中華民國第五十一屆中小學科展展覽會
作品說明書
科別：生物科
組別：高中組
作品名稱：當晶片來鍬門 ─ 鍬形蟲之生物晶片鑑定
關鍵詞：鍬形蟲、生物晶片、種類鑑定
編號：
摘要
鍬形蟲之生活史，包含四個時期，即卵、幼蟲、蛹與成蟲期。傳統上，各時期之外部形 態特徵是作為分類與鑑定之主要依據；然而鍬形蟲在這四個時期，特別是在卵與幼蟲期之外 部形態作鑑定是較為困難的。因此本研究探討以五種台灣常見的鍬形蟲，包括台灣扁鍬形蟲 (Dorcus titanus sika)、鬼艷鍬形蟲(
Odontolabis siva parryi
)、兩點鋸鍬形蟲(Prosopocoilus astacoides blanchardi
)、鹿角鍬形蟲(Rhaetulus crenatus crenatus
)及雞冠細身鍬形蟲(Cyclommatus mniszechi
) 萃取蟲體 DNA 並選取特定基因片段即核糖體細胞色素氧化酶 I （cytochrome oxidase I, COI）基因進行序列比對，再針對每種蟲之特異區段設計四組具種專一性之探針，經由專一性探針 與測試樣本 DNA 進行雜合反應，藉由晶片上所呈現之色斑進行結果之判定。此套生物晶片系 統具有高度專一性與靈敏度，並且可以在 5~6 小時內完成檢定結果。
壹、 研究動機
為避免進出口商品所可能夾雜的害蟲入侵，各檢疫單位會對於商品特別是農產品的進出 口進行檢驗，以防止境外害蟲入侵進而對我國之農作物與生態造成危害；列名我國重要防檢 疫害蟲名單中，以雙翅目之果實蠅類與鱗翅目為其中受重視的一群。檢疫過程中，一旦攔截 到疑似檢疫害蟲，便會將樣本送至各單位進行害蟲種類鑑定；對於檢疫害蟲鑑定，長久都是 利用傳統之外部形態鑑定，然而害蟲外部形態特徵鑑定需要由具有經驗之鑑識人員加以判 定，對於機場或港口之檢疫人員則為較困難的工作，甚至所發現之害蟲僅剩殘肢碎片或是較 難鑑定之時期，反而會使種類鑑定工作更困難。為了掌握檢疫時效與確保貨品的經濟利益，
必須開發出準確性高、速度快且操作簡單之鑑定技術。而這準確又快速的鑑定技術引起本小 組之極大興趣，進一步了解到目前防檢局使用的技術正是台灣生物科技之明星產業－生物晶 片。
得知此項技術後，我們希望把生物晶片技術應用在近幾年來的熱門寵物鍬形蟲上。本小組 了解到鍬形蟲在幼蟲期之外部形態特徵難以區辨，而成蟲外部形態有時候也不容易分辨。在 傳統的形態鑑定上，分辨幼蟲首先以體型大致列出可能種類外，另外則可比對三齡幼蟲肛毛 之特徵，然而幼蟲期要以肛毛分辨須等到三齡，體型太小的幼蟲也不易鑑定，野生幼蟲活動 量比人工飼育高，肛毛的磨損也使得原本該存在的部份不完整，鑑定上容易遇上瓶頸；而成 蟲則可從大顎、齒突、頭楯、眼緣凸起、鞘翅、錘節、腿節、跗節、鞘翅、前胸背板、前胸 腹板、中胸腹板和後胸腹板等身體各處特徵進行形態鑑定，雄蟲之外型形態特徵會隨著個體 大小而有些差異，有些特徵例如齒突會因為太小而不清楚，甚至無法表現；雌蟲方面則會因 物種的親緣關係過於相近，外部特徵需由有經驗的人員進行鑑定，而一般未經訓練之人員則 較難以進行種類之鑑定。以外部形態來區分物種並藉此建立一套分類地位，更進一步以此分 類學作為鑑定之依據，至今承接前人的研究有一套完整的分類與鑑定圖鑑，然而於台灣具有 此經驗之專業人員本身就不多，並且隨著時間的流逝，這些專業人員的承接也開始下降。而 我們了解到以傳統鑑定方法與分子鑑定方法相輔相成，更能快速準確建立一套快速檢測此類 蟲種之方法與標準操作流程。此套生物晶片具有一次篩選多種蟲種的優點，此外，本套生物 晶片應用簡單且快速，凡經過訓練之人員皆可簡單操作並輕鬆上手。
本研究基於此概念，先以台灣五種常見鍬形蟲，包括台灣扁鍬形蟲(
Dorcus titanus sika
)、鬼艷鍬形蟲(
Odontolabis siva parryi
)、兩點鋸鍬形蟲(Prosopocoilus astacoides blanchardi
)、鹿角鍬 形蟲(Rhaetulus crenatus crenatus
)及雞冠細身鍬形蟲(Cyclommatus mniszechi
)先行經過形態鑑定 確認後，以這些樣本進行粒線體細胞色素氧化酶 I（COI）基因區段 DNA 序列之分析，並配 合開發一套具區辨害蟲種類之生物晶片系統，以建立快速檢測此五種鍬形蟲之方法與標準操 作流程。我們希望這項研究完成後可以與形態鑑定一同提供國內有心保育的人員、專業保育 人員及學者來調查鍬形蟲的分布及生態，進而保護近年因捕抓壓力大和棲地破壞而數量銳減 的鍬形蟲。貳、研究目的
本小組綜合玩家手中及大自然中最常見的五種鍬形蟲，並挑選其作為實驗對象，抽取其 DNA 加以設計專一性探針。
一、分別抽取五種鍬形蟲的 DNA 並加以純化和定序。
二、比較此五種鍬形蟲在基因上的接近程度。
三、對此五種樣本，進行粒線體細胞色素氧化酶 I（COI）基因區段 DNA 序列之分析並設計 具種專一性探針。
四、用實驗中的樣本、其它同種與不同物種之 DNA，測試此晶片系統是否有問題。
參、研究設備及器材
一、 實驗昆蟲
台灣扁鍬形蟲(Dorcus titanus sika)、鬼艷鍬形蟲(
Odontolabis siva parryi
)、兩點鋸鍬形蟲 (Prosopocoilus astacoides blanchardi
)、鹿角鍬形蟲(Rhaetulus crenatus crenatus
)及雞冠細身鍬形蟲 (Cyclommatus mniszechi
)二、 實驗藥品及配方
Nuclei Lysis Solution、RNAse Solution、Protein Precipitation Solution、isopropanol、ethanol、
、 、 、 、 、Tag 、
X
10 Buffer dNTP MgCl 2 Pr imer 670 Pr imer 1280
2X
60 Buffer
imer Pr
X 5 .
