人類的救星 – 基因療法 壹●前言:
現代醫學知識和生物科技的突飛猛進,對於基因療法得應用逐漸形成全球生技界 的大趨勢,為了突破天生基因上的障礙,科學家利用了基因療法來改變上天安排 的決定—使自己的人生不僅僅侷限在剛出生的那一刻。所謂得基因療法,就是將 正常的基因植入病人的細胞中,以代替原本缺陷的基因。此種療法早在 1990 年 第一次進行人體測試,發現對於治療怕金森氏症有效,後來又發現對於重症免疫 缺陷〈SCID,俗稱氣泡寶寶〉有效。因此現今基因療法的研究與實驗,其成果 將是一項重要的科學突破,意味著醫學的革命性時刻已經到來。
新時代的新契機—基因療法,深深的吸引了我們的注意,他的奇特功效原更是我 們百思不解的,在好奇心的驅使下,便選擇了「基因療法」來做小論文題目,希 望能對基因療法有進一步的認識。
貳●正文:
一、 基因療法的原理:
基因療法就是把一個新的基因放病人的細胞中,藉此替換缺失或異常的基因,從 而治療疾病的一種方法。研究人員一般是用病毒來攜帶這些遺傳物質進入細胞,
因為病毒就是演化成做這件事的,將自己得基因插入宿主的基因組中。(註一)
二、 基因療法的載體:
1. 反轉錄病毒載體:
這是目前使用最多的一種載體。雖然它是一種 RNA 病毒,但其生活史中會 經過反轉錄脢的作用而形成 DNA,並嵌入宿主染色體中。故其優點在於可 形成長效型 (long-term) 的基因存在及表現。這個病毒載體只能感染分裂的 細胞,故鮮能直接用在活體內 (in vivo),且不能應用到不分裂的組織或細胞 上。一般使用反轉錄病毒載體時,可將細胞拿到體外,經由載體轉殖基因後,
再將細胞送回活體內,這種做法稱為 ex vivo。這個病毒力價偏低,主要在 於其無法耐受體外離心濃縮等步驟。然而若將 vesicular stomatitis virus (VSV) 之套膜蛋白取代反轉錄病毒自己的套膜蛋白,形成所謂的 pseudo-typed retroviruses;則病毒顆粒變為穩定,可經離心濃縮,大大增加病毒力價,就
可應用在 in vivo。 針對不能感染不分裂細胞的部分,目前也由愛滋病毒載 體 (HIV vector) 的改良與使用,而可進行非分裂細胞的感染。
這些問題都解決後,目前最大的困難在於如何使帶入的基因表現受到適當的 調控,這可能是最難的部份。因為在遺傳性疾病的治療時,有些基因 (例如 糖尿病人中胰島素) 的表現是需嚴格調控的。分子生物學家必需找出最佳之 調控序列,並適當地放入載體內,使所轉殖的基因的確能發揮如同正常細胞 內的基因表現,的確是一項很大的挑戰。
2.腺病毒載體:
這是個 DNA 病毒,其力價可經離心濃縮而變得相當高,對分裂或不分裂的 細 胞均能感染,適合活體內使用,所以非常廣用。腺病毒載體最大的問題 在於引起強烈的免疫反應,造成病人有嚴重的發炎現象或副作用。免疫反應 也會清除病毒感染的細胞,造成基因表現都是非常短暫的。雖然第二代、第 三代的腺病毒載體已陸續問世,希望藉由剔除更多的病毒基因體部份以降低 病毒蛋白所帶來的免疫現象,這種強烈的免疫作用似乎仍不容易免除。前些 時候,在美國臨床實驗時,即有一名 18 歲青年因使用過高劑量之腺病毒載 體用以治療 ornithine transcarbamylase 基因缺陷 的疾病,而導致強烈、急性 的免疫反應,休克而死。故在使用腺病毒載體時,如何拿捏有效的劑量與避 免造成嚴重免疫反應的劑量中間,的確是一件不容易的事情。
故而腺病毒載體並不適合用來治療遺傳性疾病;但用在癌症上的治療和心臟 血管疾病的治療,卻可能還是很適合的。因為這些治療的目的都是希望殺掉 腫瘤細胞、或增生的平滑肌細胞,短時效的基因表現較沒有關係;而引發適 量的免疫反應,反而是有助於腫瘤細胞的清除。至少目前為止,腺病毒載體 用在癌症病人的臨床治療上,雖未見有明顯的治療成果,但至少尚未有任何 毒性或不良作用的報導。
