pH 9.8)、添加 25 mM SDS、分離離電壓 16 kV。然而，使用此最佳化 MEKC 結合 SDS 的方法分析胞苷、腺苷、尿尿苷、肌苷、雙甲基鳥苷、8-羥基去 氧鳥苷等六六種核苷標準品時，卻無法分離離胞苷與腺苷，比對我們前述最佳化 HP-β-CD 與硼酸鹽緩衝溶液的方法 (表十二)，則可完全分離離此六六種核苷標準品，
結果如圖八所示。
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圖八、緩衝溶液添加 HP-β-CD 或十二烷基硫硫酸鈉，分析核苷的毛細管電泳圖譜 Fig. 8 Electropherograms of nucleosides with addition of HP-β-CD or SDS in borate buffer
分析條件：(A)15 mM 硼酸鹽緩衝溶液（pH 9.4）含 30 mM HP-β-CD，並於樣品 中添加2 mM 硼酸鹽溶液；(B) 15 mM 硼酸鹽緩衝溶液（pH 9.8）含 25 mM 十 二烷基硫硫酸鈉。兩兩者分離離電壓皆為16 kV，偵測波長皆為 254 nm，分析六六種核苷 標準品所得的電泳圖譜。核苷分析物標示：(1) 8-hydroxy-2-deoxyguanosine、(2) Adenosine、(3) Cytidine、(4) N2,N2-dimethylguanine、(5) Uridine、(6) Inosine
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六六、 樣品保存溫度度對核苷訊號之影響
核苷在 pH 值高於 5 的溶液中，很容易易會發生降降解的情形 [61,62]，此外 溫度度也可能會加速尿尿液檢體中核苷分解的情形。2007 年年，學者 Szymanska 就針 對 pH 5.2，pH 6.7，pH 7.4 等三種不不同酸鹼值的尿尿液，一組酸化至 pH 4 之後 保存於 －24℃，另一組則不不酸化尿尿液，直接保存於 －24℃ 下，並於第一、二、
三個月時，解凍檢測尿尿液檢體中核苷降降解的情況，結果發現不不論論有無酸化尿尿液，
核苷降降解的情況並無顯著差異異 (差異異性小於 10％) [47]，因此尿尿液中核苷毋須經 過酸化處理理，可於 －24℃ 下保存至少三個月。
大部分研究用尿尿液檢體收集，會經由醫院檢驗單位代為收集，分裝處理理，然 後置於 4℃ 冰箱，直到轉移到專門存放檢體的 －20℃ 或 －80℃ 冰箱。所以 尿尿液檢體有相當時間會處於室溫 （病人採集尿尿液後至檢驗單位處理理前）或 4℃
的情況下，因此本研究進一步探討，於室溫，4℃，－80℃ 情形下，尿尿液中核苷 訊號的變化。我們將兩兩位健康對照組受試者的尿尿液保存於室溫，4℃，－80℃ 等 三種溫度度下，並於 24 小時，72 小時，120 小時三個時間點，偵測尿尿液中肌苷 訊號變化情形，結果如圖九所示，三種保存溫度度在 24 小時內，訊號變化無顯著 差異異，而 4℃ 保存下，在 72 小時內，訊號無顯著下降降情形。
一般檢驗單位尿尿液檢體處理理流流程下，檢體大部分會存放於 4℃ 保存，因此 只要 72 小時內，將檢體轉存至研究檢體專用的 －80℃ 冰箱，即可減少核苷訊 號自然降降解造成的誤差。另一方面，這也表示若若要進行行大規模篩檢而有大量量的尿尿 液檢體時，可先將檢體冰存於當地簡易易的檢體冰箱 （4℃），然後 72 小時內低 溫宅宅配至實驗室研究檢體專用的 －80℃ 冰箱即可。
47
圖九、不不同檢體保存溫度度與尿尿液中核苷訊號的變化
Fig. 9 Urinary inosine degradation in various storage temperature
48
七、 方法確效
以 HP-β-CD 結合硼酸鹽緩衝溶液分離離核苷的最佳分離離條件如表十二所示。
應用此條件可在7分鐘內完全分離離六六種核苷。使用此最佳化條件分析六六種核苷標 準品的線性範圍，皆介於 3 μM ~ 500 μM 之間，如表十三所示。以訊號/雜訊比 為3 所對應的濃度度定義為偵測極限 LOD 時，則六六種核苷之 LOD 值分別是：
8-羥基去氧鳥苷為 1.47 μM ；腺苷為 1.31 μM ；胞苷為 1.12 μM ；N2,N2-雙甲 基鳥苷為 0.65 μM ；尿尿苷為 1.35 μM ；肌苷為 1.14 μM 。當訊號/雜訊比為 10 所對應的濃度度定義為定量量極限 LOQ 時，則六六種核苷之 LOQ 分別是：8-羥基去 氧鳥苷為 4.91 μM ；腺苷為 4.37 μM ；胞苷為 3.72 μM ；N2,N2-雙甲基鳥苷 為 2.17 μM ；尿尿苷為 4.50 μM ；肌苷為 3.81 μM 。同日間（Intraday）RSD 小 於2.25 %，且異異日間（interday）RSD 小於 2.81 %。
我們同時也使用標準品添加法測量量尿尿液樣品中核苷的回收率率率，結果其範圍介 於 86 ~ 110 % 之間（表十四），在 80 ~ 120% 可接受範圍之內。綜合以上之數數 據資料料顯示本研究所開發之方法再現性良良好，具有可靠性。
將本研究所開發出來來的方法與表一中其他毛細管電泳分析尿尿液核苷的研究 比較，本方法分離離時間短，且樣品不不需複雜的固相萃取之前處理理，而偵測極限也 不不亞於其他以紫外光偵測訊號的研究（表十五），因此有潛力力可應用於大量量實際 樣品的分析。