、
Vector
、、 、 、 、 、 、 rTag 、
、 、BufferP 、 、BufferPB、BufferPE、 TBE、hybridization buffer、wash buffer、blocking buffer、strep-AP、detection buffer、NBT/BCIP
−
Tag medium Ligase LB
Competent BufferP
cells 10 X Buffer
2BufferN
dNTP Pr imer sp T 7
1 3
三、實驗設備 (一)手動點片機
(圖一) (圖二) (二)實驗耗材與器材
加熱器、PCR 機器、4℃冰箱、烘箱、無菌操作台、離心機、造膠器、照膠器、-80℃冰箱、1000
μ
l 微量滴管、200μ
l微量滴管、20μ
l微量滴管、2μ
l微量滴管肆、研究過程或方法
一、樣本抽取及保存 (一)抽取的方式
在昆蟲的腹部以 T 字行切開，從體內取出約 2~3mm
3
的組織，放入 1.5ml 的 tube 中。(二)保存的方式
將昆蟲樣本放入裝有 99.5％酒精的玻璃瓶中，用石蠟紙纏繞並封住瓶口。
二、 實驗程序
實驗一、
前置作業
台灣扁鍬形蟲
Dorcus titanus sika
鹿角鍬形蟲
Rhaetulus crenatus crenatus
鬼艷鍬形蟲
Odontolabis siva parryi
兩點鋸鍬形蟲
Prosopocoilus astacoides
blanchardi
雞冠細身鍬形蟲Cyclommatus mniszechi
抽DNA
跑PCR
Vector Ligation
Transformation
篩clone
篩(養菌)
抽Plasmid 定序
目的：取得序列設計探針 二、 實驗程序二、 實驗程序
實驗一、
前置作業
台灣扁鍬形蟲
Dorcus titanus sika
鹿角鍬形蟲
Rhaetulus crenatus crenatus
鬼艷鍬形蟲
Odontolabis siva parryi
兩點鋸鍬形蟲
Prosopocoilus astacoides
blanchardi
雞冠細身鍬形蟲Cyclommatus mniszechi
台灣扁鍬形蟲
Dorcus titanus sika
鹿角鍬形蟲
Rhaetulus crenatus crenatus
鬼艷鍬形蟲
Odontolabis siva parryi
兩點鋸鍬形蟲
Prosopocoilus astacoides
blanchardi
抽DNA
雞冠細身鍬形蟲
Cyclommatus mniszechi
跑PCR
Vector Ligation
Transformation
篩clone
篩(養菌)
抽Plasmid
實驗一、
前置作業
定序
目的：取得序列設計探針
實驗二、
製作晶片
濃縮探針溶液
點片
Post Wash
Hybridization
Blocking
Detection
目的：快速準確分辨昆蟲 實驗二、
製作晶片
濃縮探針溶液
點片
Post Wash
Hybridization
Blocking
Detection
目的：快速準確分辨昆蟲
實驗二、
製作晶片
實驗三、
測試晶片
台灣扁鍬形蟲
Dorcus titanus sika
鹿角鍬形蟲
Rhaetulus crenatus crenatus
鬼艷鍬形蟲
Odontolabis siva parryi
兩點鋸鍬形蟲
Prosopocoilus astacoides
blanchardi
雞冠細身鍬形蟲Cyclommatus mniszechi
快抽DNA
跑PCR
跑電泳
試晶片
看結果
目的：確認晶片是否可用 實驗三、
測試晶片
台灣扁鍬形蟲
Dorcus titanus sika
鹿角鍬形蟲
Rhaetulus crenatus crenatus
鬼艷鍬形蟲
Odontolabis siva parryi
兩點鋸鍬形蟲
Prosopocoilus astacoides
blanchardi
雞冠細身鍬形蟲Cyclommatus mniszechi
快抽DNA
跑PCR
跑電泳
試晶片
看結果
目的：確認晶片是否可用
實驗三、
測試晶片
三、 實驗方法 三、 實驗方法
(一)抽DNA (一)抽DNA
(一)抽 DNA 三、 實驗方法
加入600 μl的Nuclei Lysis Solution研磨
加入3 μl的RNAse Solution，放入37℃加熱30分鐘，常溫冷卻5分鐘 加入200 μl的Protein Precipitation Solution，用Vortex震盪均勻，置冰5分鐘
置入新的1.5 ml tube，並加入600 μl的 isopropanol
加入600 μl 70％的ethanol混勻
移除ethanol，並用冷凍乾燥機風乾pellet 10分鐘 拿1.5 ml的tube
加入3種Solution
以16000g轉速、4℃ 離心5分鐘
取上清液至少650 μl
置冰15分鐘，以16000g轉速、4℃ 離心15分鐘
去除上清液
以16000g轉速、4℃ 離心5分鐘
加入30~50 μl的水 用電腦測濃度以檢驗
拿1.5 ml的tube
加入600 μl的Nuclei Lysis Solution研磨
加入3 μl的RNAse Solution，放入37℃加熱30分鐘，常溫冷卻5分鐘 加入200 μl的Protein Precipitation Solution，用Vortex震盪均勻，置冰5分鐘
置入新的1.5 ml tube，並加入600 μl的 isopropanol
加入600 μl 70％的ethanol混勻
移除ethanol，並用冷凍乾燥機風乾pellet 10分鐘 加入3種Solution
以16000g轉速、4℃ 離心5分鐘
取上清液至少650 μl
置冰15分鐘，以16000g轉速、4℃ 離心15分鐘
去除上清液
以16000g轉速、4℃ 離心5分鐘
