開發以植物葉綠体做為生物反應器-以生產可食性肝炎疫苗(1/3)

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(1)行政院國家科學委員會專題研究計畫期中進度報告. 開發以植物葉綠体做為生物反應器-以生產可食性肝炎疫苗 (1/3). 計畫類別：個別型計畫計畫編號： NSC91-2311-B-006-007執行期間： 91 年 08 月 01 日至 92 年 07 月 31 日執行單位：國立成功大學生物科技研究所. 計畫主持人：張清俊. 報告類型：精簡報告處理方式：本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢. 中. 華民. 國 92 年 5 月 29 日.

(2) 計畫名稱：開發以植物葉綠体做為生物反應器-以生產可食性肝炎疫苗計畫編號: NSC91-2311-B-006-007 執行期限: 九十一年八月一日至九十二年七月三十一日主持人姓名：張清俊. 執行機構：國立成功大學生物科技研究所. 一、中文摘要: 為建立以植物葉綠體做為生物反 Keywords: chloroplast, tobacco, 應器,生產可食性肝炎疫苗。首先以煙 transformation 草做為研究的模式植物,並已構築含有 B 型肝炎病毒表面抗原基因的葉綠體表二、緣由與目的: 用轉殖植物做為生物反應器來生產現載體。並用基因槍打入煙草葉片組織外源蛋白質,以增進人類福祉，其有許中,經過轉殖的葉片,正使用含有抗生多的優點,諸如:不需要購置昂貴的醱素 spectinomycin 的 RMOP 培養基在進酵設備及雇用維修人員，用大面積栽培行篩選之中。方式, 因此生產成本可望大幅降低。此關鍵詞: 植物葉綠體、煙草、基因轉殖外, 可以將標的物有選擇性地表達於植物的特定組織部位或儲存器官。而且, 在很多的用途上不必需經過純化之步 Abstract 驟,就可以經由直接添加或食用而達到 In order to establish the chloroplast 目的, 而無需擔心微生物毒素或動物 transformation technology to 病毒污染之問題。是故,應用植物生物 overexpress hepatitis B surface antigen 科技以植物做為生物反應器來生產高 in chloroplasts serve as the source of 附加價值的農、工業及醫藥產品已成為 plant edible vaccine for the human 發展之趨勢 (1,5,6,7)。而將外來基因 consumption to induce oral immunity against hepatitis B infection. At first, we 嵌入細胞核來做轉殖的方式是常見且成熟的技術, 然而進行細胞核的轉殖, used tobacco as a model plant for 常有生物安全性問題的考量及基因表 research. We had constructed the 現穩定性的問題。相對而言,雖然葉綠 chloroplast expression system 体的基因轉殖技術仍未普及,但是把外 containing the gene of HBV major 源基因表達於植物的葉綠体具有許多 surface antigen. By using biolistic 優點(2,3,4)如:可以達到很高的表現 bombardment, we had transformed the 量,通常可比用細胞核的轉殖方法高數 expression construct into tobacco leaf 十至數百倍,並且尤於葉綠体通常是母 explants. The transformants are 系遺傳,可以避免經由花粉傳播進而對 currently under selection in a RMOP 生態環境造成危害之虞。另外,沒有基 medium with spectinomycin (500 因表現沉默或因基因嵌入核染色体位 μg/ml). 2.

(3) 置之不同,所造成的表現岐異之現像。離 9 公分的條件下,以基因槍此外,基因体的結構類似原核生物的基 PDS-1000/He 系統(借用臺糖研究所), 因表現系統,所以可以用單一的啟動子傳送至植物葉片組織。放在 RMOP 培養來表達多個基因。還有,外源基因嵌入基黑暗狀況下三天後,將葉片切成小塊, 葉綠体基因体的方式,主要經由相似性並放於含有 spectinomycin(500μg/ml) 重組的過程,因此,可以很精確地取代的 RMOP 培養基中進行篩選。未轉殖成基因和控制基因的表現。最後,表達出功的葉片組織將逐漸白化、褐化而死亡, 來的蛋白質因為和細胞質隔離,可以避而轉殖成功的細胞,將分裂、生長而呈免任何對細胞質的不良影響。現綠色的組織(如下圖)。結至目前為止, 本研究計劃將建立葉綠体的轉殖仍在持續進行篩選之中。技術,來做為植物生物反應器之系統, 先用菸草為模式植物,再擴及其他可食性作物如:蕃茄,初期以生產 B 型肝炎病毒表面抗原以做為可食性的肝炎疫苗為目標,以協助解決台灣人常見的健康綠色代表對spectinomycin具抗性的煙草轉殖問題。更進一步將擴及其它高附加價值組織之蛋白質。成功地建立此一生產系統, 四、成果自評: 將可做為與其它植物生物反應器互補合乎執行進度,由於葉綠體基因轉之用。殖需較長時間的篩選,經轉殖的煙草葉片,目前仍在進行抗生素篩選之階段三、結果與討論: 中。 A.構築葉綠體的基因表現系統: 使用來自陽明大學羅時成老師實驗室, 帶有 B 型肝炎病毒表面抗原的基因 (pMTLS 質體),將主耍表面抗原(major surface antigen)基因以 PCR 放大,經定序確定無誤後,轉入葉綠體的基因表現載體(PNIC-101;中興大學陳良築老師提供), 構築完成後命名為 pNIC-HBV。同時,為評估葉綠體的基因轉殖效率,用來自 pCambia1305.1 的報導基因 β-glucuronidase (GUS)基因, 以 PCR 放大後,轉入葉綠體的基因表現載體, 構築完成後命名為 pNIC-GUS。 B.進行葉綠體的基因轉殖與篩選: 使用二種不同大小的鎢粒子(0.7 μm 及 0.4 μm)做為 micorcarrier,將 pNIC-HBV 與 pNIC-GUS 在 1100 psi,距. 五、參考文獻: 1. Austin, S., Bingham, E. T., Koegel, R. G., Mathews, D. E., Shahan, M. N., Straub, R. J. & Burgess, R. R. (1994). Ann N Y Acad Sci 721, 234-44. 2. Bogorad, L. (2000). Trends Biotechnol 18(6): 257-63. 3. Hager, M. and R. Bock (2000). Appl Microbiol Biotechnol 54(3): 302-10. 4. Heifetz, P. B. (2000). Biochimie 82(6-7): 655-66. 5. Hood. Elizabeth E. (1997). Molecular Breeding 3,291-306. 6. Jones, B. A. (1995) Crop Science 35: 537-541 7. Khoudi, H., Laberge, S., Ferullo, J. M., 3.

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