3.腺衛星病毒載體:
這是個相當小的 DNA 病毒,但卻綜合了反轉錄病毒的特性 (會嵌入宿主染 色體),及腺病毒載體的特性 (會感染不分裂的細胞),而成為目前遺傳性疾 病基因療法的新寵。在使用這個病毒載體時,基本上病毒本身的蛋白基因部 份均已被剔除,故在宿主內也不會造成強烈的免疫反應,而可維持較長時段 的基因表現。而先前製備該病毒之步驟較繁瑣,且病毒力價偏低,目前也已 一一克服,其力價也可高達 1010~1013 cfu/mL,故非常適合用於活體內。唯 一較難克服的是:它是一個很小的 DNA 病毒,故基因容量是很有限的。
4. 微脂粒及 DNA 肌肉注射:
為避免病毒載體可能引起之危險性及副作用,有些學者利用微脂粒包裹 DNA,直接送入細胞或組織。這種微脂粒可再加以改良,譬如帶有特異性抗 體,或帶有一些配位體 (ligand ),則更可增加輸送 DNA 至特定細胞之專一 性。然而目前微脂粒轉殖 DNA 的效率並不高,且進去後的 DNA 多半在 endosome 內即被分解,真正能進入到核內表現的 DNA 很有限。整體而言,
藉由微脂粒法之基因治療成效有限。微脂粒在血液內之穩定性也是一件值得 考慮的事項。但這些缺點將會逐一被克服。
肌肉細胞有一特性,即會自動吞入 DNA。因此有人利用注射方法,將 DNA 帶入肌肉細胞附近,DNA 即會被吞入,並加以表現。雖然一般而言,它的 表現量並不會很高,但卻足以引發很好的免疫反應。甚且能造成很好的細胞 性免疫反應,這對清除病毒或腫瘤細胞而言都是非常有用的。故而最近利用 DNA 注射來引發預防性,甚且治療性的免疫作用,是一大熱門的研究方向。
(註二)
三、 以基因療法來治療腫瘤:
1. 引入抑癌(tumor suppressor)或細胞凋亡(apoptosis)基因:
腫瘤細胞最常見抑癌基因表現缺失的如 p53,RB1,BRCA1 等。實驗中證實將 野生型 (wild-type) 的這些基因送回這類的腫瘤細胞中,確實會造成腫瘤細胞 停滯在細胞週期的某一點或產生凋亡;或迫使細胞對傳統之化療或放射線療 法更為敏感。臨床試驗利用腺病毒載體進行 p53 基因治療例子中,的確在幾 位患有非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer)病患中看到有部份反應或保 持病情在穩定的階段,證明這個策略是可行的。〈註三〉
2. 引入自殺基因:
這個觀念是將自殺基因(suicide gene)特別地引入腫瘤細胞內,而不進入正常 的細胞內,然後再處以特殊藥物。這些藥物經由自殺基因產物的作用而成為 有毒的代謝物,故會將表現自殺基因產物的腫瘤細胞殺死。最典型的例子就 是一些疹病毒之 thymidine kinase(HSV-tk)基因。這些病毒 tk 酵素會將一些 核酸類似物,例如 ganciclovir(GCV)或 acyclovir(ACV)進行磷酸化,導致 這類產物得以被用為合成 DNA,造成 DNA 複製的終止,細胞於是死亡。但 一般哺乳動物細胞內的 tk 酵素則不具此能力,故不受 GCV 或 ACV 處理的影 響。若是我們能將此 HSV-tk 只帶入腫瘤細胞內,而不到正常細胞內,則 GCV 的處理當然只會殺死腫瘤細胞。至於如何只將 tk 基因帶入腫瘤細胞而非正常 細胞,則視腫瘤種類、基因轉殖方式而定。最有名的例子是利用反轉錄病毒 載體攜帶 HSV-tk 基因進入腦瘤細胞。由於腫瘤細胞會不斷分裂,而一般腦細 胞均屬不分裂狀態,以反轉錄病毒只能感染分裂細胞的特性,是故腦瘤細胞 可被選擇性地消滅,而且由於有所謂的旁觀者效應(bystander effect),事實