加入30~50 μl的水 用電腦測濃度以檢驗
拿1.5 ml的tube
加入600 μl的Nuclei Lysis Solution研磨 加入600 μl的Nuclei Lysis Solution研磨
加入3 μl的RNAse Solution，放入37℃加熱30分鐘，常溫冷卻5分鐘 加入3 μl的RNAse Solution，放入37℃加熱30分鐘，常溫冷卻5分鐘 加入3種Solution
加入200 μl的Protein Precipitation Solution，用Vortex震盪均勻，置冰5分鐘 加入200 μl的Protein Precipitation Solution，用Vortex震盪均勻，置冰5分鐘
以16000g轉速、4℃ 離心5分鐘
取上清液至少650 μl 置入新的1.5 ml tube，並加入600 μl的 isopropanol
置冰15分鐘，以16000g轉速、4℃ 離心15分鐘
加入600 μl 70％的ethanol混勻 去除上清液
以16000g轉速、4℃ 離心5分鐘 移除ethanol，並用冷凍乾燥機風乾pellet 10分鐘
加入30~50 μl的水 用電腦測濃度以檢驗
(二)快抽DNA
取組織(小) 置入0.6 ml tube，加入200 μl的水洗淨約5分鐘，再吸起200 μl的水
拿Solution 1A 32 μl 和1B 8 μl，並置冰上
研磨 加防爆蓋，放入94℃加熱30分鐘
回溫 加入Solution 2 10 μl ，用小型離心機離心約30秒
取上清DNA
電泳看結果 (二)快抽DNA
取組織(小) 置入0.6 ml tube，加入200 μl的水洗淨約5分鐘，再吸起200 μl的水
拿Solution 1A 32 μl 和1B 8 μl，並置冰上
研磨 加防爆蓋，放入94℃加熱30分鐘
回溫 加入Solution 2 10 μl ，用小型離心機離心約30秒
取上清DNA
取組織(小) 置入0.6 ml tube，加入200 μl的水洗淨約5分鐘，再吸起200 μl的水
拿Solution 1A 32 μl 和1B 8 μl，並置冰上
加防爆蓋，放入94℃加熱30分鐘 研磨
加入Solution 2 10 μl ，用小型離心機離心約30秒 回溫
取上清DNA
電泳看結果 電泳看結果
(三)PCR
加藥品 50μl
放進機器
水 28.1μl 10X Buffer 5μl dNTP 4μl MgCl2 1.5μl
Primer670 2.5μl Primer1280 2.5μl Tag 0.4μl
DNA 6μl
設定
94℃
94℃ 44℃ 72℃ 72℃ 4℃
2’ 40’’ 1’15’’ 40’’ 10’ ∞
30cycles (三)PCR
加藥品 50μl
水 28.1μl
放進機器
10X Buffer 5μl dNTP 4μl MgCl2 1.5μl
Primer670 2.5μl Primer1280 2.5μl Tag 0.4μl
DNA 6μl
設定
94℃
94℃ 44℃ 72℃ 72℃ 4℃
2’ 40’’ 1’15’’ 40’’ 10’ ∞
30cycles 加藥品 50μl
水 28.1μl
放進機器
水 28.1μl 10X Buffer 5μl dNTP 4μl MgCl2 1.5μl
Primer670 2.5μl Primer1280 2.5μl Tag 0.4μl
DNA 6μl 10X Buffer 5μl dNTP 4μl MgCl2 1.5μl
Primer670 2.5μl Primer1280 2.5μl Tag 0.4μl
DNA 6μl
設定
94℃
94℃ 44℃ 72℃ 72℃ 4℃
2’ 40’’ 1’15’’ 40’’ 10’ ∞
94℃
94℃ 44℃ 72℃ 72℃ 4℃
2’ 40’’ 1’15’’ 40’’ 10’ ∞
30cycles
(三)PCR (二)快抽 DNA
(四)Vector Ligation
加藥品 10μl
2X Buffer 5μl
Vector 1μl Ligase─Tag 1μl PCR產物 3μl
放入4℃冰箱一晚 (四)Vector Ligation
加藥品 10μl
2X Buffer 5μl
Vector 1μl Ligase─Tag 1μl PCR產物 3μl
放入4℃冰箱一晚 加藥品 10μl
2X Buffer 5μl
Vector 1μl Ligase─Tag 1μl PCR產物 3μl 2X Buffer 5μl
Vector 1μl Ligase─Tag 1μl PCR產物 3μl
放入4℃冰箱一晚
(五)Transformation(在冰上操作)
2小時前拿Plate到烘箱(37℃)，並開加熱器42℃
拿冰和Ligation產物和 Competent cells 50μl (置冰)
大約回融1/3後，加入Ligation產物 5μl ，稍微混勻，置冰30秒
加熱42℃ 45秒(不能delay) 置冰20分鐘
無 菌 操 作 台 內 塗Plate(X─gal 40μl以及IPTG 40μl )，塗均勻
等20分鐘
塗Competent cells 30μl ~40μl，塗均勻 將Plate放入37℃烘箱內約14~15個小時 (五)Transformation(在冰上操作)
2小時前拿Plate到烘箱(37℃)，並開加熱器42℃
拿冰和Ligation產物和 Competent cells 50μl (置冰)
大約回融1/3後，加入Ligation產物 5μl ，稍微混勻，置冰30秒
加熱42℃ 45秒(不能delay) 置冰20分鐘
無 菌 操 作 台 內 塗Plate(X─gal 40μl以及IPTG 40μl )，塗均勻
等20分鐘
塗Competent cells 30μl ~40μl，塗均勻 2小時前拿Plate到烘箱(37℃)，並開加熱器42℃
拿冰和Ligation產物和 Competent cells 50μl (置冰)
大約回融1/3後，加入Ligation產物 5μl ，稍微混勻，置冰30秒
將Plate放入37℃烘箱內約14~15個小時
加熱42℃ 45秒(不能delay) 置冰20分鐘
無 菌 操 作 台 內 塗Plate(X─gal 40μl以及IPTG 40μl )，塗均勻
等20分鐘
塗Competent cells 30μl ~40μl，塗均勻 塗Plate(X─gal 40μl以及IPTG 40μl )，塗均勻 等20分鐘
塗Competent cells 30μl ~40μl，塗均勻 將Plate放入37℃烘箱內約14~15個小時
(五)Transformation(在冰上操作) (四) Ligation
將Plate放入37℃烘箱內約14~15個小時
(六)篩clone
一進實驗室就先拿新的Plate放烘箱
拿0.6μl tube
加藥品 100μl
10X Buffer 10μl dNTP 2μl Primer sp6 1μl
Primer T7 1μl rTag 1μl
水 85μl (六)篩clone
一進實驗室就先拿新的Plate放烘箱
拿0.6μl tube
加藥品 100μl
10X Buffer 10μl dNTP 2μl Primer sp6 1μl
Primer T7 1μl rTag 1μl
水 85μl
(七)養菌
放入37℃轉速225的烘箱17~18個小時 拿養菌管、LB medium(Amp+)抗生素
準備鐵架、牙籤
從烘箱裡拿篩clone保種後的Plate
將4㏄的LB medium倒入養菌管中
用牙籤挑起保種Plate中有圈的clone，和牙籤一起丟入養菌管內 (七)養菌
拿養菌管、LB medium(Amp+)抗生素
放入37℃轉速225的烘箱17~18個小時 準備鐵架、牙籤
從烘箱裡拿篩clone保種後的Plate
將4㏄的LB medium倒入養菌管中
用牙籤挑起保種Plate中有圈的clone，和牙籤一起丟入養菌管內 拿養菌管、LB medium(Amp+)抗生素
準備鐵架、牙籤
從烘箱裡拿篩clone保種後的Plate
將4㏄的LB medium倒入養菌管中
用牙籤挑起保種Plate中有圈的clone，和牙籤一起丟入養菌管內
(七)養菌 (六)篩 clone
放入37℃轉速225的烘箱17~18個小時
(八)抽Plasmid(質體)
加入50μl的水，靜置4分鐘，離心5分鐘
拿2ml的tube，分次離心(3分鐘)養菌管內的溶液
倒掉上清液，只留下pellet
加入250μl的BufferP1，用Vortex震盪 加入250μl的BufferP2(鹼性)，緩慢搖勻 加入350μl的BufferN3(酸性)，緩慢搖勻 離心機以轉速13000rpm離心10分鐘
將上清液倒入新拿的雙重tube，再離心1分鐘 加藥品
加藥品 加入500μl的BufferPB(Binding Buffer)，離心1分鐘
加入750μl的BufferPE(洗去雜質)，離心1分鐘後，倒掉下管容液
空轉離心2分鐘
下管丟掉，上管安裝到新1.5ml的tube (八)抽Plasmid(質體)
加入50μl的水，靜置4分鐘，離心5分鐘
拿2ml的tube，分次離心(3分鐘)養菌管內的溶液
倒掉上清液，只留下pellet
加入250μl的BufferP1，用Vortex震盪 加入250μl的BufferP2(鹼性)，緩慢搖勻 加入350μl的BufferN3(酸性)，緩慢搖勻 離心機以轉速13000rpm離心10分鐘
將上清液倒入新拿的雙重tube，再離心1分鐘 加藥品
加藥品 加入500μl的BufferPB(Binding Buffer)，離心1分鐘
加入750μl的BufferPE(洗去雜質)，離心1分鐘後，倒掉下管容液
空轉離心2分鐘
下管丟掉，上管安裝到新1.5ml的tube
加入50μl的水，靜置4分鐘，離心5分鐘
拿2ml的tube，分次離心(3分鐘)養菌管內的溶液
倒掉上清液，只留下pellet
加入250μl的BufferP1，用Vortex震盪 加入250μl的BufferP2(鹼性)，緩慢搖勻 加入350μl的BufferN3(酸性)，緩慢搖勻 加入250μl的BufferP1，用Vortex震盪 加入250μl的BufferP2(鹼性)，緩慢搖勻 加入350μl的BufferN3(酸性)，緩慢搖勻 離心機以轉速13000rpm離心10分鐘
將上清液倒入新拿的雙重tube，再離心1分鐘 加藥品
加藥品 加入500μl的BufferPB(Binding Buffer)，離心1分鐘
加入750μl的BufferPE(洗去雜質)，離心1分鐘後，倒掉下管容液 加入500μl的BufferPB(Binding Buffer)，離心1分鐘
加入750μl的BufferPE(洗去雜質)，離心1分鐘後，倒掉下管容液
空轉離心2分鐘
下管丟掉，上管安裝到新1.5ml的tube
(九)電泳(快抽DNA, PCR, 篩clone)
造膠 1倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.2g的Agarose 1.5倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.3g的Agarose
1倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.4g的Agarose 1.5倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.6g的Agarose Load膠
加入4~5μl的PCR產物和1μl的dye 跑膠
下面至倒數第四格
放入EtBr 8秒(砍進DNA)染膠
拿起再放入RO水至少30分鐘使之退染 (九)電泳(快抽DNA, PCR, 篩clone)