上,雖然未必每個腫瘤細胞都被帶入 HSV-tk 基因,但是腦瘤細胞被清除的效 果卻出奇得好。〈註四〉
3. 使用抗血管生成因子(anti-angiogenic factor):
大部分腫瘤的生長都需要靠大量新生的血管來提供養份,故攻擊血管的生成 或許可成為一個治療腫瘤的良好方式。利用轉殖技術我們可以導入一些基因 來抑制血管的新生,或者破壞既有的血管,而達到抑制腫瘤生長的效果。這 種治療策略的例子包括利用反意(anti-sense)RNA 分子來降低血管內皮細胞 生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表現,或直接導入抗血管 生成因子的基因,例如 angiostatin 或 endostatin。然而這種治療策略需有很好的 轉殖技術或較長的表現時間,才能夠達到較佳的效果。
4. 使用免疫調控基因:
腫瘤之所以形成,就代表免疫系統無視於它的存在。利用基因療法企圖增強 免疫機制,則是希望達到積極性的免疫刺激,使免疫系統能重新認識腫瘤的 存在而加以清除。有人利用細胞激素(cytokine, 如 IL-2,IL-12,GM-CSF 等)、
輔助刺激分子(co-stimulatory molecule,如 B7),或主要組織相容性(major histocompatibility,MHC)等的基因來改造腫瘤細胞,將之做成為腫瘤細胞疫苗,
用以免疫宿主,期能重新刺激活化起宿主的免疫系統。不過目前實驗結果發 現,這類免疫療法對小腫瘤效果非常良好,且往往在宿主體內產生全身性、
長效型的免疫反應,可預防腫瘤再復發。但對於大的腫瘤,則完全沒有治療 的效果。歸究其原因,可能是有些大腫瘤已失去 MHC 分子的表現,故不會被 T 細胞所辨識,或者這些大腫瘤可能會釋放一些免疫抑制因子
(immunosuppressive factors),抑制了免疫反應作用。基於如此,這類策略在 臨床上對較為末期的癌症病患而言,可能是無法發揮作用的。唯有將免疫基 因療法與其他基因治療策略或傳統療法合併使用,或許還可提供成為「佐劑」
的效果,延長或增強其他類療法的治療效果及時效。另一則想辦法將免疫活 化能力再提高,俾能打破大腫瘤在宿主體內所造成的免疫耐受性。樹狀突細 胞(dendritic cells, DC)的研發或許可提供一個方向。目前 DC 在體外培養的 技術已臻純熟,不少人即將腫瘤抗原直接交賦 DC 呈現,以增強 T 細胞的活 化。同時並也引入一些細胞激素的基因(例如 IL-12 或 GM-CSF),希望發揮 更強之免疫佐劑功能。這種作法遠比將細胞激素基因送入腫瘤細胞內更為有 效。未來或許還可再研發一些其他類的免疫調控分子,適當地在樹狀突細胞 內表現,使樹狀突細胞在吞噬腫瘤抗原後,能更有效地成熟,以及移動至淋 巴器官去活化 T 細胞。
5. 利用複製型 oncolytic 病毒殺死腫瘤:
病毒在細胞內大量複製的結果可能就是造成細胞走向細胞凋亡,或產生裂解
而釋放出大量的病毒。利用病毒這種特性來消滅腫瘤細胞,並不是什麼新的 想法,但是如何有效地,選擇性地只殺死腫瘤細胞而不會殺死正常細胞,則 是在最近基因治療載體開發過程中又重新被重視及研究。最有名的例子即是 最近一株 E1B 缺陷的腺病毒(ONYX-015/dl1520)被發現在
p53 缺失或 p53 訊息傳導有缺陷之腫瘤細胞內具有大量複製的能力,而在 p53 正常之細胞中則沒有複製的能力。利用這種特性,ONYX-015 被發現可以非常 有效消滅多種腫瘤,例如頭頸腫瘤、脾臟腫瘤,卵巢癌等。若再搭配傳統之 化療(例如 cisplatin 及 5-FU),則治療效果更是奇佳。然而病毒這種具有複 製及裂解細胞的能力可能不太具有專一性,如此就會造成使用上安全性的疑 慮。故有人在此類病毒載體上再加以改造,使其更具有腫瘤標的性的效果;
也有人使其帶有自殺基因、免疫調控基因等,企圖綜合各種基因治療策略於 一身。相信,如此一來,利用基因療法來治療腫瘤就會更有希望了。除了腺 病毒外,也有一些其他病毒,如 herpes simplex virus,Newcastle disease virus, reovirus,或 vesicular stomatitis virus(VSV)可能也有類似的效果,只是其造成 細胞死亡的機制可能是不一樣的。〈註五〉
四、案例
1. 科學家利用基因療法讓患上相當於人類一種罕見失明的盲犬重見光明。這種 方法可能可以用於治療幼兒的「萊柏氏先天黑內障」。賓州大學醫學中心在患 有「萊柏氏先天黑內障」的狗身上開始實驗。最後仍能夠在視覺工作中表現正 常,這說明該結果是可以持續的。〈註六〉
2. 用一種叫「神經成長因素」進行的基因療法可以協助恢复因老化而破坏的 腦細胞的連結,這項發現支持一項构想:基因療法醫治老人疑呆症可能有效。
猴子腦部接受基因工程細胞移植。這种基因工程細胞會產生「神經成長因 素」。調查人員發現,猴子接受「神經成長因素」移植後,原先腦部細胞軸 突之間因老化而變差的連結會顯示出「重大轉變」,軸突的密度會恢复到相 當于九點五歲的健康猴子的軸突般,這個年齡換算成人類,相當于廿歲的小 夥子。 〈註七〉
3. 一位年青(36 歲)而且相對健康的女子﹐在治療中死亡。美國食品藥品管理局 (FDA)已叫停西雅圖 Targeted Genetics 公司的這項研究﹐並正在評估國內其他 28 項此類研究的安全性。
4. 2000年4月﹐法國科學家在《科學》週刊上宣佈﹐他們用基因療法治 療了數名“氣泡兒童”。法國傳出罹患嚴重複合性免疫缺陷症(SCID)的幼 兒接受基因療法,有一名在嬰兒時期參與基因療法試驗而痊癒的泡泡兒,三 個月前死於類似白血病的症狀 ,年僅三歲,是第一位因基因療法死亡的病
患。後來一九九九年一名十八歲的美國男子接受基因療法治療一種罕見肝臟 病變而死亡。 〈註八〉
参●結論:
隨著醫療和生物科技進步,基因療法是一個重大的研究,加上技術的進步,
基因療法更能取得更大的進展,並得以廣泛應用。其治療對象現已包括血友 病、嚴重貧血、關節炎、心血管病、癌症,甚至愛滋病等 15 種以上之疑難 雜症,但經由案例可知,這項技術還是要謹慎使用,科學家已將療法用於動 物試驗獲得成功,預計在不久將來必定可應用在臨床上。我想這種未來技術 真的純熟之後,對患者將是莫大的福音,但缺點是不易掌控媒介作用,而且 重組 DNA 序列可能到處散佈或污染到胚源細胞。所以未來這套基因療法要 用於人類時,其配套措施的完善將是基因療法能否發揮得淋漓盡致的關鍵。
肆●引註資料:
註一:基因治療如何發揮作用。科學人。79 期刊。122 頁。
註二:生物醫學報導。
http://www.cbt.ntu.edu.tw/General/BioMed/Biomed1/Biomed1Huang.htm。2008/07/24。
註三:行政院及各所屬機關出國報告題要
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第 14 屆歐洲基因治療學會年會參加 報告註四:基因治療。
http://ecaaser3.ecaa.ntu.edu.tw/weifang/lifescience/%B0%F2%A6]%AAv%C0%F8.html
。2008/07/24。
註五:基因療法報告 –黃麗華-台大醫學院 肝炎中心教授
註六:科學傳聲筒。http://scc.bookzone.com.tw/sccd/news.asp?ser=365。2008/07/24。
註七:中央社 –大紀元 2 月 13 日訊。
註八:路易社 -5 月 24 日。