造膠 1倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.2g的Agarose 1.5倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.3g的Agarose
1倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.4g的Agarose 1.5倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.6g的Agarose Load膠
加入4~5μl的PCR產物和1μl的dye 跑膠
下面至倒數第四格
放入EtBr 8秒(砍進DNA)染膠
拿起再放入RO水至少30分鐘使之退染
造膠 1倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.2g的Agarose 1.5倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.3g的Agarose
1倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.4g的Agarose 1.5倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.6g的Agarose
1倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.2g的Agarose 1.5倍小塊膠：取20μl的0.5X TBE加入0.3g的Agarose
1倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.4g的Agarose 1.5倍大塊膠：取40μl的0.5X TBE加入0.6g的Agarose Load膠
加入4~5μl的PCR產物和1μl的dye 跑膠
下面至倒數第四格
放入EtBr 8秒(砍進DNA)染膠
拿起再放入RO水至少30分鐘使之退染
(八)抽 Plasmid(質體)
(九)電泳(快抽 DNA, PCR, 篩 clone)
(十)生物晶片測試
利用UV cross-linker 1J / 6~7分鐘
將抽出之plasmid送生技公司製成濃縮探針溶液 濃縮探針溶液一一定比例稀釋
將稀釋好之探針溶液藉由手動點片機，
置在點孔盤特定位置上以利點至晶片正確位置上
Post Wash
Hybridization
Blocking
Detection
加500μl的水靜置5分鐘，清洗2次，加入100μl之99.5％酒精清洗，立即 倒掉，放置在42℃小型烘箱5~10分鐘，烘乾
將PCR產物以94℃ 5分鐘進行denature(時間到要立即置於冰上)每格晶片加 入200μl hybridization buffer，取10μl target DNA 加入，並蓋上蓋子放置在
42℃小型烘箱進行雜合反應1小時，轉速調至最高速
倒掉液體，加入200μl wash buffer，停留約1分鐘後倒掉並壓乾，重複3次 製作blocking；200μl blocking buffer＋0.2μl strep-AP(有毒)震盪均勻
(vortex)約10~20秒，取加入晶片中(每格晶片)，靜置30分鐘
倒掉液體，加入200μl wash buffer，停留約1分鐘後倒掉並壓乾，重複3次 Detection呈色反應；196μl detection buffer＋4μl NBT/BCIP以手搖混勻，取 180μl加入晶片中(每格晶片)，置於暗室5~10分鐘，倒掉液體，用水清洗，置於
烘箱內烘乾即可室溫保存 (十)生物晶片測試
利用UV cross-linker 1J / 6~7分鐘
將抽出之plasmid送生技公司製成濃縮探針溶液 濃縮探針溶液一一定比例稀釋
將稀釋好之探針溶液藉由手動點片機，
置在點孔盤特定位置上以利點至晶片正確位置上
Post Wash
Hybridization
Blocking
Detection
加500μl的水靜置5分鐘，清洗2次，加入100μl之99.5％酒精清洗，立即 倒掉，放置在42℃小型烘箱5~10分鐘，烘乾
將PCR產物以94℃ 5分鐘進行denature(時間到要立即置於冰上)每格晶片加 入200μl hybridization buffer，取10μl target DNA 加入，並蓋上蓋子放置在
42℃小型烘箱進行雜合反應1小時，轉速調至最高速
倒掉液體，加入200μl wash buffer，停留約1分鐘後倒掉並壓乾，重複3次 製作blocking；200μl blocking buffer＋0.2μl strep-AP(有毒)震盪均勻
(vortex)約10~20秒，取加入晶片中(每格晶片)，靜置30分鐘
倒掉液體，加入200μl wash buffer，停留約1分鐘後倒掉並壓乾，重複3次 Detection呈色反應；196μl detection buffer＋4μl NBT/BCIP以手搖混勻，取 180μl加入晶片中(每格晶片)，置於暗室5~10分鐘，倒掉液體，用水清洗，置於
烘箱內烘乾即可室溫保存
利用UV cross-linker 1J / 6~7分鐘
將抽出之plasmid送生技公司製成濃縮探針溶液 濃縮探針溶液一一定比例稀釋
將稀釋好之探針溶液藉由手動點片機，
置在點孔盤特定位置上以利點至晶片正確位置上
Post Wash
Hybridization
Blocking
Detection
加500μl的水靜置5分鐘，清洗2次，加入100μl之99.5％酒精清洗，立即 倒掉，放置在42℃小型烘箱5~10分鐘，烘乾
將PCR產物以94℃ 5分鐘進行denature(時間到要立即置於冰上)每格晶片加 入200μl hybridization buffer，取10μl target DNA 加入，並蓋上蓋子放置在
42℃小型烘箱進行雜合反應1小時，轉速調至最高速
倒掉液體，加入200μl wash buffer，停留約1分鐘後倒掉並壓乾，重複3次 製作blocking；200μl blocking buffer＋0.2μl strep-AP(有毒)震盪均勻
(vortex)約10~20秒，取加入晶片中(每格晶片)，靜置30分鐘
倒掉液體，加入200μl wash buffer，停留約1分鐘後倒掉並壓乾，重複3次 Detection呈色反應；196μl detection buffer＋4μl NBT/BCIP以手搖混勻，取 180μl加入晶片中(每格晶片)，置於暗室5~10分鐘，倒掉液體，用水清洗，置於
烘箱內烘乾即可室溫保存
(十)生物晶片測試
伍、研究結果
一、定序
在選定完這五種台灣常見的鍬形蟲後，先進一步確定其親緣關係，並分析五種間的差異度，
因為當親緣太過接近時，不容易從中找出種間之特異片段。
(表一) Identity Table (℅)
COI-Cm COI-Dt COI-Os COI-Pa COI-Rc COI-Cm 82 82 82 84
COI-Dt 83 81 84
COI-Os 82 85
COI-Pa 84
COI-Rc
由表一得知此五種鍬形蟲分屬五個不同屬，因此利用序列比對分析其序列相似度，發 現種與種之間的相似度為 82~85％，而同種間的相似度高達 98~99％，相較下相似度並 不高，所以較容易從中選取具種專一性之探針序列。
確定這五種蟲的親緣關係後，再依照實驗一的步驟進行，將抽到每隻蟲之質體 DNA 送到 源資生物科技公司定序，解序後利用軟體 Vector NTI®7.0（Invitrogen, Carlsbad, CA USA）進行 序列分析，利用此軟體進行序列比對後，分別設計具專一性之探針序列，此外，所設計之探 針序列不可太長，序列太長較容易在進行雜合反應時會有較多非專一性的雜合
（cross-hybridization）而影響結果之判讀；探針序列 GC％的高低與晶片雜合反應之最適溫度 範圍息息相關，溫度越高時條件越嚴苛，相對可以將一些非專一性的結合去除以提高雜合專 一性，但當 GC％太高時容易產生非專一性結合反應，因此最適探針的設計標準為 40~50％的 GC%與 16~25 bp。最後將選定的探針序列送至源資國際生物科技股份有限公司合成探針溶液。
二、生物晶片製作及檢測
將所合成之探針原液依特定比例稀釋後，開始進行實驗二，初步先針對五種鍬形蟲 COI 所設計之探針的篩選，即每種蟲均設計五個以上的探針序列，再經由生物晶片測試後，從中 選取最具種專一的四個探針做為本實驗中最終之檢驗探針序列。
實驗過程中發現，如果雜合反應溫度為 43℃時，對於所設計之某些探針而言溫度偏高，
導致所呈色的色斑較淡，於結果判別上較難以清楚判定；以下結果為 43℃雜合反應所呈現的 晶片圖：
Rc
Os Dt
Cm Pa
Vp1 Vp1
InC1 InC2
Rc
Os
Cm Pa Dt
Rc
Os
Cm Pa
Vp1 Vp1
InC1 InC2
Dt
(圖三)卡通示意圖
(圖四)扁鍬形蟲(Dorcus titanus sika) (圖五)鬼艷鍬形蟲(
Odontolabis siva parryi
)
(圖六)鹿角鍬形蟲(
Rhaetulus crenatus crenatus
) (圖七)雞冠細身鍬形蟲(Cyclommatus mniszechi
)
(圖八)兩點鋸鍬形蟲(
Prosopocoilus astacoides blanchardi
) (圖九)Negative control以下是本實驗 42℃的晶片呈現圖：
(圖十)扁鍬形蟲(Dorcus titanus sika) (圖十一)鬼艷鍬形蟲(
Odontolabis siva parryi
)
(圖十二)鹿角鍬形蟲(
Rhaetulus crenatus crenatus
) (圖十三)雞冠細身鍬形蟲 (Cyclommatus mniszechi
)
(圖十四)兩點鋸鍬形蟲(
Prosopocoilus astacoides blanchardi
) (圖十五)Negative control觀察上述實驗結果，發現最適合之雜合溫度為 42℃，因為 Negative control 的結果顯示，
此兩個溫度對其晶片上點的呈現無明顯差異，所以與晶片本身無關，而是與 DNA 結合時的溫 度高低有關。利用原始選殖 COI 序列之質體 DNA（plasmid）、不同種或同種不同個體之樣本 對於此套生物晶片進行大量測試，以確保此套生物晶片系統確實具有高專一性、高靈敏度與 高穩定性之特性。由上圖顯示之結果，如果使用這套生物晶片檢測鍬形蟲，只要是上述所列 之五種，都會呈現在特定位置，而最上方角落兩點是 vp1，目的則為確保進行雜合反應時無 誤，另外下方兩點則為 Positive control，即萃取 DNA 與 PCR 的過程沒有問題，如無出現，則 表示沒有萃取到 DNA 或是進行 PCR 時有問題，倘若只出現這四點，而無其他點，則表示檢 測的蟲體不是上述五種，藉此精準的辨認蟲體。
陸、討論
本實驗選用五種鍬形蟲之粒線體細胞色素氧化酶 I 之 670~1280 序列段，因為粒線體為母 系遺傳，其變異速度較慢，另外由於 COI 基因之保守性引子已在各目昆蟲取得，可複製多數 昆蟲之五端，此外，COI 目前已廣泛被運用，因此相關資訊之取得也較多較為容易，以下是 我們所選定的 DNA 序列段：
COI/Rc1 GGAGGAGGAG ATCCTATTTT ATACCAACAC CTATTTTGAT TCTTCGGACA TCCAGAAGTA TATATTCTAA TTCTACCTGG COI/Cm1 -....G.... ....A... ...T T... .T..T..T.. ...T... ...T... .CT....A..
COI/Dt2 ..T... .C..A... ...G..T ..T..C.... ...C.. ...T ...T... ....T..A..
COI/Os2 -.T..G.... ....A...C. ...T... T... ...C.. ... ..C...T. .CT....A..
COI/Pa1 ...G.... .C..A...C. ... T... ....T..T.. C..T... ..C...T... ....C..G..
COI/Rc1 ATTTGGAATA ATCTCCCATA TCATCAGACA AGAAAGAAGA AAAAAGGAAA CCTTTGGAAC TCTAGGAATA ATTTATGCTA COI/Cm1 ... ..T... .T...T.C.. G...G ...A.... .A... C..T... ...
COI/Dt2 ... ... .T..T..G.. ... ... ... ...G... ...C....
COI/Os2 ...G... ..T..A.... .T..T... ... ... .A... .T... ...A.
COI/Pa1 ...C... ..T..T.... ....T..T.. ... ... .A..C..G.. G... ..C...
COI/Rc1 TAATAGCAAT TGGCCTTCTA GGATTTATCG TATGAGCTCA CCACATATTT ACTGTTGGAA TAGATGTTGA CACTCGAGCC COI/Cm1 ....G..C.. ...A...T ...C..T. ... T..T... ...A.... ... T...T COI/Dt2 ... ...AT.AT.. ... ...C.. T..T...C ... ... T...
COI/Os2 ....G... ...TT.A... ..C...T. .C...C.. ... ..A..A.... ... ...
COI/Pa1 ... ...T..C..T ..T..C..T. .C... ... ...C..G. ... T...
COI/Rc1 TATTTCACTT CAGCTACCAT AATCATTGCT GTTCCCACAG GAATTAAAAT TTTCAGTTGA CTAGCGACTC TCCATGGTAC COI/Cm1 ... ....A..A.. ... ..A..T.... ... ...T..C... T...TA..AA .A...A..
COI/Dt2 ..C...A. ...T.. ...C ...T..C. ....C..G.. ...T..C... T....C..C. ...A..
COI/Os2 ... ....C..A.. ...T... ...A.... ... ...T..A..G ..T..A..C. .A...A..
COI/Pa1 ..C..T..A. ....A..T.. ...T... ...T..G. ... ...T..C... ..C..C.... .T...A..
COI/Rc1 ACAAATAAAC TACTCCCCAT CAATACTTTG AGCTCTAGGA TTTGTATTCT TGTTTACTGT AGGAGGATTA ACAGGTGTTG COI/Cm1 T...T ..T..T..T. ... ...C..T..C ...T.... .A...A.. T..T...C.T ...A..AA COI/Dt2 T...T... ...T..C. .C..T..C.. ...CT.G... ...C .T...A.. ...G... ...A..C.
COI/Os2 T...C..T .T...A.... ...A.. ...A... ... ...A.. ... ..T..A....
COI/Pa1 C..G..C... ..T..A.... ...A.. G..C... ...G..TC .A..C... G...C.C ...
COI/Rc1 TTCTCGCAAA TTCATCTATC GACATTGTTC TTCATGACAC TTATTATGTT GTAGCTCATT TCCACTATGT TCTTTCCATA COI/Cm1 .C..A..T.. ...C..G..T ..T...A... ...T.. ...C... ..T... ....T... .T.A..T...
COI/Dt2 .AT.A..T.. C..C..A..T ..T... ....C..T.. C..C... ..T...C. .T..T..C.. .T.A..A...
COI/Os2 ..T.A... C..G..A..T ..T...A..T .A... ... ...C.... ....T..C.. .T.A..T...
COI/Pa1 ....T..T.. ...A..T ..T..C..C. .A... A..C..C..C ...A..C. ... ...G..G...
COI/Rc1 GGGGCAGTCT TTGCTATTAT AGCAGGATTT GTTCATTGAT TCCCCCTATT TACAGATCTT TCACTTAATA ACAAATTCTT COI/Cm1 ..A... ... ..GC... ... ....AT.... ...GA... ...T.G.... .T...
COI/Dt2 ..A..T..A. ... ...T... ... .T...T.. ...G.... A.C... .T...C.TC.
COI/Os2 ..A..T..A. ....A... ..G... ... .T...T.. C..G.G.T.A A...C. ...C.
COI/Pa1 ...C..A. ... ...T... ... ... C..T.GAA.. ..C...C. .T...
COI/Rc1 AAAAATTCAG TTCCTAATTA TATTTATTGG TGTAAATATA ACCTTTTTCC CTCAACATTT CTTAGGG COI/Cm1 ...A ...A... ...G.... ...C... ..G... .A...C.. ...A COI/Dt2 G...G....A ...G.A. ....CC.C.. G... ...C.... ...C.. ...
COI/Os2 G...A ..TAC.G.A. ...G.... A... ...C.... ...C.. T...A COI/Pa1 ...A ...G.A. ... G...C... ...C.... .A...C.. ...
(圖十六)我們以這些序列段為基礎，以這些序列段中變異較大的地方作為設計探針。
此實驗所完成之生物晶片是以簡單的操作、快速的結果及準確的鑑定為出發點，對於保 育人員進行野外調查及保育，能有及時性的回應，讓他們可以快速的了解出當地的環境中棲 息著什麼樣的幼蟲及他們的數量，利用晶片檢測的話，一天之內就可以得到結果，而利用形 態鑑定的話，要等到卵發育成三齡幼蟲，至少需要 1~2 個月的時間，對於想要新增調查之物 種也可待其探針設計完畢之後即可加入原先已有的晶片檢測系統中，不需再嘗試另外不同專 一性 PCR 引子檢測，如此一來，反而會耗費更多時間，簡單而言，生物晶片具有可經由一次 的反應即可獲得大量生物訊息的潛力；不同於以往形態鑑定需要大量經驗及知識，就能達到 相同的效果，也可作為輔助形態鑑定的工具，作為區分不明雌蟲或幼蟲是一大利器。
然而生物晶片需要大量耗材與特定儀器，但利用生物晶片來檢測，不僅可以準確的測出 種類，也可大幅的縮短檢測時間，時間就是金錢，利用這些多出來的時間，可以做提早為這 個種類的鍬形蟲進行生態維護和保育，也可更詳細的紀錄這些確定種類的鍬形蟲的生長過 程，讓大家對於鍬形蟲有更多且更正確的了解。就目前來說，台灣對於鍬形蟲的生物晶片並 沒有很深入的開發，而本小組這次的實驗是以五種台灣鍬形蟲為討論基準，就準確度來分析，
這套完成的生物晶片經由多次測試後，只要親緣關係不要過於接近，都有穩定且合乎預期的 結果，因為是利用 DNA 作為鑑定的依據，所以相對於形態鑑定，對於一些外部形態較為接 近不易區分的種類，可以減少更多誤差，當然，未來繼續針對更多種鍬形蟲做為研究，此套 生物晶片的準確度就會因為更加細微的分類、更加多元的設計而相對提升。
柒、結論
本小組經由實驗一及實驗二完成一套可以鑑定出五種，包括台灣扁鍬形蟲(Dorcus titanus
sika)、鬼艷鍬形蟲( Odontolabis siva parryi)、兩點鋸鍬形蟲(Prosopocoilus astacoides blanchardi
)、
鹿角鍬形蟲(
Rhaetulus crenatus crenatus
)及雞冠細身鍬形蟲(Cyclommatus mniszechi
)的生物晶 片。對於鍬形蟲生物晶片未來的展望，近程目標，希望能夠先把台灣所有 54 種的鍬形蟲的晶 片探針都設計出來，尤其是那些即將變成保育類的種類，趁還有多餘的蟲體可以供實驗室研 究探針前設計出來，至於遠程目標，則是把腳步伸向國際，讓鍬形蟲生物晶片能夠有更進一 步的發展，對於傳統的形態鑑定，始終都保有認同感，而生物晶片系統的完整，無非是建立 在形態鑑定的基礎之上，而這套系統，也可輔助形態鑑定，讓鑑識的結果更為準確；而成本 方面，一個剛剛開始進行的研究，總是會投注比較高的成本在其中，隨著這套晶片系統的完 整後，即可慢慢的藉由量化生產等方法讓成本降到合理的範圍之內，讓生物晶片系統的成效 遠遠超過成本。捌、參考資料及其他
一、劉玉成(民 95)。台灣 132 種甲蟲圖鑑。臺北市 : 社團法人北市野鳥學會。
二、張永仁(民 87)。昆蟲入門。臺北市 : 遠流。
三、張永仁(民 87)。昆蟲圖鑑。臺北市 : 遠流。
四、張永仁(民 90)。昆蟲圖鑑 2。臺北市 : 遠流。
五、張永仁(民 95)。鍬形蟲 54。臺北市 : 遠流。
六、盧耽(民 97)。圖解昆蟲學。臺北市 : 商周。
七、吉田 賢治(民 91)。飼育鍬形蟲及獨角仙的獨家秘方。台北市 : 商鼎文化出版社。
八、水沼哲郎・永井信二(1994)。世界のクワガタムシ大図鑑。むし社。
九、廖智安(民 88)。台灣昆蟲記。台北市：大樹文化出版社。
十、陳嬿后(民 96)。開發以生物晶片系統快速檢驗與鑑定四種果實蠅之方法(13-36 頁)。國立 中興大學昆蟲系碩士論文，未出版，台中市。
十一、李奇峰(民 97)。植物重要防疫檢疫害蟲診斷鑑定研習會專刊(八)，1。
十二、路光暉(民 93)。植物重要防疫檢疫害蟲診斷鑑定研習會專刊(四)，119。
十三、Wang, L. C., C. H. Pan, L. L. Severinghaus, L. Y. Liu, C. T. Chen, C. E. Pu, D. Huang, J. T. Lir, S.
C. Chin, M. C. Cheng, S. H. Lee and C. H. Wang.( 2008). Simultaneous detection and differentiation of Newcastle disease and avian influenza viruses using oligonucleotide microarrays. Vet. Microbiol. 127:
217-226.
